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OCTN2在1例正常生育男性附睾中的表达报告
目的:研究人类附睾有机阳离子转运子2 (()CTN2)的mRNA表达特征及蛋白表达特征,为进一步探讨附睾肉碱转运机制提供理论依据.方法:采用RT-PCR方法检测人类附睾组织头部、体部及尾部OCTN2基因的表达；并用Westernblot方法检测该基因在附睾中的蛋白表达,计算其在蛋白水平的相对表达量.结果:OC-TN2mRNA在人附睾头、体、尾组织中均有OCTN2表达,表现为附睾头部表达较弱,而附睾体、尾部分表达丰富；OCTN2蛋白在人附睾头部表达较弱,表达量为(0.71±0.09),附睾体、尾部分表达较丰富,表达量分别为(0.95±0.22) 与(0.99±0.15).结论:两种方法均证实有机阳离子转运子2在人类附睾中有表达,且呈现附睾头部表达较弱.附睾体、尾部分表达丰富的特征.为进一步研究附睾肉碱转运机制奠定基础.
关键词： 人类附睾 OCTN2 蛋白表达 Westernblot -
结缔组织生长因子在扩张皮肤中的表达
我们采用免疫组织化学技术、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及Westernblot等方法观察结缔组织生长因子(CT-GF)在扩张皮肤中的表达,探讨CTGF在皮肤扩张中的作用和分子机制.
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Rce1基因在舌鳞状细胞癌中的表达及临床意义
目的:研究舌鳞状细胞癌(tongue squamous cell carcinoma,TSCC)中Rce1基因的表达及与临床分期、肿瘤病理分型及颈淋巴结转移的关系.方法:采用实时荧光定量PCR技术对47例舌癌组织及癌旁组织中的Rce1基因进行检测,并运用Western Blot检测Rce1蛋白的表达.结果:Rce1基因在舌癌组织中的表达明显高于癌旁组织(P<0.05);其表达强度与TSCC病理分型无关(P>0.05);T3~4期患者癌组织中Rce1基因表达强度显著高于T1~2期(P<0.05).TSCC颈淋巴结转移患者癌组织中Rce1基因表达强度显著高于无转移者(P<0.05).结论:Rce1基因的表达与舌鳞癌的发生、发展及淋巴结转移相关,可作为患者诊断及预后的参考指标之一.
关键词： Rce1 舌癌 PCR Westernblot -
转化生长因子-β3对牙髓干细胞成骨向分化的作用
目的:探讨转化生长因子-β3(transforming growth factor-β3,TGF-β3)诱导体外培养的兔牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)成骨向分化的情况.方法:采用酶消化法分离并培养兔DPSCs,光镜下进行形态学观察;并将体外培养的第4代DPSCs分为空白对照组,矿化液阳性对照组与TGF-β3实验组.1、3、5、7 d后采用碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)试剂盒检测各组细胞内ALP活性变化情况;1、3、5、7 d后行细胞免疫化学法检测成骨细胞标记物相关转录因子2(RUNX-2)和骨涎蛋白(BSP)的表达情况;14 d后观察各组细胞的矿化结节情况;7 d后使用Western blot检测各组细胞成骨分化指标BSP变化情况.结果:兔DPSCs在诱导体系中生长状态良好;实验组较两对照组上调细胞内ALP活性明显;免疫化学检测TGF-β3组与矿化液组RUNX-2第5 d呈阳性表达,BSP第7 d阳性表达,空白对照组均呈弱阳性;14 d茜素红染色显示TGF-β3组矿化结节较矿化组明显,空白对照组阴性;与对照组相比,TGF-β3可增强兔DPSCs内BSP相关蛋白表达.结论:TGF-β3能够一定程度上促进兔DPSCs成骨向分化.
