华钩藤对NO供体诱导的离体小脑颗粒细胞神经元死亡的防护作用

中枢髓鞘膜蛋白抑制神经突起生长与胞内cAMP关系的研究

目的　探讨中枢神经髓鞘膜蛋白抑制神经突起生长与神经元胞内cAMP水平的关系。　方法　应用体外培养方法观察经密度梯度离心法提取的中枢神经髓鞘膜蛋白对小脑颗粒细胞突起生长的影响，用放射免疫方法检测神经元接触髓鞘膜蛋白后胞内cAMP水平的变化。　结果　1.中枢神经髓鞘膜蛋白抑制培养小脑颗粒细胞突起的生长； 2.神经元接触髓鞘膜蛋白后的初5min，胞内cAMP水平即开始下降，12h降至低点。　结论中枢神经髓鞘膜蛋白抑制神经突起生长的作用可能与抑制因子通过信号转导使神经元胞内cAMP水平降低有关。

电磁脉冲诱导小脑颗粒细胞凋亡的研究

以体外原代培养的小脑颗粒细胞为对象,研究电磁脉冲(场强为6×104 V/m)辐照后早期小脑颗粒细胞死亡和凋亡的变化情况.于照射后1、6、12、24和48h分别采用MTT法和流式细胞仪测定细胞活力和凋亡细胞的比例,用HE染色及TUNEL检测细胞凋亡并分别用普通光学显微镜和荧光显微镜进行凋亡观察,探讨电磁脉冲的可能致伤机制.结果显示,电磁脉冲辐照后,小脑颗粒细胞不仅发生快速的坏死,而且还发生细胞凋亡,于辐照后12h达到高峰.结果提示,电磁脉冲辐照后早期可导致小脑颗粒细胞凋亡和坏死,此改变可能与电磁脉冲致细胞DNA损伤有关.

电磁脉冲辐照对培养大鼠小脑神经细胞内LDH和培养上清中LDH,CHE,K+和Na+浓度的影响

目的:以体外原代培养的小脑颗粒细胞为对象,测定电磁脉冲辐照神经细胞前后细胞内LDH和培养上清中LDH,CHE,K+和Na+浓度及与时间的关系,研究电磁脉冲(场强为6×104 V/m)辐照后早期对小脑颗粒细胞损伤的可能机制.方法:在培养12～14d时,高场强EMP模拟源(有界波模拟源),场强为6×104 V/m,脉冲上升时间为20ns,脉宽为30μs,频率包含0～100MHz,以2.5次/min,辐照2min.并于辐照后0(即刻),1,6,12和24h应用生化检测试剂盒测定细胞内和培养上清中LDH及培养上清中CHE,K+和Na+浓度.结果:电磁脉冲辐照后即刻就可引起培养上清LDH明显升高;辐照后1h细胞内LDH明显降低,而培养上清中LDH,CHE和K+明显升高;辐照后6h细胞内LDH明显降低,而培养上清中LDH,CHE,K+ 和Na+明显升高;辐照后12h细胞内LDH明显降低,培养上清中CHE,K+ 和Na+明显升高;辐照后24h所有上述指标基本恢复.结论:电磁脉冲辐照后可损伤大鼠海马神经元细胞膜.

1-甲基-4-苯基吡啶离子诱发大鼠小脑颗粒细胞凋亡

目的建立1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methy1 4-phenyl pyridinium ion,MPP+)诱导的大鼠小脑颗粒细胞凋亡模型.方法MPP+处理大鼠小脑颗粒细胞,分别用甲基绿-派诺宁染色,DNA凝胶电泳,流式细胞术进行检测.结果浓度为50 μmol/LMPP+使小脑颗粒细胞发生凋亡.结论以MPP+为诱导剂建立的大鼠小脑颗粒细胞凋亡模型,可用于研究和帕金森病(PD)有关的细胞凋亡的调控机制和筛选抗PD药物.

银杏提取物对细胞毒素MPP+致小脑颗粒细胞损伤的保护作用

目的探讨银杏提取物(Ginkgo biloba L. extract,GBE)对1-甲基-4苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridiniumion,MPP+)所致大鼠小脑颗粒细胞损伤的保护作用.方法用GBE预先孵育大鼠小脑颗粒细胞,然后用MPP+处理细胞,分别用MTT法和神经丝蛋白的免疫组织化学方法进行检测.结果50μmol/L的MPP+使小脑颗粒细胞损伤,20μg/mL的GBE具有保护作用.结论GBE对神经毒素MPP+致细胞损伤有保护作用,提示GBE可能具有抗帕金森病(Parkinson's Disease,PD)的潜在功效.

