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络风宁0号方对体外培养的人冠状动脉平滑肌细胞和内皮细胞生长的影响
目的：探讨络风宁0号方不同配比对体外培养的人冠状动脉平滑肌细胞（ HCASMC）和内皮细胞（ HCAEC）生长的影响及剂量依赖关系，明确中药复合物抗再狭窄的有效性和可行性，为中药药物涂层支架的研发提供实验数据支持。方法用体外培养的HCASMC和HCAEC 3~5代，加入96孔细胞培养板，选择抑制HCASMC生长，而对HCAEC无抑制作用的浓度范围（0.2~3.13 mg/ml）作为佳的水蛭素浓度与1μmol/L紫杉醇组成复合物干预两种细胞，培养48 h后用噻唑蓝比色试验（ MTT法）测定各孔吸光值（ A值），选择对HCASMC抑制程度大，而对HCAEC抑制程度小且与单用紫杉醇比较能大程度减轻对HCAEC抑制作用的浓度作为络风宁0号方的佳配比。结果在对HCAEC增殖的影响方面，复合药物组与单药紫杉醇组比较，差异无统计学意义（ P﹥0.05），而对HCASMC的抑制率明显高于单药紫杉醇组（ P﹤0.05），且1μmol/L紫杉醇＋0.39 mg/ml水蛭素组可明显降低单药紫杉醇对HCAEC的抑制率。结论选择1μmol/L紫杉醇＋0.39 mg/ml水蛭素作为络风宁0号方的佳配比，可大限度抑制HCASMC增殖的同时对HCAEC有小的抑制作用，具备抗再狭窄的有效性和可行性，为新型中药药物涂层支架的研发提供新的思路。
关键词： 络风宁0号方 紫杉醇 水蛭素 人冠状动脉平滑肌细胞 人冠状动脉内皮细胞 -
水蛭素对体外培养的人冠状动脉平滑肌细胞和内皮细胞生长的影响
目的：探讨水蛭素对体外培养的人冠状动脉平滑肌细胞（HCASMC）和人冠状动脉内皮细胞（HCAEC）生长的影响及剂量依赖关系，明确水蛭素抗再狭窄的有效性和可行性。方法用体外培养的HCASMC和HCAEC 3~5代，加入96孔细胞培养板，设置调零孔、对照孔、加药孔（6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.2、0.1、0.05、0.025 mg/ml不同浓度水蛭素共9组，每组6个复孔），培养48 h后用噻唑蓝比色试验（MTT法）检测不同浓度水蛭素干预下两种细胞的活力和抑制率变化。结果与对照组相比，低浓度（0.025～0.1 mg/ml）水蛭素在对HCASMC增殖的影响方面无统计学差异（P均＞0.05），而中高浓度（0.2～6.25 mg/ml）的水蛭素抑制HCASMC增殖，差异有统计学意义（P均＜0.05），且其抑制率随水蛭素浓度升高而增加。与对照组相比，0.025～3.13 mg/ml的水蛭素在对HCAEC增殖的影响差异无统计学意义（P均＞0.05），但0.05～0.2 mg/ml的水蛭素对HCAEC有一定的促增殖作用；而高浓度（6.25 mg/ml）的水蛭素对HCAEC增殖的抑制增加，差异有统计学意义（P均＜0.05），其抑制率达到44.6%。结论中高浓度水蛭素可呈剂量依赖性抑制HCASMC的生长，低中浓度水蛭素对HCAEC无明显抑制作用，且能在抗血栓的同时保护HCAEC甚至促进HCAEC生长。
关键词： 水蛭素 人冠状动脉平滑肌细胞 人冠状动脉内皮细胞 抑制率 -
内源性一氧化氮介导脂质胞壁酸预适应对人冠脉内皮细胞再复氧损伤的作用
