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络风宁0号方对体外培养的人冠状动脉平滑肌细胞和内皮细胞生长的影响
目的：探讨络风宁0号方不同配比对体外培养的人冠状动脉平滑肌细胞（ HCASMC）和内皮细胞（ HCAEC）生长的影响及剂量依赖关系，明确中药复合物抗再狭窄的有效性和可行性，为中药药物涂层支架的研发提供实验数据支持。方法用体外培养的HCASMC和HCAEC 3~5代，加入96孔细胞培养板，选择抑制HCASMC生长，而对HCAEC无抑制作用的浓度范围（0.2~3.13 mg/ml）作为佳的水蛭素浓度与1μmol/L紫杉醇组成复合物干预两种细胞，培养48 h后用噻唑蓝比色试验（ MTT法）测定各孔吸光值（ A值），选择对HCASMC抑制程度大，而对HCAEC抑制程度小且与单用紫杉醇比较能大程度减轻对HCAEC抑制作用的浓度作为络风宁0号方的佳配比。结果在对HCAEC增殖的影响方面，复合药物组与单药紫杉醇组比较，差异无统计学意义（ P﹥0.05），而对HCASMC的抑制率明显高于单药紫杉醇组（ P﹤0.05），且1μmol/L紫杉醇＋0.39 mg/ml水蛭素组可明显降低单药紫杉醇对HCAEC的抑制率。结论选择1μmol/L紫杉醇＋0.39 mg/ml水蛭素作为络风宁0号方的佳配比，可大限度抑制HCASMC增殖的同时对HCAEC有小的抑制作用，具备抗再狭窄的有效性和可行性，为新型中药药物涂层支架的研发提供新的思路。
关键词： 络风宁0号方 紫杉醇 水蛭素 人冠状动脉平滑肌细胞 人冠状动脉内皮细胞 -
基于脂多糖诱导人冠状动脉平滑肌细胞炎性活化的热毒生风型络风内动细胞模型构建
目的:利用脂多糖(LPS)诱导体外培养的人冠状动脉平滑肌细胞(HCASMC) TLR4-MyD88炎性反应通路活化,建立热毒生风型络风内动细胞模型,为络风内动研究平台的科学化寻求新突破.方法:体外原代培养HCASMC,MTT法检测不同浓度(0、0.01、0.1、0.5、1、5、10、100μg/mL)LPS对HCASMC活力的影响,筛选出HCASMC活力在98％以上的LPS无毒性浓度范围.ELISA法检测无毒性浓度范围内LPS作用不同时间(6、24、48h)对细胞上清IL-6、TNF-α和IL-1β释放水平的影响,筛选出小范围LPS干预浓度和作用时间,RT-PCR法对IL-6、TNF-α、IL-1β、TLR4、MyD88、NF-κBp65 mRNA进行半定量检测,Western Blotting法检测TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表达变化,确定终造模条件.结果:LPS在5、10、100μg/mL浓度时细胞活力＜98％,其余浓度均可促进HCASMC生长;0.5、1μg/mL LPS干预24、48h都可显著诱导产生炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α(P＜0.05);1μg/mL LPS作用48h可大程度激活TLR4-MyD88炎性反应通路下游因子基因和蛋白表达(P＜0.05).结论:1μg/mL LPS干预HCASMC 48h可保证HCASMC处于持续的高炎性活化状态,可作为热毒生风型络风内动细胞模型的佳造模条件.