华钩藤钩茎对NO供体诱导的小脑颗粒细胞神经元死亡的抑制作用

血管内皮细胞生长因子与神经系统发育及其病理学改变

近年来,越来越多的研究表明,血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial gowth factor,VEGF)一方面对神经系统内的一些神经细胞,胶质细胞等有营养和保护作用,同时又可以促进神经干细胞的增殖和小脑颗粒细胞的迁移[1].另一方面,当发生创伤性脑损伤时,会引起脑组织的缺血和缺氧,缺血缺氧明显的病理生理反应就是会导致血管再生,血管再生因子和血管再生抑制因子共同调控血管再生过程.VEGF是迄今发现的重要的促血管生长因子,在病理条件下,可以减轻脑组织的损伤,促进受损伤的神经细胞和神经组织的再生[1].另外,还有研究表明,VEGF还可以参与肿瘤血管的形成,是主要的刺激因子[2].神经系统的发育主要起源于神经干细胞,神经干细胞所在区域内含有大量的内皮细胞(endothelial cells,ECs),这些内皮细胞调控着干细胞的增殖,但是在体外,这些内皮细胞又可以诱导神经干细胞转化成为神经元[3].内皮细胞主要分泌松弛因子(EDRF),组织因子(TF),VEGF等.其中VEGF是内皮细胞分泌的主要因子,在这个过程中发挥着非常重要的作用.

一氧化氮酶与神经生长因子对中枢神经细胞保护作用的相关性研究

目的探讨一氧化氮酶(NOS)与神经生长因子(NGF)保护鼠小脑颗粒细胞(rCGC)作用机制的关系.方法向细胞培养仅24h的rCGC中,分别加入酒精、NGF及一氧化氮酶抑制剂NG-硝基-L-精氨酸(NAME).再经24h培养后,通过光学显微镜观察它们对细胞产生的影响.结果 NGF能对rCGC产生保护作用,显著减少酒精对细胞的杀死.但NAME却能抑制NGF的作用.结论一氧化氮酶在NGF保护rCGC抵抗酒精的神经毒性过程中起着关键的作用.

褪黑素在缺血再灌注引起神经元凋亡的保护作用

目的探讨模拟缺血再灌注引起神经元凋亡的途径和褪黑素(melatonin,MT)抗凋亡的作用机理.方法建立原代培养大鼠小脑颗粒细胞的体外模拟缺血(Oxygen Glucose Deprivation,OGD)再灌注模型,测定培养液LDH活性和细胞DNA琼脂糖凝胶电泳;利用Rhodamine123和激光共聚焦显微镜观察线粒体膜电位的变化;ELISA检测细胞浆中细胞色素C水平;用同样指标观察MT对其损伤的保护作用.结果在体外模拟缺血再灌注模型中培养液LDH活性增加(P＜0.05),琼脂糖凝胶电泳DNA出现梯状条带,线粒体膜电位明显降低,细胞浆中细胞色素C含量增加(P＜0.05),MT对上述现象有明显的抑制作用.结论(1)缺血再灌注引起的神经元凋亡机理之一是通过线粒体凋亡途径;(2)MT可通过阻止线粒体凋亡途径而保护模拟缺血再灌注诱导小脑颗粒细胞的凋亡.

褪黑素在培养的小脑颗粒细胞模拟缺血再灌注中的抗氧化作用研究

目的探讨褪黑素(Melatonm,MT)在模拟缺血再灌注中对神经元的保护机制,从而为褪黑素的临床应用提供可靠的理论依据.方法分离SD乳鼠的小脑颗粒细胞进行原代培养,待细胞发育成熟后建立体外模拟缺血再灌注模型.采用相差显微镜进行细胞的形态学观察;通过TBA荧光法和联苯三酚自氧化法来检测模拟缺血再灌注过程中细胞内丙二醛(MDA)生成量、超氧化物歧化酶(SOD)的活性变化以及褪黑素在模拟缺血再灌注过程中对二者的影响.结果模拟缺血(OGD)后再灌注12 h的细胞,胞内MDA的生成比在OGD后再灌注6 h明显增多(P＜0.05),OGD后再灌注12 h MDA生成多随后降低;经OGD处理后细胞内SOD的活性较正常组明显降低(P＜0.05),OGD后再灌注24 h降到低随后升高.MT能显著降低细胞内MDA的生成(P＜0.05),并存在着一定的剂量依赖关系.SOD的活性在加入MT后也明显提高(P＜0 05).结论MT可能通过其抗氧化作用在模拟缺血(OGD)再灌注中起到神经保护作用.

