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四种食源性致病菌多重PCR检测方法的建立
目的 建立一种多重PCR检测方法同时检测食品中沙门菌、志贺菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌.方法 参考沙门菌侵袭蛋白A(invA)基因序列,志贺菌侵袭性质粒抗原(ipaH)基因序列,金黄色葡萄球菌引物设计参考耐热核酸酶(nuc)基因序列,单增李斯特菌引物设计参考溶血素蛋白(hly)基因序列设计引物,通过多重PCR对4种食源性致病菌的目的基因进行扩增,并对反应体系进行优化.结果 对15株目标菌和17株非目标菌的检测未出现假阳性和假阴性结果,产物分子量与预期一致;4种菌的检测灵敏度分别至少达到10pg/μ1;对产物的测序分析表明所得序列与目的基因序列吻合;对319份样品的检测结果显示,其中4份生鲜乳中检出金黄色葡萄球菌,1份生猪肉中检出沙门菌.结论 该方法具有良好的检测特异性,可供食源性致病菌的快速检测.
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2002～2004年衢州市食源性致病菌监测
为了解衢州市食品中食源性致病菌的污染状况,为制定食源性致病菌的预防措施提供依据.2002～2004年对衢州市市区菜市场、超市的食品进行了大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌(以下简称单增李斯特菌)、金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌等五种致病菌的监测.现将结果报告如下.
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2002-2015年北京市顺义区市售食品中食源性致病菌污染状况
目的 掌握北京市顺义区市售食品中常见致病菌污染现状,确定高危食品,为预防和控制食源性疾病的发生提供依据.方法 依据2002-2015《全国食源性致病菌监测工作手册》中的方法进行采样、实验室检测等内容.结果 2002-2015年共采集顺义区的农贸市场、餐饮单位、超市、集体食堂、食品生产企业、养殖厂6类监测点,38类食品样品共计3287件,针对不同类别食品进行金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、沙门菌、副溶血性弧菌、弯曲菌、创伤弧菌、蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌、铜绿假单胞菌、致泻大肠埃希菌和肠出血性大肠(EHEC) O157:H7的污染情况监测,共检出致病菌194株,检出率为5.9％.其中金黄色葡萄球菌95株、单核细胞增生李斯特菌84株、沙门菌8株、副溶血性弧菌7株,其他致病菌均未检出.非即食食品中的致病菌检出率高于即食食品(x2=204.5,P=0.000),不同类别即食食品与非即食食品中的致病菌检出率差异有统计学意义(x2=29.944,P=0.001;x2=23.334,P=0.001).从不同类别食品中致病菌检出结果来看,即食食品炝拌菜中的金黄色葡萄球菌和熟肉制品中的单核细胞增生李斯特菌检出率高,分别为4.5％和3.4％,较其他即食食品致病菌检出率差异有统计学意义(x2=6.046,P=0.014;x2=17.573,P=0.000).非即食食品生乳中的金黄色葡萄球菌和生禽畜肉的单核细胞增生李斯特菌检出率高,分别为25.1％(x2 =74.406,P=0.000)和11.5％ (x2=25.819,P=0.000).结论 在监测的样品中,炝拌菜和生乳中的金黄色葡萄球菌,熟肉制品和生禽畜肉中的单核细胞增生李斯特菌是北京市顺义区市售食品中主要污染菌种,可能导致较高的食源性疾病风险.
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2014年中国15省(自治区、直辖市)市售生畜肉中常见食源性致病菌污染状况研究
目的 了解中国市售生畜肉中常见食源性致病菌的污染状况.方法 2014年在中国15个省(自治区、直辖市)采集生畜肉4308份,按照食品安全国家标准方法检测金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌和沙门菌.结果 沙门茵检出率为7.50％ (323/4308),猪肉检出率高于牛羊肉,血清型主要是德尔卑沙门菌和鼠伤寒沙门菌.单核细胞增生李斯特菌的检出率为8.84％(381/4308),超市和餐饮店的检出率高于农贸市场,冻畜肉和冷却畜肉的检出率高于鲜畜肉.金黄色葡萄球菌的检出率为12.21％ (526/4308),94.30％(494/526)的阳性样品≤103 CFU/g.3种致病菌在第二、三季度的检出率均高于第一、四季度.结论 中国生畜肉中致病菌检出率较高,通过交叉污染导致食源性疾病的可能性较大,需加以重视.