目的探讨脂质胞壁酸(LTA)诱导的延迟预适应对内皮细胞再复氧(H/R)损伤的作用,以及内源性一氧化氮(NO)参与保护机制作用.方法采用培养的人冠状动脉内皮细胞(HCAEs)在缺氧条件下培养2h,然后在常氧条件下复氧培养4h,模拟缺血/再灌注损伤的模型.HCAEs在缺氧前24h预先在含LTA(30或300μg·L-1)的培养中培养4h.用台盼蓝排斥法和培养基中乳酸脱氢酶(LDH)含量来评价内皮细胞损伤程度,比色法检测培养基中一氧化氮(NO)含量.并用RT-PCR检测LTA预适应后(2-24)h HCAECs eNOS mRNA的表达.结果LTA预适应能显著减少台盼蓝排斥实验中的细胞死亡百分比,降低复氧末细胞培养液中LDH的含量.LTA预适应亦能显著增加HCAECs复氧末培养液中NO含量.LTA预适应的效应可被非选择性NOS抑制剂--L-单甲基精氨酸(L-NMMA,100μmol·L-1)所取消.在LTA预适应后2和4 h,HCAECs的eNOS mRNA表达明显增加.结论LTA诱导的延迟预适应能显著减少HCAECs再复氧所致的细胞损伤和功能紊乱,eNOS产生的NO启动并介导了LTA保护内皮细胞的作用.
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TNF-α对人冠状动脉内皮细胞中的NF-kB mRNA表达的影响
目的:探讨TNF-α对HCAEC的NF-kB mRNA的影响,探讨人冠状动脉内皮细胞内的炎症过程的分子机制.方法:采用人冠状动脉内皮细胞培养传代后作为实验对象,随机分为空白组和诱导组,分2 h、6 h、10 h三个时间点,每个时间点以2.5μg/L、5μg/L、10μg/L的浓度刺激HCAEC后,提取细胞RNA并逆转录,用RT-qPCR法检测NF-kB mRNA的转录水平.结果:TNF-α可抑制HCAEC的NF-kB mRNA转录水平(P<0.05).其中NF-kB 5μg/L,2 h、10μg/L,2 h、10μg/L,6 h诱导组mRNA含量较正常对照组有显著差异(P<0.05).且NF-kB mRNA的浓度变化与TNF-α的刺激浓度和时间有一定的趋势规律.结论:TNF-ɑ在一定时间范围内对HCAEC μg/L的mRNA的转录和蛋白质的表达水平具有抑制作用.
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IL-27增强TNF-α介导上调的炎症因子的表达
目的:动脉粥样硬化是慢性炎症疾病,免疫细胞及炎症因子在其发病过程中起重要调节作用.本研究在于探讨IL-27对血管内皮细胞的直接作用.方法:采用ELISA方法,研究IL-27和TNF-α对人冠状动脉内皮细胞产生炎症相关细胞因子和趋化因子的作用.结果:IL-27显著增强TNF-α介导上调的炎症相关细胞因子IL-6和趋化因子CCL5的表达.IL-6和CCL5的表达受特异性信号分子抑制剂显著抑制.结论:人冠状动脉内皮细胞诱导释放IL-6和CCL5可能受JNK,p38MAPK和NF-κB通路差异调控.这些结果为阐明IL-27与TNF-α.在动脉粥样硬化血管炎症发生中的作用提供重要生物化学基础.
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三棱内酯B调控人冠状动脉内皮细胞基因表达谱的生物信息学分析
目的:分析三棱内酯B在人冠状动脉内皮细胞中的表达谱数据集,寻找三棱内酯B调控血管内皮功能的关键作用靶点.方法:基于GEO公共数据库,下载原始表达谱数据集(GSE44598),经过差异基因筛选,功能注释,通路富集,信号通路网络以及基因互作网络分析,找出三棱内酯B对人冠状动脉内皮细胞基因表达谱产生影响的关键基因和信号通路.结果:同对照组相比,三棱内酯B给药组共有5224个基因有显著性差异,包括2628个上调基因和2596个下调基因.基因功能注释和信号通路富集分析表明,差异基因主要参与了细胞周期过程.网络分析显示,MAPK信号通路、细胞周期通路以及PLCG2,PRKACA和ADCY4等为关键信号通路和基因.结论:三棱内酯B通过影响PLCG2,PRKACA,ADCY4等基因的表达,参与MAPK和细胞周期等信号通路,从而调节人冠状内皮细胞的功能.这些关键基因和信号通路是三棱内酯B在心血管疾病治疗应用中潜在的作用靶点.