缺血再灌注引起神经元凋亡及褪黑素抗凋亡的机制

目的探讨模拟缺血再灌注引起神经元凋亡的途径和褪黑素(melatonin,MT)抗凋亡的作用机制.方法用原代培养的SD乳鼠小脑颗粒细胞建立以缺氧缺糖模拟缺血再灌注模型,并加不同浓度的MT(10-5、10-7、10-9mol/L)孵育.采用荧光比色法检测其线粒体跨膜电位及细胞内的活性氧;用Western blot及ELISA分别检测线粒体和胞质中的细胞色素C;比色法检测胞质中Caspase-3的活性.结果在模拟缺血再灌注小脑颗粒细胞模型中,细胞内的活性氧在缺氧缺糖后明显增加;线粒体跨膜电位降低并随再灌注时间延长而加重;线粒体释放入胞质的细胞色素C增加,胞质的Caspase-3活性增加;MT可显著减少活性氧和抑制线粒体释放细胞色素C,抑制线粒体跨膜电位的降低,并呈一定剂量依赖性.结论①缺血再灌注引起的神经元凋亡部分是通过线粒体凋亡途径;② MT可通过抗氧化作用和阻止线粒体凋亡而抑制模拟缺血再灌注诱导的小脑颗粒细胞凋亡.

褪黑素对模拟缺血再灌注的原代培养小脑颗粒细胞的保护作用

目的探讨褪黑素(melatonin,MT)对模拟中枢缺血再灌注原代培养神经细胞的保护作用.方法分离SD乳鼠的小脑颗粒细胞进行原代培养,建立以缺氧缺糖(oxygen-glucose deprivation,OGD)模拟的体外缺血再灌注模型(简称OGD).通过MTT比色和锥虫蓝染色,吖啶橙染色(AO)和DNA琼脂糖凝胶电泳的检测方法,观察OGD再灌注对小脑颗粒细胞的损伤,以及OGD中用不同浓度的MT孵育不同时间,MT对神经元损伤的抑制作用.结果在OGD的细胞模型中,与OGD组比较1 nmol/L和10 nmol/L的MT孵育48 h后的细胞存活率明显提高(P<0.05);100 nmol/L MT孵育24 h后细胞的存活率明显提高(P<0.05);药理剂量的MT(1、10、100 μmol/L)孵育12 h后细胞的存活率就明显提高(P<0.05);各剂量组细胞的存活率都随着孵育时间的延长而增强.而且,当MT浓度介于1 nmol/L和10μmol/L之间时,细胞的存活率随着剂量的增大而提高.经OGD处理的细胞,吖啶橙染色(AO)和DNA琼脂糖凝胶电泳显示细胞损伤呈现凋亡和坏死两种方式,MT能够抑制OGD所诱导的细胞凋亡.结论 MT可防治脑中枢缺血再灌注引发的继发性损伤.

小脑颗粒神经元凋亡差异表达基因的分离克隆研究

目的筛选分离低钾诱导的小脑颗粒细胞凋亡的差异表达基因.方法采用低钾处理的小脑颗粒细胞,抽提细胞总RNA,用荧光法mRNA差异显示技术分离差异表达基因,并对差异表达基因片段进行回收、克隆,经反向RNA印迹及RT-PCR技术验证.结果发现51条差异片段,成功克隆8个片段,其中2个未知功能的基因片段证实在低钾诱导的小脑颗粒细胞凋亡中表达增加.结论mRNA差异显示法是分离差异表达基因的一个良好的工具,分离出的差异基因与神经细胞凋亡有关.

碱性成纤维细胞生长因子对酒精中毒鼠小脑颗粒细胞存活的影响及作用机制的研究

目的:观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对鼠小脑颗粒细胞(CGC)存活的影响及作用机制.方法:通过光学显微镜观察bFGF、酒精及一氧化氮酶(NOS)抑制剂NG-硝基-L-精氨酸(NG-nitro-L-arginine methy1 ester,NAME)对CGC产生的影响.结果:bFGF能在无酒精的环境下,促进CGC的生存,使细胞数高于空白对照组(P＜0.01),并能减少酒精对细胞的杀死,令CGC损失率较酒精空白对照组低(P＜0.01),从而对细胞产生保护作用.但NAME却能抑制bFGF的作用.结论:bFGF通过一氧化氮酶促进CGC的存活并对抗酒精对CGC的毒性作用.