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2014年中国市售冷冻鱼糜制品中常见食源性致病菌污染状况
目的 了解中国市售冷冻鱼糜制品中常见食源性致病菌的污染状况.方法 2014年在全国15个省(自治区/直辖市)采集不同种类的冷冻鱼糜制品1715份,按照食品安全国家标准方法检测单核细胞增生李斯特菌、副溶血性弧菌和沙门菌.结果 冷冻鱼糜制品中单核细胞增生李斯特菌的检出率3.67%,副溶血性弧菌0.87%,沙门菌0.58%,3种菌的总体检出率为5.13%;散装产品致病菌的检出率高于预包装产品(P＜0.01);采自农贸市场和餐饮店的样品的检出率高于超市等其他采样地点(P＜0.01);第三季度的检出率高于其他季度(P＜0.05).结论 中国市售冷冻鱼糜制品中存在致病菌的污染.
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2014年中国部分省市外卖盒饭中微生物污染状况调查
目的 了解城市外卖盒饭的微生物污染状况.方法 从中国16个省份的餐饮环节,以随机抽样的方式采集外卖盒饭样品,开展大肠埃希菌和常见食源性致病菌的检测,并对结果进行分析.结果 共检测2004份外卖盒饭,大肠埃希菌不满意率为17.22％,食源性致病菌不满意率为3.44％,金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌的不满意率高于沙门菌和蜡样芽胞杆菌.从采样地点分析,采自快餐店的样品卫生状况差于采自餐馆的样品.从采样季度分析,大肠埃希菌不满意率呈明显的季节性.但食源性致病菌不满意率在不同采样地点、不同采样季度间的差异无统计学意义.结论 外卖盒饭整体卫生质量欠佳,在提高餐饮配送单位自身管理水平和卫生意识的同时,应在重点场所、重点时段加强卫生监管,对消费者进行食品安全教育.
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2015年上海浦东新区市售水产品中食源性致病菌污染情况
目的 了解上海浦东地区市售水产品中食源性致病菌的污染情况,为食源性疾病的预防和控制提供依据.方法 对2015年1-12月浦东新区连续监测的501件水产品中7种食源性致病菌监测数据进行整理分析.结果 501份水产品样本中7种食源性致病菌的总体检出率为32.9％(165/501).检出率位于前三位的依次是副溶血性弧菌(31.1％)、单核细胞增生李斯特菌(2.2％)和沙门菌(0.4％).市售水产品中食源性致病菌的检出率存在明显的季节性,8-11月份相对较高.淡水产品中食源性致病菌的总体检出率明显高于海水产品(45.6％ vs 16.5％),差异有统计学意义(x2=72.040,P＜0.001).结论 浦东新区市售水产品中存在一定程度的食源性致病菌污染,尤其是夏季更为严重,其中副溶血性弧菌依然是主要的致病菌.
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安徽沿江口岸水体中食源性致病菌的检测
目的 调查安徽省5个沿江口岸水体中食源性致病菌污染情况.方法 采集安徽省5个沿江口岸不同季节的水样,经过液体培养基增殖后接种不同的显色平板,然后挑取平板上的优势菌落菌进行革兰氏染色后用全自动微生物分析系统进行鉴定.结果 所采集的水样中未发现金黄色葡萄球菌、沙门菌、志贺菌、单核细胞增生李斯特菌、霍乱弧菌,但是我们通过分离鉴定发现26种条件致病菌,并且进行地区性和季节性差异的分析.结论 建立安徽沿江口岸水体条件致病菌资源库,为今后口岸卫生监督提供依据.