关键词： 热毒生风型络风内动 人冠状动脉平滑肌细胞 脂多糖 炎性反应通路 细胞模型 -
脂多糖对体外培养的人冠状动脉平滑肌细胞生长的影响——对建立支架内再狭窄炎症细胞模型的探索
目的 探讨不同浓度脂多糖(LPS)作用不同时间对体外培养的人冠状动脉平滑肌细胞(HCASMC)生长的影响,分析其应用于HCASMC的无毒性反应浓度范围,为开展介入术后再狭窄相关研究建立HCASMC炎症活化模型提供实验数据支持.方法 体外培养的HCASMC 3~5代,加入96孔细胞培养板,用噻唑蓝比色实验(MTT法)检测不同浓度(0μg/ml,0.01μg/ml,0.1μg/ml,0.5μg/ml,1μg/ml,5μg/ml,10μg/ml,100μg/ml)LPS在不同作用时间(24 h,46 h,72 h)下对HCASMC活力影响,酶标仪492 nm处测定各组A值,细胞活力=(实验组A值-调零孔A值)/对照组A值.结果 LPS在低于100μg/ml浓度范围内,干预HCASMC时间短于48 h未出现细胞毒性,多表现为促细胞增殖效应,而干预时间大于48 h则显现出较为明显的细胞毒性,且细胞活力随LPS浓度的增大而减低;干预72 h后LPS浓度在0~0.01μg/ml范围内有促增殖作用,0.1~0.5μg/ml浓度则产生轻微的细胞抑制作用,但细胞毒性不明显,在1~100μg/ml浓度下HCASMC毒性反应逐渐出现,且HCASMC活力随LPS浓度的升高而减低.同一浓度水平的LPS随着作用时间延长,HCASMC的细胞活力逐步下降,且作用时间越长下降越明显.结论LPS在浓度0.1μg/ml以下未出现明显的细胞毒性,其中LPS浓度0.01μg/ml干预24 h,人冠状动脉平滑肌细胞增殖显著,可作为建立炎症诱导人冠状动脉平滑肌细胞活化模型的佳条件.
关键词： 脂多糖 人冠状动脉平滑肌细胞 细胞活力 细胞毒性 -
水蛭素对体外培养的人冠状动脉平滑肌细胞和内皮细胞生长的影响
目的：探讨水蛭素对体外培养的人冠状动脉平滑肌细胞（HCASMC）和人冠状动脉内皮细胞（HCAEC）生长的影响及剂量依赖关系，明确水蛭素抗再狭窄的有效性和可行性。方法用体外培养的HCASMC和HCAEC 3~5代，加入96孔细胞培养板，设置调零孔、对照孔、加药孔（6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.2、0.1、0.05、0.025 mg/ml不同浓度水蛭素共9组，每组6个复孔），培养48 h后用噻唑蓝比色试验（MTT法）检测不同浓度水蛭素干预下两种细胞的活力和抑制率变化。结果与对照组相比，低浓度（0.025～0.1 mg/ml）水蛭素在对HCASMC增殖的影响方面无统计学差异（P均＞0.05），而中高浓度（0.2～6.25 mg/ml）的水蛭素抑制HCASMC增殖，差异有统计学意义（P均＜0.05），且其抑制率随水蛭素浓度升高而增加。与对照组相比，0.025～3.13 mg/ml的水蛭素在对HCAEC增殖的影响差异无统计学意义（P均＞0.05），但0.05～0.2 mg/ml的水蛭素对HCAEC有一定的促增殖作用；而高浓度（6.25 mg/ml）的水蛭素对HCAEC增殖的抑制增加，差异有统计学意义（P均＜0.05），其抑制率达到44.6%。结论中高浓度水蛭素可呈剂量依赖性抑制HCASMC的生长，低中浓度水蛭素对HCAEC无明显抑制作用，且能在抗血栓的同时保护HCAEC甚至促进HCAEC生长。
关键词： 水蛭素 人冠状动脉平滑肌细胞 人冠状动脉内皮细胞 抑制率 -
紫杉醇水蛭素支架涂层复合物对LPS诱导的HCASMC炎性活化过程中核转录因子NF-κB p65及其下游炎症因子的调控作用
目的 探讨支架涂层复合物紫杉醇水蛭素对脂多糖(LPS)诱导人冠状动脉平滑肌细胞(HCASMC)炎性活化过程中核转录因子NF-κB p65及其下游炎症因子表达的影响.方法 选用4~6代的HCASMC,将细胞分为空白对照组(正常HCASMC,未做任何处理)、LPS模型组(LPS干预)、紫杉醇水蛭素高浓度组(1 μmol/L紫杉醇+0.2 mg/ml水蛭素+LPS干预)、紫杉醇水蛭素低浓度组(1 μmol/L紫杉醇+0.0125 mg/ml水蛭素+LPS干预).每组设置3个复孔.ELISA法检测细胞上清肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、白介素-6(IL-6)和白介素-1β(IL-1β)的表达水平,用Q-PCR法对各组细胞NF-κB p65、TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA进行检测,用Western Blotting检测NF-κB p65蛋白表达水平.