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高糖抑制PI3K/AKT通路诱导人冠状动脉内皮细胞凋亡的研究
目的 探讨高糖对人冠状动脉内皮细胞凋亡及微颗粒释放的影响及机制.方法 根据细胞培养基中葡萄糖浓度不同分为3组:正常对照组(5.5 mmol/L),中糖组(17.6 mmol/L),高糖组(33.3 mmol/L),另设甘露醇对照组(20.0 mmol/L).通过Hoechst 33258荧光染色观察凋亡形态学变化,应用流式细胞术检测内皮微颗粒细胞凋亡率及微颗粒,ELISA法检测人冠状动脉内皮细胞的凋亡相关蛋白Bad、Bax的表达以及PI3K、p-Akt蛋白的表达.结果 随着葡萄糖浓度增加,人冠状动脉内皮细胞微颗粒的释放及细胞凋亡率逐渐增加,高糖组高(P＜0.01);人冠状动脉内皮细胞分泌Bad、Bax逐渐增多,高糖组高(P＜0.01);人冠状动脉内皮细胞分泌PI3K、p-Akt逐渐减少,高糖组减少明显(P＜0.01).与甘露醇对照组比较,正常对照组微颗粒的释放,细胞凋亡率,分泌Bad、Bax、PI3K、p-Akt差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 高糖可以促进人冠状动脉内皮细胞凋亡及微颗粒的释放,其机制可能同PI3K/AKT途径相关.
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氨氯地平和缬沙坦对人冠状动脉内皮细胞NADPH氧化酶亚基gp91phox和p22phox表达的影响
目的 研究不同浓度的氨氯地平和缬沙坦对人冠状动脉内皮细胞(HCAEC)内尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶亚基gp91phox和p22phox的影响.方法 对照组:体外贴壁培养HCAEC,不进行其他干预;实验组:相同培养条件下分别加入不同浓度氨氯地平(1 ×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8、1×10-9 mol/L)和不同浓度缬沙坦(1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8mol/L)体外培养24h.提取各组细胞的膜蛋白,应用Western blot法测两组细胞中p22phox和gp91phox的表达水平,对结果进行统计分析并比较.结果 不同浓度氨氯地平对HCAEC内NADPH氧化酶亚基p22phox表达均有促进作用(P＜0.05),高浓度氨氯地平对gp91 phox有抑制作用(P＜0.05),低浓度则会促进gp91phox的表达(P＜0.05).不同浓度缬沙坦对p22phox与gp91phox的表达均有显著的抑制作用(P＜0.05),且有随着药物浓度增高抑制作用增强的趋势(P＜0.05).结论 缬沙坦有抑制氧化应激的效力,并随浓度增高而增强,呈现浓度依赖的趋势;氨氯地平仅在高浓度时抑制部分NADPH氧化酶亚基(gp91phox)的表达,低浓度时反而可能增加氧化应激水平.
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慢性间断缺氧时sCD40L对人冠状动脉内皮细胞的损伤作用及机制
目的 探讨慢性间断缺氧(CIH)时重组可溶性人CD40L(sCD40L)对人冠状动脉内皮细胞(HCAEC)的损伤作用及机制.方法 予以sCD40L孵育HCAEC,同时CIH刺激,应用蛋白印迹法(Western Blot)和流式细胞仪检测各项炎症因子.研究CIH时sCD40L对HCAEC的损伤作用及机制.结果 单纯外源性sCD40L刺激HCAEC上调转录因子(NF-κB)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)蛋白的表达(P＜0.05),对缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、环氧合酶-2(COX-2)蛋白表达无明显影响(P＞0.05);在CIH条件下,外源性sCD40L刺激HCAEC均上调HIF-1α、COX-2、NF-κB、ICAM-1蛋白的表达(P＜0.05),细胞凋亡加重(P＜0.05).结论 在CIH条件下,外源性sCD40L刺激HCAEC促进炎症因子释放,细胞凋亡加重,从而可能加速HCAEC功能障碍.