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多重PCR检测13种金黄色葡萄球菌肠毒素基因方法的建立及应用
目的 建立快速检测13种金黄色葡萄球菌肠毒素(Staphylococcusal enterotoxin,SE)的多重PCR方法,了解食源性SE的分布状况.方法 设计13种SE基因的引物,建立单重PCR方法,测序验证引物特异性;优化多重PCR方法,检测144株食源性金黄色葡萄球菌的13种SE基因.结果 建立的多重PCR方法特异、高效,13种SE基因在144株食源性金黄色葡萄球菌中的检出率由高到低依次为SEA(39.58％)、SEU(25.69％)、SEG(22.22％)、SEB (21.52％)、SEM (20.83％)、SEK(20.14％) SEQ(18.06％)、SEH(15.97％)、SEC (13.89％)、SEN(10.42％)、SEJ (8.33％)、SED (8.33％)、SEL(5.56％);65.97％的菌株至少含有13种SE基因中的1种,45.14％的菌株含有2种或2种以上SE基因.结论 建立的多重PCR方法特异性高,快速简便,可用于SE基因的检测.
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食源性致病菌在进口葡萄酒中的存活状况初探
目的 了解志贺菌、沙门菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、大肠杆菌O157∶H7、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌在进口葡萄酒中的存活状况.方法 按GB 4789.2-2010平板计数法检测.结果 金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特氏菌能用平板计数法检出,其他细菌不能检出.结论 本实验提示改进目前葡萄酒中致病菌的检测技术,减少食品安全风险.
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某地区2010-2011年各类食品细菌污染状况分析
目的:了解某地区食品细菌污染状况.方法:根据《重庆市食品安全风险监测工作手册》要求,对2010年8月至2011年10月某地区82家市售食品经营单位肉与肉制品、蛋制品、速冻熟制米面制品、豆制品、动物性水产品等九类食品监测资料进行收集整理分析.结果:某地区2010年月8月至2011年10月共监测食品样266件,合格率为58.27％(155/266)；检测出细菌学指标超标不合格食品样73件,不合格率为27.44％(73/266)；检测出食源性致病菌食品样38件,检出率为14.29％(38/266).结论:某地区市售食品合格率低,部分食品存在安全风险和隐患.建议相关部门要加大食品安全执法力度,切实搞好市售食品监督管理,强化人们健康意识和自我保护能力,消除食品污染对人体的危害,防止食源性疾病与食物中毒发生.
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环介导等温扩增技术在农村食源性致病菌检测中的应用分析
环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是近年建立起来的一种分子生物学检测技术.该文针对LAMP技术在农村食源性致病菌检测中的应用进行研究,旨在为农村食品安全检测建立灵敏高、快速、可视化的现场检测新技术.
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2014年绍兴柯桥区食源性致病菌监测分析
目的:了解柯桥区食品中微生物污染状况,为开展食品安全风险评估提供科学依据.方法:采集7类共158份食品,对其进行6种食源性致病菌和2个卫生学指标的监测分析.结果:食源性致病菌总体检出率为12.66％(20/158),其中单核细胞增生李斯特菌(5.26％)、副溶血性弧菌(18.57％)、蜡样芽孢杆菌(2.22％)和金黄色葡萄球菌(2.63％).大肠菌群检出率为41.67％,大肠菌群≥1 100 MPN/g检出率为12.50％.结论:柯桥区食品一定程度受到食源性致病菌污染,存在一定的食品安全隐患.
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椰毒假单胞菌酵米面亚种荧光标记扩增片段长度多态性分型方法的建立
目的 建立椰毒假单胞菌酵米面亚种荧光标记扩增片段长度多态性(FAFLP)分型方法,并对4株模式菌株和19株分离菌株进行分型.方法 选用4种低频限制性内切酶(ApaⅠ、EcoR Ⅰ、HindⅢ和PstⅠ)和2种高频限制性内切酶(Mse Ⅰ和Taq Ⅰ)进行组合,对FAFLP预扩增和选择性扩增体系进行优化,用BioNumerics软件对分离株的指纹图谱进行聚类分析,并与VITEK 2 GN生化结果和16S rDNA序列分析进行比较.结果 Apa Ⅰ-G/Taq Ⅰ-G组合将19株椰毒假单胞菌酵米面亚种分为7个群,菌株间低相似度为80.85％,高相似度为98.77％.PstⅠ-T/Taq Ⅰ-G组合将19株椰毒假单胞菌酵米面亚种分为10个群,菌株间低相似度为48.68％,高相似度为99.67％.两种FAFLP组合均能将菌株进行完全区分,而VITEK 2 GN和16S rDNA序列分析无法将菌株进行完全区分.结论 ApaⅠ-G/Taq Ⅰ-G组合与PstⅠ-T/Taq Ⅰ-G组合FAFLP对椰毒假单胞菌酵米面亚种具有足够的分辨率,本研究建立的FAFLP分型方法可应用于椰毒假单胞菌酵米面亚种的分子分型和溯源.