结果与空白对照组比较,LPS模型组NF-κB p65、TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA表达水平明显升高,差异有统计学意义(P均<0.05);HCASMC经高、低浓度紫杉醇水蛭素复合物预处理,LPS刺激后,上述指标低于LPS模型组,差异有统计学意义(P均<0.05).LPS模型组NF-κB p65蛋白表达水平明显高于空白对照组,而紫杉醇水蛭素预处理组NF-κB p65蛋白表达水平较LPS模型组明显降低,其中高浓度处理组降低更为显著.与空白对照组比较,LPS模型组TNF-α、IL-1β和IL-6表达水平升高,差异有统计学意义(P均<0.05).与LPS模型组比较,紫杉醇水蛭素低浓度与高浓度组TNF-α、IL-1β和IL-6水平明显降低,差异有统计学意义(P均<0.05).其中高浓度紫杉醇水蛭素干预后IL-1β表达下降较低浓度更为显著,差异有统计学意义(P<0.05).结论 紫杉醇水蛭素支架涂层复合物对LPS诱导的HCASMC炎性活化过程中NF-κB p65的激活具有明显的抑制作用,有效下调核转录因子NF-κB p65的转录活性,显著抑制下游炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表达.
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LPS对体外培养的人冠状动脉平滑肌细胞炎症因子表达的影响--对建立支架内再狭窄炎症细胞模型的探索
目的：探索LPS作用不同时间对体外培养的人冠状动脉平滑肌细胞（HCASMC）炎症因子表达的影响，为支架置入术后再狭窄炎症细胞活化模型的建立提供实验数据支持。方法体外培养的HCASMC 3~5代，接种于6孔细胞培养板，用不同浓度（0.01，0.1，0.5，1.0，10）μg/ml的LPS作用不同时间（6 h，24 h，48 h），通过酶联免疫吸附实验（ELISA）检测细胞培养上清液中炎症因子白介素6（IL-6）、白介素1β（IL-1β）以及肿瘤坏死因子α（TNF-α）的表达变化。结果对照组只有少量的IL-1β分泌。加入不同浓度LPS刺激后，与对照组比较，干预6 h的各LPS浓度组IL-1β表达量无明显变化，差异无统计学意义（P均＞0.05）。而干预24 h或48 h的各LPS浓度组与对照组相比IL-1β表达量明显增加，差异有统计学意义（P均＜0.05）。对照组有少量IL-6分泌。加入不同浓度LPS刺激后，与对照组比较，0.5μg/ml浓度组LPS干预6 h、24 h、48 h均可显著诱导IL-6的表达增加，1μg/ml浓度组则在24 h、48 h刺激条件下表达增加，差异有统计学意义（P均＜0.05）。对照组有少量TNF-α的分泌，加入LPS干预后，TNF-α的变化趋势与IL-6相一致。结论0.5μg/ml和1μg/ml浓度的LPS刺激24 h或48 h使HCASMC的IL-6、IL-1β和TNF-α表达增加，可作为构建HCASMC炎症活化模型的参考。
关键词： 脂多糖 人冠状动脉平滑肌细胞 炎症因子 细胞模型 -
炎症因子对类胰岛素样生长因子1沉默表达人冠状动脉平滑肌细胞增殖和凋亡的影响
目的 研究炎症因子对类胰岛素样生长因子1 (IGF1)沉默表达的人冠状动脉平滑肌细胞(hCASMCs)增殖和凋亡的影响.方法 应用慢病毒RNA干扰技术沉默hCASMCs的IGF1表达.分别用未感染病毒载体的细胞和感染阴性对照病毒载体的hCASMCs作为空白对照和阴性对照.肿瘤坏死因子-α50 ng/ml与白细胞介素-1β 40 ng/ml共同刺激细胞8h.采用酶联免疫吸附试验检测细胞培养上清液中IGF1浓度,MTT法及流式细胞术检测细胞的增殖及凋亡.结果 炎症因子刺激后,IGF1沉默表达的hCASMCs上清液中IGF1的浓度显著低于空白对照组和阴性对照组[(426.35±120.96)比(1 030.69±54.69)和(992.82 ±26.90) pg/ml,P=0.000];细胞的增殖活性显著低于两个对照组(0.302 ±0.011比0.401 ±0.028和0.393 ±0.017,F=37.628,P=0.000),凋亡率显著高于对照组[(10.57 ±0.99)％比(0.19±0.13)％和(1.31 ±0.30)％,P=0.001].结论 炎症因子可能具有抑制IGF1敲减后的hCASMCs增殖和促进凋亡的作用.