关键词： 重组可溶性人CD40L 慢性间断缺氧 内皮功能障碍 人冠状动脉内皮细胞 -
法舒地尔联合罗格列酮对脂多糖诱导人冠状动脉内皮细胞MCP-1和VCAM-1表达的影响
目的 观察法舒地尔联合罗格列酮对脂多糖(LPS)诱导的人冠状动脉(冠脉)内皮细胞(HCAEC)血管细胞黏附因子1(VCAM-1)、单核细胞趋化因子1(MCP-1)表达的影响.方法 选用体外培养的第3～5代HECAC进行实验,将细胞分为空白对照组、LPS组(100 ng/mL LPS作用细胞)、法舒地尔组(10 nmo1/L法舒地尔作用细胞)、罗格列酮组(10 μg/mL罗格列酮作用细胞)、LPS+法舒地尔组(先予10 nmol/L的法舒地尔干预细胞2h后再给予100 ng/mL LPS共同干预22h)、LPS+法舒地尔+罗格列酮组(先予10 nmol/L的法舒地尔和10μg/mL罗格列酮干预细胞2h后再给予浓度为100 ng/mL LPS共同干预22 h),实时荧光定量PCR检测各组细胞VCAM-1、MCP-1 mRNA,ELISA法检测细胞上清液中可溶性VCAM-1、MCP-1蛋白.结果 与空白对照组相比,IPS组细胞VCAM-1、MCP-1 mRNA及上清液VCAM-1、MCP-1蛋白表达高(P均＜0.05).与LPS组相比,LPS+法舒地尔组细胞VCAM-1、MCP-1 mRNA及上清液VCAM-1、MCP-1蛋白表达低(P均＜0.05).与LPS+法舒地尔组相比,LPS+法舒地尔+罗格列酮组细胞VCAM-1、MCP-1 mRNA及上清液VCAM-1、MCP-1蛋白表达低(P均＜0.05).结论 法舒地尔联合罗格列酮可协同抑制LPS诱导的HCAEC中VCAM-1、MCP-1的表达,可能与两者共同抑制p38MAPK、NF-κB信号通路有关.
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纳米银对人冠状动脉内皮细胞凋亡的影响及其机制
目的 探讨纳米银对人冠状动脉内皮细胞(HCAEC)凋亡的影响及其可能的机制.方法 取生长状态良好并处于对数生长期的HCAEC,分别加入浓度为0、2.5、5、10、20、40、80μg/mL的纳米银溶液,作用24h.采用MTT法检测HCAEC凋亡率,ELISA法检测培养液上清血红素氧合酶1(HO-1)、血小板内皮细胞黏附分子1(PECAM-1)表达,火焰原子吸收光谱法检测细胞内、外银含量.结果 加入2.5、5、10、20、40、80μg/mL纳米银溶液的HCAEC凋亡率分别为8.51％、21.03％、42.38％、64.62％、78.35％、74.83％.随着加入纳米银溶液浓度升高,HCAEC培养液上清HO-1表达逐渐升高,各浓度间比较P均＜0.05;加入40、80μg/mL纳米银溶液的HCAEC培养液上清HO-1表达比较P＞0.05.HCAEC加入10、20、40、80μg/mL纳米银溶液后细胞培养液上清PECAM-1表达均高于0、2.5、5μg/mL纳米银溶液,且加入40、80μg/mL纳米银溶液后PECAM-1表达升高更明显(P均＜0.05).加入2.5、5、10、20μg/mL纳米银溶液的HCAEC细胞内银含量低于细胞外(P均＜0.01),加入40、80 μg/mL纳米银溶液的HCAEC细胞内、外银含量比较差异均无统计学意义(P均＞0.05).结论 纳米银可促进HCAEC凋亡,其细胞毒性作用呈浓度依赖性;通过上调HO-1、PECAM-1表达造成细胞损伤可能是其作用机制.