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广州市非伤寒沙门菌感染流行病学负担分析
目的 评估广州市非伤寒沙门菌感染流行病学负担,提出食源性疾病监测策略.方法 在广州市6区设9家食源性疾病主动监测医院,调查12个月腹泻病例采样率、沙门菌检测率、实验室检测敏感度,进而推算全市医疗机构相应数据;在广州市3区开展人群腹泻随机抽样入户调查,调查腹泻病例就诊率;通过传染病报告信息管理系统获得监测医院和全市医疗机构沙门菌感染性腹泻报告率;利用食源性疾病流行病学负担金字塔模型,通过倍数校正和不确定性分析估计沙门菌感染实际发病数,比较食源性疾病主、被动监测数据用于疾病负担分析的优劣.结果 监测医院12个月腹泻病例平均采样率38.34％,沙门菌检测率28.24％,实验室检测敏感皮87.5％,人群腹泻病例就诊率23.91％,沙门菌感染性腹泻报告率42.98％;全市医疗机构推算采样率38.34％,检测率28.24％,实验室检测敏感度47.5％,报告率20.94％,估计广州市沙门菌感染病例64 586例(95％ CI:44 136 ～ 101 921),年发病率508.5/10万(95％CI:347.5～802.5/10万),全年全市被动报告病例仅171例,报告年发病率1.3/10万;经估算5岁以下年龄组(3 583.2/10万)年发病率高,15 ～ 24岁年龄组(23.5/10万)低.结论 首次验证疾病负担金字塔模型在我国食源性疾病负担研究领域的适用性;表明主动监测一定程度上提升了食源性疾病尤其是特定病原体感染采样率、检测率、实验室检测敏感度和报告率,有助于对负担作出更准确和积极有效的估计;结果提示广州市非伤寒沙门菌感染负担较重,5岁以下年龄组人群负扭水平尤其显著.
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2012-2015年北京市西城区单核细胞增生李斯特菌多位点序列分型及耐药研究
目的 探讨单核细胞增生李斯特菌多位点序列分型(MLST)与耐药性的关联性,确定某些具有高致病性潜能的流行克隆株的存在.方法 采用Kirby-Bauer(K-B)纸片扩散法和E-test药敏试条法对14种抗生素进行药物敏感性试验,以MLST技术对50株菌株进行基因分型.结果 单核细胞增生李斯特菌耐药率为22.00％(11/50),并出现多重耐药株.50株单核细胞增生李斯特菌MLST分析共获得12个型别,以ST9和ST121为优势型别.结论 特定ST型别在食品生产过程中存在特定菌株之间的传递,人源性和食源性单核细胞增生李斯特菌中均发现耐药株,可能存在耐药基因的传递,应加强对具有潜在致病性的ST型别的监测力度.