关键词： 牙髓干细胞 转化生长因子-β3 Westernblot 成骨 -
羟基红花黄色素A对雌激素效应相关蛋白表达的影响
目的 探讨羟基红花黄色素A(hydroxysafflor yellow A,HSYA)对雌激素效应相关蛋白表达的影响.方法 培养雌激素受体阳性细胞T47D和特异性雌激素受体(estrogen receptor,ER)阴性细胞SK-BR-3,将1×10-7mol/L-1×10-9mol/L三种梯度浓度的HSYA作用于两种细胞,通过蛋白质免疫印迹法检测雌激素受体ERα 及ERβ、细胞外调解蛋白激酶1/2(ERK1/2)及p-ERK1/2、孕激素受体(progesterone receptor,PR)、抑癌基因P27等蛋白的表达情况.结果 与空白对照组相比,在T47D细胞中,高浓度的HSYA促进了ERα、ERβ、ERK1/2、p-ERK1/2、PR的表达,抑制了P27的表达(P<0.01);在SK-BR-3细胞中,HSYA显著抑制了ERK1/2的表达,但对p-ERK1/2的表达影响不明显(P>0.05).结论 HSYA在细胞内影响雌激素效应相关蛋白的表达情况不同,可能是通过调节ER表达及激活ERK信号通路而发挥雌激素样作用.
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维甲酸激活基因RA28编码蛋白的表达及性质研究
目的:研究新基因RA28的读码框及其蛋白的性质,并检测其在不同肿瘤细胞系中的表达情况,探讨其与肿瘤发生的关系.方法:采用原核表达系统,获得高效表达, 产物经金属螯合亲和层析纯化;Westernblot分析RA28蛋白在不同细胞系中的表达情况.此外,借助计算机辅助分析.结果:RA 28蛋白的分子量为12KDa,等电点为7.1;RA28蛋白在所检测的细胞系中均表达,未见细胞表达的特异性;同源序列比较表明,RA2 8与Mat 8(Mammarytumor8KDa)有很高的同源性.结论 :RA28可能参与细胞信号传导,并与肿瘤发生相关.
关键词： 基因RA28 Westernblot 蛋白表达 -
iTRAQ多重标记串联质谱技术在乳腺癌细胞侵袭患者HGF表达中的应用
目的 探讨iTRAQ多重标记串联质谱技术应用于检测乳腺癌细胞侵袭患者肝细胞生长因子(HGF)表达差异的临床价值.方法 选择该院2014年1月至2016年10月收治的35例乳腺癌患者与30例健康者为研究对象,通过iT RA Q标记、质谱检测、搜库以及Scqffold软件分析不同临床分期乳腺癌患者与健康者血清HGF表达差异,并用Western blot验证HGF的差异表达.结果 该研究血清样品中共鉴定出蛋白237个,达到严格定量标准的蛋白89个,乳腺癌患者与健康者共筛选出包括H G F在内的差异表达蛋白17个;iTRAQ多重标记串联质谱图谱显示,乳腺癌患者血清HGF表达水平显著高于健康者,差异有统计学意义(P<0.05);Western blot结果显示,不同临床分期HGF相对表达水平显著高于健康者,差异有统计学意义(P<0.05).结论 iTRAQ多重标记串联质谱技术有助于发现乳腺癌患者癌细胞高表达HGF,对指导临床治疗乳腺癌具有重要意义.