关键词： 纳米银 人冠状动脉内皮细胞 细胞凋亡 血红素氧合酶1 血小板内皮细胞黏附分子1 -
白细胞介素37对Toll样受体4激活人冠状动脉内皮细胞核因子κB和细胞间黏附分子1表达的影响
目的 探讨抗炎症因子白细胞介素37(IL-37)对人冠状动脉内皮细胞(HCAEC)中Toll样受体4(TLR4)激活后下游信号核因子κB(NF-κB)及细胞间黏附分子1(ICAM-1)表达的影响及机制.方法 将HCAEC培养3～5代后进行实验,分为3组:对照组、IL-37干扰组、IL-37过表达组.利用脂质体转染将IL-37干扰序列加入IL-37干扰组,IL-37 DNA过表达质粒加入IL-37过表达组;孵育24h后,用实时荧光定量PCR检测基因转染效率以确定转染成功.各组给予TLR4激活剂脂多糖(200 μg/L)进行干预.Western blot检测干预24h后ICAM-1蛋白的表达及干预30、60、120 min时磷酸化NF-κB蛋白的表达.结果 对照组在TLR4激活后ICAM-1蛋白表达升高,与之相比,IL-37干扰组在TLR4激活后ICAM-1蛋白明显升高(P＜0.05),但在IL-37过表达组中没有升高(P＞0.05).与对照组相比,IL-37干扰组TLR4激活后30、60、120 min各时间点磷酸化NF-κB的蛋白表达明显升高(P＜0.05),而IL-37过表达组磷酸化NF-κB蛋白表达并没有明显升高(P＞0.05).结论 IL-37可以抑制TLR4激活HCAEC中炎症因子ICAM-1的升高,其机制可能是通过抑制NF-κB磷酸化的程度.IL-37的抗炎作用可以防治动脉粥样硬化.
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抵抗素调节人冠状动脉内皮细胞MMP-9表达机制探讨
目的:探讨抵抗素调节冠状动脉内皮细胞中基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMP)-9的表达及其机制.方法:用含1％胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的DMEM/F12培养基培养人冠状动脉内皮细胞(human coronary artery endothelialcells,HCAECs) 16 h(血清饥饿培养),之后随机分为6组:(1)空白对照(Con)组:无抵抗素干预;(2) Res20组:抵抗素20 ng/ml干预;(3) Res40组:抵抗素40 ng/ml干预;(4)Res100组:抵抗素100 ng/ml干预;(5)Res40+U0126组:细胞中加入细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)抑制剂U0126 (20 mmol/L)预处理1h,再加入抵抗素40 ng/ml干预;(6)U0126组:细胞中仅加入ERK抑制剂U0126(20mmol/L),细胞各组干预24 h后,用RT-PCR法检测MMP-9和蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP)-1 mRNA表达,ELISA法检测MMP-9和TIMP-1蛋白水平,Western blot检测HCAECs p-ERK1/2及ERK1/2的蛋白表达.结果:3种浓度抵抗素干预HCAECs 24 h后,MMP-9 mRNA与蛋白水平均较空白组明显升高(P＜0.05);TIMP-1 mRNA与蛋白水平均较空白组明显降低(P＜0.05).40 ng/ml抵抗素干预组加入ERK抑制剂U0126后,MMP-9 mRNA与蛋白水平明显下降(P＜0.05),TIMP-1 mRNA与蛋白无明显变化.与Con组、U0126组及Res40+U0126组相比,Res40组p-ERK1/2蛋白表达明显增高(P＜0.05).结论:抵抗素可诱导HCAECs MMP-9的生成,可能通过下调TIMP-1的表达及激活ERK通路参与这一过程.