关键词： 类胰岛素样生长因子1 炎症因子 人冠状动脉平滑肌细胞 RNA干扰 增殖 凋亡 -
雷公藤甲素诱导人冠状动脉平滑肌细胞凋亡的实验研究
目的:研究雷公藤甲素对人冠状动脉平滑肌细胞凋亡的影响.方法:采用MTT实验检测雷公藤甲素对体外培养的人冠状动脉平滑肌细胞增殖的影响,运用流式细胞术、基因组DNA电泳观察凋亡特征性"梯状"条带检测细胞凋亡,采用Western-blot检测P53蛋白表达变化.结果:雷公藤甲素对体外培养的人冠状动脉平滑肌细胞具有明显的抑制作用.流式细胞仪检测显示雷公藤甲素可以显著诱导人冠状动脉平滑肌细胞凋亡,DNA电泳显示雷公藤甲素作用于人冠状动脉平滑肌细胞后出现凋亡细胞特有的DNA阶梯状条带.P53蛋白表达水平呈浓度依赖性表达上调.结论:雷公藤甲素可能通过激活P53基因表达抑制人冠状动脉平滑肌细胞的生长并诱导其凋亡.
关键词： 雷公藤甲素 人冠状动脉平滑肌细胞 细胞凋亡 P53 -
炎症因子刺激IGF-I基因沉默后的hCASMC细胞PAPP-A、IGF-I的表达及细胞学功能改变的意义
目的 观察炎症因子刺激胰岛素样生长因子-I(IGF-I)基因沉默后的人冠状动脉平滑肌细胞(IGF-I-shRNA-hCASMC)中妊娠相关血浆蛋白-A(PAPP-A)、IGF-I的表达及其细胞学功能改变,为进一步明确IGF轴激素在动脉粥样硬化不稳定斑块破裂中的作用提供实验数据.方法 利用肿瘤坏死因子-α (TNF-α))、白介素-1β(IL-1β)和/或胰岛素样生长因子结合蛋白-4(IGFBP4)刺激IGF-I-shRNA-hCASMC,用Western blot及ELISA检测细胞中PAPP-A、IGF-I的表达.用MTT法及流式细胞仪检测TNF-α、IL-1β、IGFBP4对IGF-I-shRNA-hCASMC细胞功能学改变.结果 用TNF-α+ IL-1β或TNF-α+ IL-1β+ IGFBP4刺激空白对照(CON)组细胞、阴性对照(NC)组细胞、RNA干扰(RNAi)组细胞时hCASMCs中PAPP-A均有较强表达,RNAi组的hCASMCs中PAPP-A的表达量少于另外两组.而未行刺激的三组细胞则无PAPP-A的表达.在TNF-α+ IL-1β+ IGFBP4刺激RNAi组细胞中IGF-I表达量高于仅用TNF-α+ IL-1β刺激和未行刺激组,并且差异具有统计学意义.在RNAi组TNF-α+ IL-1β+ IGFBP4刺激细胞所测的A570值低于TNF-α+ IL-1β刺激细胞(P＜0.01).RNAi组细胞经过TNF-α+ IL-1β或TNF-α+ IL-1β+ IGFBP4刺激后表现为显著性凋亡,与CON组及NC组细胞相比具有统计学意义,RNAi组细胞经TNF-α+ IL-1β+IGFBP4刺激后与经TNF-α+ IL-1β刺激后相比细胞更易凋亡,差异有统计学意义.结论 炎症因子刺激IGF-I-RNAi的hCASMCs可导致细胞增殖力下降,细胞凋亡增加,在局部细胞环境中活性IGF-I增加情况,加剧细胞增殖力下降、细胞凋亡增加.
关键词： 炎症因子 人冠状动脉平滑肌细胞 RNA干扰 IGF-I轴 细胞学功能