N-甲基-D-天门冬氨酸对鼠小脑颗粒细胞存活的影响

目的:研究N-甲基-D-天门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)对鼠小脑颗粒细胞(CGC)存活的影响.方法:光镜观察NMDA和酒精对细胞所产生的作用.结果:NMDA在无酒精条件下促进细胞生存,并抑制酒精对细胞所产生的神经毒性作用而减少细胞死亡.结论:NMDA对小脑颗粒细胞具有神经营养和神经保护作用.

proBDNF对培养鼠小脑颗粒细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察脑源性神经营养因子前体(proBDNF)对培养的小鼠小脑颗粒细胞(CGCs)的增殖和凋亡的影响,探讨p75神经营养因子受体(p75NTR)和VPS10P-结构域家族成员sortilin的介导机制.方法 采用出生后7 d(P7)的129SV转基因小鼠(p75 NTR+/+和p75 NTR-/-)进行CGCs的原代培养.分为BSA组(10 ng/mL)、proBDNF干预组(10 ng/mL)和proBDNF(10 ng/mL)+ sortilin-Fc(20 ng/mL)干预组.免疫荧光染色法观察p75 NTR和sortilin在培养细胞的表达,BrdU标记阳性增殖细胞以及TUNEL法检测凋亡细胞.结果 成功培养出高纯度的原代小脑颗粒细胞.免疫荧光显示p75 NTR和sortilin共同表达于野生型小鼠培养的小脑神经元胞膜和突起上.给予proBDNF干预后,p75NTR+/+型CGCs的BrdU阳性细胞比例较对照组明显减少(P＜0.01),而TUNEL阳性细胞比例较对照组明显增加(P＜0.01),且这两种效应都可被sortilin-Fc竞争性抑制并中和;p75 NTR-/-型CGCs中各组之间BrdU阳性细胞以及TUNEL阳性细胞比例均无显著性差异(P＞0.05).结论 proBDNF可能通过与p75 NTR、sortilin结合形成功能三聚体抑制神经细胞的增殖、促进细胞凋亡,proBDNF具有神经毒性作用.

环鸟苷酸依赖性蛋白激酶拮抗酒精性中枢神经细胞毒性机制研究

目的 探讨环鸟苷酸依赖性蛋白激酶对酒精致鼠小脑颗粒细胞(cerebellar granule cells,CGC)毒性作用的影响机制.方法 通过光学显微镜观察一氧化氮(NO)释放剂,环鸟苷酸及环鸟苷酸依赖性蛋白激酶抑制剂对鼠小脑颗粒细胞存活的影响.结果 NO释放剂,环鸟苷酸在无酒精组中促进细胞的生存,并能对CGC产生保护作用,减少酒精对细胞的杀死.环鸟苷酸依赖性蛋白激酶抑制剂可抑制二者对细胞的作用.结论 环鸟苷酸依赖性蛋白激酶在NO释放剂和环鸟苷酸促鼠小脑颗粒细胞的存活和抵抗酒精性神经毒性过程中具有重要的作用.

一氧化氮-环鸟苷酸通路与神经生长因子拮抗酒精神经毒性作用的关系

目的 探讨神经生长因子(NGF)对鼠小脑颗粒细胞(CGC)存活的作用机制。方法通过光学显微镜观察酒精、NGF以及一氧化氮酶(NOS)抑制剂NG-硝基-L-精氨酸(NG-nitro-L-arginine methylester，NAME)和可溶性鸟苷酰环化酶抑制剂6-Anilinoquinoline-5，8-quinolinedione(LY83583)对细胞产生的影响。结果NGF能对CGC产生保护作用，减少酒精对细胞的杀死。但NAME及LY83583却能抑制NGF的作用。结论一氧化氮-环鸟苷酸通路(NO-cGMP pathway)在NGF保护鼠小脑颗粒细胞抵抗酒精的神经毒性过程中起到关键的作用。

一氧化氮——环鸟苷酸通路与鼠小脑颗粒细胞存活的关系

目的研究一氧化氮-环鸟苷酸(NO-cGMP)通路与鼠小脑颗粒细胞(CGC)存活的相关性.方法通过光学显微镜观察N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA),一氧化氮释放剂2',2'-(hydroxy-nitrosohydrazono)bisethanamine(Deta-NONOate)和环鸟苷酸类物质8-溴鸟苷-3',5'-环单磷酸(cGMP)通过NO-cGMP通路而对CGC存活所产生的影响,以及一氧化氮酶抑制剂NG-硝基-L-精氨酸(NAME),可溶性鸟苷酰环化酶抑制剂6-Anilinoquinoline-5,8-quinolinedione(LY83583),环鸟苷酸蛋白激酶G抑制剂Guanosine3',5'-cyclic monophosphorothioate,8-(4-Chlorophenylthio)-,Rp-Isomer,Triethylammonium salt(Rp-8-pCPT-cGMPS)对通路的阻断作用.结果 NMDA,Deta-NONOate和cGMP均能在无酒精的环境下,促进细胞的生存.并能不同程度地对CCC产生保护作用,减轻酒精对细胞的毒性作用.但NAME和LY83583却分别能抑制NMDA和Deta-NONOate的作用,而Rp-8-pCPT-cGMPS则能消除cGMP对细胞的影响.结论 NO-cGMP通路在促进鼠小脑颗粒细胞的存活和抵抗酒精的神经毒性过程中起到关键的作用.