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一蜡样芽胞杆菌食物中毒分离株的表型与基因型
目的 对2003年发生在云南的一起蜡样芽胞杆菌呕吐型食物中毒案例中的分离株YN0303进行表型和基因型分析研究.方法 采用16S rDNA序列分析和16S/23S rDNA ITS特征图谱分析结合形态、生理生化和基因型进行菌种鉴定;PCR检测呕吐毒素和肠毒素合成相关基因,高效液相和质谱联用(HPLC-MS)化学定量分析呕吐毒素合成情况,测试部分生理生化特性和生长温度范围,进行了panC分型和多位点序列分型(multilocus sequence typing,MI() .结果 确认了该菌株确为蜡样芽胞杆菌Bacillus cereus,虽然该食物中毒是典型的呕吐型案例,但是发现该分离株呕吐毒素相关合成基因ces呈阴性,呕吐毒素化学定量分析结果为阴性;其生理生化特性(水杨苷发酵、淀粉水解和溶血特性)与典型呕吐型菌株也不相同.panC分型并非呕吐型蜡样芽胞杆菌所属的Ⅲ型,而是属于细胞毒性强的Ⅳ型,而且其肠毒素基因hbl、nhe和cytK2也均呈阳性;多位点序列分析显示该菌是一个新型别ST753,是区域性相对独立进化菌株.结论 在该呕吐型食物中毒案例中可能有多个蜡样芽胞杆菌参与,该分离株YN0303并非主要致病株—呕吐型菌株,但可能作为细胞毒性强的菌株参与了共感染.
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2003-2010年山东省食源性沙门菌血清分型及药敏分析
目的 了解2003-2010年山东省食源性沙门菌的血清型分布及耐药情况,为制定政策提供科学依据.方法 根据GB/T 4789-2008《食品卫生微生物学检验》方法进行沙门菌菌种鉴定和血清分型；采用临床实验室标准研究所(CLSI)推荐的微量肉汤稀释法进行药物敏感性试验和结果判读,确定耐药表型.结果 120株确定血清型沙门菌分属5个群(8个亚群)24个血清型,肠炎和德比沙门菌为常见血清型.胥瓦增格隆、维也纳、布里丹、明斯特、乌赫利等9种血清型为2010年首次检出血清型.126株沙门菌对14种抗生素均有不同程度的耐药,萘啶酮酸的耐药率高(61.90％),其次为四环素(33.33％)、氨苄青霉素(31.75％)、磺胺嘧啶(26.19％)；而敏感性以头孢吡肟高(5.37％),其次是阿米卡星(9.52％)、环丙沙星(10.32％).结论 山东省食源性沙门菌耐药形势严峻,应加强畜牧养殖业中抗生素使用的管理,从食物链的源头和动物食品生产过程中采取合理的干预措施,保障食品安全.
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高通量测序法对7种发酵豆腐细菌组成的比较研究
目的 研究不同发酵豆腐的细菌菌群组成,了解此类产品的食品安全风险.方法 从市场收集4个省份生产的7个品牌的发酵豆腐样品,并从中提取DNA,对16S rRNA基因的V3区进行PCR扩增,通过高通量测序和序列分析了解样品的细菌组成特征.结果 各样品获得序列数平均为4 307条.序列分析结果表明7种样品中厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门和梭杆菌门约占全部细菌的97.4％;各样品在门水平上为4～13类,在属水平上,样品的菌群组成复杂,大多数样品的细菌菌属都在10类以上,并发现样品的菌群组成与地域性和制作工艺密切相关;另外,部分样品检出较高丰度的克雷伯菌属、沙门菌属、克罗诺杆菌属等致病菌,及弧菌属、肠杆菌属和变形杆菌属等潜在有害菌属.结论 产地和工艺对豆腐中的细菌具有明显的影响,现有发酵豆腐的生产模式造成产品病原菌的过度繁殖,产品存在食品安全风险.
关键词： 发酵豆腐 16S rRNA基因测序 食源性致病菌 食品安全 -
江苏及周边地区副溶血性弧菌分子流行病学特征研究
目的 了解江苏及周边地区副溶血性弧菌的分子流行病学特征.方法 对2010年江苏及周边地区食物中毒事件中分离的、经API生化鉴定的63株副溶血性弧菌进行毒力基因(tdh、trh)测定、血清学分型和脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型.结果 tdh阳性率79.4％ (50/63),trh阳性率1.6％ (1/63)；病人株血清型以O3∶K6为主(26/57),食品株以O1∶KUT为主(4/6)；PFGE分型显示A-E群间相似度大于60％.结论 江苏及周边地区中不同地区的副溶血性弧菌具有高度同源性,该地区副溶血性弧菌引起的食物中毒可能具有相同的污染源.