关键词： 乳腺癌 iTRAQ标记 HGF 蛋白质组学 Westernblot -
NPTX2基因在透明细胞性肾细胞癌中的表达及其临床意义
目的 检测并分析神经元正五聚体蛋白2(neuronal pentraxin 2,NPTX2)基因在透明细胞性肾细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)中的表达情况及其临床意义.方法 运用qPCR、western blot或免疫组织化学法分别从mRNA水平和蛋白质水平上对ccRCC细胞系和组织中NPTX2基因的表达情况进行检测.对体外培养细胞系(人肾小管正常上皮细胞系HK-2、人肾透明细胞癌原发灶细胞系786-O和胸水转移灶细胞系ACHN):采用qPCR和western blot法检测NPTX2在细胞系中的mRNA及蛋白的表达情况,并分析其在正常与癌细胞系中的表达差异.对组织标本:①cDNA芯片(15例ccRCC癌及对应癌旁正常组织):采用qPCR法检测并分析NPTX2 mRNA在两者中的表达情况及差异;②新鲜组织(4例ccRCC癌及对应癌旁正常组织):采用western blot法检测并分析NPTX2蛋白在两者中的表达情况及差异;③组织蜡块(70例ccRCC癌及对应癌旁正常组织):采用免疫组化EnVision法进一步验证NPTX2蛋白在两者中的表达情况及差异,并分析NPTX2蛋白表达与ccRCC患者的重要临床参数及预后之间的关系.结果 在ccRCC细胞系及癌组织中,NPTX2的mRNA水平和蛋白质水平均明显高于正常细胞系及癌旁正常组织,其差异有统计学意义(P<0.05).NPTX2蛋白表达水平与ccRCC肿瘤WHO/ISUP病理分级相关(P<0.05),与患者的性别、年龄、TNM分期和肿瘤大小尚不能认为相关(P>0.05).Kaplan-Meier单因素分析及log-rank检验显示NPTX2蛋白表达水平高低与患者的生存相关(P=0.04):高表达组患者同期生存率低于低表达组,预后较差.结论 NPTX2在ccRCC癌组织中异常高表达,与ccRCC肿瘤WHO/ISUP病理分级及患者的预后相关,可作为潜在的ccRCC诊断及判断预后的生物标志物.
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HSP90β反义核酸载体转染细胞HSP90β蛋白的表达
目的了解HSP90β反义核酸转染细胞中HSP90β蛋白的表达.方法通过lipofectamine介导将HSP90β反义核酸重组子pcDNA-HSP90转染人胃癌细胞系SGC7901、人胃癌多药耐药细胞系SGC7901/VCR、人肝癌细胞系HCC7402及人食管癌细胞系Ec109.经用G418进行筛选,对筛选出的阳性克隆用Western blot检测HSP90β蛋白的表达.结果 pcDNA-HSP90转染人胃癌细胞系SGC7901,人胃癌耐药细胞系SGC7901/VCR,人肝癌细胞系HCC7402及人食管癌细胞系Ec109后,用G418筛选出的阳性克隆,分别被命名为:AH-SGC7901,AH-SGC7901/VCR,AH-HCC7402及AH-Ec109.Westernblot检测结果表明,AH-SGC7901,AH-SGC7901/VCR,AH-HCC7402及AH-Ec109表达的HSP90β蛋白低于其亲本细胞.结论 HSP90β反义核酸可封闭HSP90βmRNA,使pcDNA-HSP90转染的细胞AH-SGC7901,AH-SGC7901/VCR,AH-HCC7402及AH-Ec109表达的HSP90β蛋白减少,为研究HSP90下调对肿瘤细胞生物学活性的影响提供了实验材料.
关键词： HSP90β 反义核酸 基因转染 Westernblot -
失血性休克大鼠心脏G蛋白变化及纳络酮对它的影响
目的:研究失血致低血容量性休克大鼠心脏组织鸟苷酸结合蛋白(Guanine nucleotide-binding protein,G蛋白)含量的变化及纳络酮对其影响。方法:颈总动脉放血,使平均动脉压降至45 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa),稳定1 h,完成失血致低血容量性休克大鼠模型,21只大鼠随机均分为:休克组、纳络酮治疗组、空白对照组。采用Western blot技术测定大鼠休克后6 h心脏组织中Gsα,Giα,Gqα,Goα的含量。结果:休克后心脏膜组织Gsα两条带较对照组显著降低(P<0.05和P<0.01)。Giα和Gqα带较对照组则显著升高(P<0.01和P<0.05),Goα降低(P<0.05)。纳络酮治疗后,Gsα两条带较休克组显著升高(均P<0.01),Giα和Gqα带较休克组显著降低(P<0.05；P<0.01),Goα降低更明显(P<0.01)。结论:大鼠心脏组织G蛋白含量的变化可能参与了失血致低血容量性休克时信号转导系统障碍的发生。纳络酮在改善休克的同时,也改变了G蛋白的水平,提示休克大鼠的心脏收缩舒张功能可能有G蛋白参与。
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超声微泡造影剂携雷帕霉素对人膀胱肿瘤系T24细胞增殖及凋亡影响的实验研究
目的 对超声微泡造影剂携雷帕霉素(RPM)抑制膀胱癌系T24细胞生长活性的作用进行分析,探究超声微泡造影剂携RPM在膀胱肿瘤患者中的应用前景;方法 建立空白对照组、RPM组以及超声微泡造影剂携RPM组处理T24细胞温育24 h后,采用四甲基偶氮唑盐法(MTT法)和流式细胞仪测定T24细胞生长和凋亡情况,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)以及蛋白免疫印迹法(Western blot)方法测定增殖细胞核抗原(PCNA)的mRNA以及蛋白的表达情况,进一步研究RPM抗肿瘤作用机制和超声微泡造影剂的应用价值,为临床应用提供实验依据;结果 M T T法测定结果显示RPM和超声微泡造影剂携RPM处理过后的T24细胞生长能力明显下降,其中超声微泡造影剂携RPM组与空白对照组、RPM组存在显著差异(P<0.05);流式细胞仪检测表明经RPM和超声微泡造影剂携RPM处理过后的处于G1期的T24细胞数量明显高于对照组(P<0.05),并且T24细胞出现大量凋亡;RPM组和超声微泡造影剂携RPM组两组PCNA的mRNA表达产物光密度值与对照组之间存在显著差异且T24细胞PCNA的蛋白的表达量明显减少,其中超声微泡造影剂携RPM也明显低于RPM组.结论 超声微泡造影剂携RPM具有良好的抑制T24细胞生长的作用,为膀胱癌的治疗提供了实验参考,表现出良好的临床应用前景.
关键词： 超声微泡造影剂 RPM 膀胱肿瘤 Westernblot RT-PCR -
3*Flag-hSesn1重组质粒的构建及其在骨肉瘤细胞中的表达
目的:构建3*Flag-hSesn1真核表达载体并检测在骨肉瘤细胞内的表达及定位.方法:以GST-hSesn1为模板,利用聚合酶链反应扩增hSesn1基因cDNA全长,并将其克隆至3*Flag标签的真核表达载体中.将构建的重组载体进行双酶切和测序鉴定,并转染到MG-63骨肉瘤细胞中,提取总蛋白进行Western blot检测.进一步利用共聚焦激光显微镜观察3*Flag-hSesn1在MG-63细胞中的定位,使用免疫沉淀的方法纯化人源Sesn1蛋白.结果:hSesn1基因的cDNA全长成功构建到3*Flag标签的真核表达载体中,Western blot检测到了含有Flag标签的人源Sesn1融合蛋白表达,且在MG-63骨肉瘤细胞中主要定位于细胞质和核周,并成功纯化人源Sesn1蛋白.结论:成功构建了3*Flag-hSesn1真核表达质粒,同时鉴定了其融合蛋白的表达,并纯化人源Sesn1蛋白.3*Flag-hSesn1蛋白主要定位在细胞质,部分定位于细胞核周.
关键词： hSesn1 Westernblot 免疫沉淀 -
骨肉瘤细胞中Sestrin2的表达和定位
目的:构建新型人源真核表达载体3*Flag-hSesn2并同时检测其在骨肉瘤细胞中的表达及定位.方法:以GST-hSesn2作为模板,利用聚合酶链反应扩增目的基因hSesn2的cDNA全长,并将其克隆到含有3*Flag标签的真核表达载体中.进一步将构建的重组质粒酶切并测序分析鉴定,转染至MG-63骨肉瘤细胞中,提取细胞总蛋白后进行Western blot检测重组蛋白表达.此外利用荧光共聚焦激光扫描显微镜检测3*Flag-hSesn2在MG-63细胞系中的定位,并终利用免疫沉淀方法纯化人源Sesn2蛋白.结果:hSesn2基因cDNA全长成功构建于含有3*Flag标签的真核表达载体中,利用Western blot检测3*Flag-hSesn2融合蛋白表达,分子量约为55kDa.3*Flag-hSesn2在MG-63骨肉瘤细胞系中主要定位于细胞质及核周,进一步成功纯化了hSesn2蛋白.结论:成功的构建了含有3*Flag标签的人源Sesn2真核表达质粒,同时鉴定3*Flag-hSesn2融合蛋白的表达,终成功纯化hSesn2蛋白.其中3*Flag-hSesn2蛋白主要定位在细胞质和核周.
关键词： hSesn2 Westernblot 免疫沉淀 -
hSesn3基因真核表达载体的构建及在骨肉瘤细胞中的蛋白表达和定位
目的:通过构建人Sesn3真核表达载体同时证实融合蛋白在细胞中的表达及定位.方法:提取Hela工具细胞的mRNA,反转录至cDNA.进一步通过PCR来扩增人Sesn3基因的cDNA全长片段,并将其亚克隆于pEGFP-C1真核表达载体中,进而将构建的重组质粒进行酶切及测序鉴定,转染到MG-63骨肉瘤细胞中,获取细胞总蛋白,通过Western blot方法检测表达.进一步利用激光共聚焦扫描显微镜方法观察MG-63细胞内pEGFP-hSesn3的定位,后利用免疫沉淀方法纯化人源hSesn3蛋白.结果:hSesn3基因cDNA全长片段克隆于真核表达载体pEGFP-C1中,酶切鉴定片段为1 410 bp,并成功测序.Western blot检测到了GFP-hSesn3融合蛋白表达,分子量约为79 kDa.在MG-63细胞中pEGFP-hSesn3主要定位于细胞质,进一步成功纯化了hSesn3蛋白.结论:成功构建了hSesn3基因cDNA全长的真核表达载体,在MG-63细胞中pEGFP-hSesn3蛋白主要定位于细胞质,终成功纯化了hSesn3蛋白.
关键词： hSesn3 Westernblot 绿色荧光蛋白 质粒构建 -
3*Flag-hPlk4真核表达载体的构建及其在骨肉瘤细胞中的表达和定位
目的:构建3*Flag-hPlk4真核表达载体,并证实重组表达载体在骨肉瘤细胞内的表达及定位.方法:以pGEX-4T-2-hPlk4为模板,利用聚合酶链反应扩增hPlk4基因cDNA全长,并将其克隆至含有3*Flag标签的真核表达载体中.进一步将构建的重组载体进行双酶切和测序鉴定,并转染到U2OS骨肉瘤细胞中,Western blot检测重组蛋白的表达.同时利用共聚焦激光显微镜观察3*Flag-hPlk4表达载体在U2OS细胞中的定位,进一步利用免疫沉淀的方法纯化人源Plk4蛋白.结果:hPlk4基因cDNA全长成功构建到3*Flag真核表达载体中,Western blot检测到含有3*Flag的人源Plk4融合蛋白表达,进一步在U2OS骨肉瘤细胞中主要定位于细胞质和细胞核周,并成功纯化hPlk4蛋白.结论:成功构建了3*Flag-hPlk4真核表达质粒,同时鉴定了融合蛋白的表达,并成功纯化人源Plk4蛋白.3*Flag-hPlk4蛋白主要定位在细胞质和细胞核周.
关键词： hPlk4 Westernblot 免疫沉淀 骨肉瘤 -
氩离子激光光凝前后糖尿病大鼠眼内组织中色素上皮衍生因子的表达
目的:观察氩离子激光视网膜光凝后糖尿病大鼠眼玻璃体及视网膜组织内色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor, PEDF)蛋白质表达的变化.方法:选用先天性糖尿病GK大鼠20只,对所有大鼠左眼施行氩离子激光视网膜光凝,右眼不进行光凝,作为自体对照.激光光凝后3d处死动物,取出眼球, Western Blot和免疫组织化学染色检测玻璃体和视网膜组织中PEDF蛋白质表达的变化.结果:氩离子激光视网膜光凝后糖尿病大鼠玻璃体和视网膜中PEDF蛋白的表达均明显升高(P<0.01);且PEDF蛋白主要存在于RPE细胞层、光感受器细胞层、外核层和神经节细胞层,内核层表达的强度低于上述4层.结论:氩离子激光光凝可以上调糖尿病大鼠玻璃体和视网膜组织PEDF表达,抑制新生血管形成,达到治疗的目的.
关键词： 糖尿病视网膜病变 色素上皮衍生因子 激光凝固术 Westernblot 免疫组化 -
L-NAME对肝硬化大鼠胃肠道中一氧化氮合酶亚型表达的影响
目的研究一氧化氮合酶亚型（NOS1，NOS2，NOS3）在肝硬化大鼠胃肠道中的表达，并探讨NOS抑制剂左旋硝基精氨酸甲基酯（L-NAME）对其表达的影响. 方法制作大鼠四氯化碳中毒肝硬化模型，肝硬化模型大鼠随机分为NO合酶（NOS）抑制剂治疗组和未治疗组，模型治疗组用L-NAME 0.5 mg*kg-1*d-1，胃内注入,每日1次，治疗10 d. 免疫组织化学染色显示胃肠道组织中各型NOS的染色强度和分布，Western blot法检测胃肠道组织中各型NOS的表达. 结果模型组大鼠胃、小肠、结肠组织中的NOS染色强度显著弱于正常对照组和L-NAME治疗组大鼠. Western blot显示在肝硬化模型大鼠胃、小肠、结肠组织中的各型NOS表达均明显降低，L-NAME治疗后又恢复至接近正常. 结论肝硬化大鼠胃肠道组织中各型NOS的表达明显减少，L-NAME对其表达有调节作用.
关键词： 大鼠 肝硬化 一氧化氮合酶 免疫组织化学 Westernblot -
CK20单克隆抗体的制备及鉴定
0 引言研究CK20表达用于诊断和评估膀胱肿瘤,已成为国内外研究热点之一. 但目前国内的抗CK20 mAb一直依赖进口,价格昂贵且不便运输,严重影响其推广应用和研究. 我们于2002年成功地从膀胱癌T24细胞系中提取CK20抗原[1],我们采用CK20抗原通过杂交瘤技术制备抗CK20 mAb,为进一步研制CK20 mAb胶体金试剂盒筛查膀胱癌奠定基础.
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shRNA干扰LGR5对HeLa细胞增殖及耐药性的影响
目的 探讨富含亮氨酸重复序列G-蛋白偶联受体5(LGR5)基因在HeLa细胞增殖及耐药性中的作用及可能机制.方法 采用shRNA技术干扰LGR5表达,构建LGR5干扰(shLGR5)的HeLa细胞,并设对照组(shCon).采用细胞计数、平板克隆以及MTT实验观察shLGR5对HeLa细胞增殖及耐药性的影响;采用Western blot检测LGR5、β-catenin在HeLa细胞中的表达.结果 成功构建了LGR5干扰的HeLa细胞系;与shCon组相比,shLGR5组细胞生长速度及克隆形成率明显降低,差异具有统计学意义(P<0.01);shLGR5组与shCon组HeLa细胞对顺铂的耐药性差异亦具有统计学意义(P<0.01);且干扰LGR5抑制HeLa细胞中β-catenin蛋白的表达.结论 LGR5基因在HeLa细胞增殖及耐药性中有重要作用,且与Wnt/β-catenin通路有关.
