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乳腺癌细胞系 HCC1937和 MCF7在 DNA损伤修复反应时功能的比较
目的：通过比较DNA损伤修复基因乳腺癌易感基因1（ breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1）和抑癌基因p53在HCC1937和MCF7两种乳腺癌细胞系中的功能状态及对DNA损伤修复反应的应答特性，研究两种细胞系在功能上的差异。方法应用western-blotting法检测两种乳腺癌细胞系中BRCA1和p53蛋白的表达，并检测了经过10 Gy电离辐射下1、4、8 h后BRCA1蛋白在MCF7、HCC1937和HCC1937野生型BRCA1（HCC1937 wtBRCA1）细胞系中的表达水平。同时用免疫荧光法观察BRCA1蛋白在MCF7和HCC1937细胞系细胞内的分布和焦点形成情况，并对电离辐射下的BRCA1、Rad51蛋白的焦点形成百分比进行计算。进一步用流式细胞仪检测两种细胞系的细胞周期变化。结果 MCF7细胞中野生型的BRCA1和p53主要分布于细胞核内，这两种蛋白对DNA损伤反应有应答。10 Gy 8 h照射条件下，MCF7细胞系中BRCA1蛋白焦点形成百分比较无电离辐射高[（59.40±3.66）％比（11.80±3.51）％，t＝16.26，P＜0.05]；MCF7细胞系照射组中Rad51蛋白焦点形成百分比较无电离辐射高[（73.90±8.66）％比（16.70±3.76）％，t＝10.49，P＜0.05]，照射组p53蛋白[（82.54±1.04）比（23.75±0.51），t＝87.90，P＜0.05]和p21蛋白[（90.95±1.13）比（50.19±0.89），t＝49.11，P＜0.05]表达水平均较无电离辐射高，细胞在G1期蓄积。与MCF7细胞相比，在HCC1937细胞中的BRCA1和p53都产生了变异，在细胞核内两种蛋白较少。10 Gy 8 h照射条件下HCC1937细胞中无BRCA1蛋白焦点形成、p53和p21几乎无诱导表达以及细胞在G1和G2-M期无明显的蓄积。当恢复野生型BRCA1在HCC1937细胞内表达后，10 Gy 8 h照射条件下Rad51蛋白焦点形成百分比较无电离辐射高[（61.70±4.03）％比（6.22±2.27）％，t＝20.78，P＜0.05]，细胞在G2-M期的蓄积增多。结论乳腺癌细胞系HCC1937和MCF7在应答DNA损伤修复反应时具有不同的功能特性。
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熟地等4味中药的植物雌激素作用的实验研究
目的:观察熟地黄、白芍、当归、川芎等中药对性未成熟SD大鼠子宫系数的影响,以及含药血清对人乳腺癌MCF7细胞体外增殖的影响,评价其植物雌激素样作用.方法:正常雌性性未成熟SD大鼠,体重(70±5)g,按体重均衡和随机的原则分为7组(正常对照、己烯雌酚、熟地黄、白芍、当归、川芎和四物汤组),分别每天分早、晚2次灌胃,给药均持续4 d,第5天腹主动脉取血,分离血清,分离子宫并称重,免疫组化法测定子宫组织雌激素受体表达量;药物血清用于MCF7细胞体外增殖,细胞周期和雌激素受体ERα蛋白表达的测定.结果:熟地黄、白芍和当归组的幼鼠子宫系数均高于正常对照组(P＜0.05);川芎组幼鼠子宫系数与正常对照组相比,差异无统计学意义;白芍、当归、川芎的含药血清均可显著促进MCF7细胞MTT体外增殖(P＜0.05),并且4味中药的药物血清均能使MCF7细胞S期细胞数和细胞增殖指数PI增加(P＜0.01),当归和川芎可提高MCF7细胞ERα蛋白的表达水平(P＜0.05),熟地黄和白芍的药物血清对MCF7细胞的ERα蛋白表达水平,与正常对照组相比,差异无统计学意义.结论:熟地黄、白芍和当归等中药的免煎剂有植物雌激素样作用,川芎组整体实验和体外细胞培养结果不完全一致,已烯雌酚在本实验剂量时有使幼鼠体重增长减缓的作用,而实验剂量的中药未表现出此样作用.
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腺病毒介导PKM2 RNAi对MCF7细胞影响的研究
目的 丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)是糖酵解的关键酶之一,其M2型同工酶(PKM2)高表达于乳腺癌等肿瘤中.本研究探讨PKM2 RNAi对乳腺癌细胞MCF7系增殖、ATP产生、侵袭和细胞粘附能力的影响及其可能机制.方法 通过介导PKM2 shRNA构建重组腺病毒Ad-PKM2,用以感染人乳腺癌细胞系MCF7.病毒感染细胞24和48h后,收集细胞总蛋白行免疫印迹实验检测基因沉默的效果,CCK-8实验检测细胞增殖和粘附能力,Transwell实验检测细胞穿透人工基底膜能力,采用JC-1探针观察细胞线粒体活性并用试剂盒检测细胞ATP含量.结果 免疫印迹结果表明,腺病毒成功介导MCF7细胞发生PKM2 RNAi.病毒感染后细胞的增殖能力被抑制41.0％,P＜0.05.穿过人工基底膜的细胞减少50.2％;细胞的粘附能力下降34.7％,P＜0.05;细胞内的ATP含量从正常的90 μmol/L下降至68.3μmol/L(P＜0.05),而细胞线粒体活性并未受明显影响.结论 在乳腺癌MCF7细胞中,抑制PKM2蛋白的表达可有效抑制细胞的增殖、侵袭和粘附能力,其机制可能是减少了细胞的ATP能量供应.
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DN-hTERT对MCF7细胞端粒酶活性及细胞生长的抑制作用
目的:观察端粒酶逆转录酶负突变体(DN-hTERT)对乳腺癌细胞MCF7端粒酶活性和恶性表型的抑制作用.方法:将带DN-hTERT基因的真核表达载体(DN-hTERT-IRES2-EGFP,DN)、IRES2-EGFP空载体(Ⅰ)通过脂质体2000(lipofectamine2000)介导转入MCF7细胞,以G418进行稳定筛选,得到阳性克隆;倒置荧光显微镜观察转染细胞的生长情况;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染细胞hTERTmRNA的表达;TRAP-ELISA方法检测转染细胞端粒酶活性;流式荧光原位杂交法(FLOW-FISH)检测转染细胞端粒长度的变化;裸鼠肿瘤细胞移植观察转染细胞动物致瘤率.结果:MCF7细胞转染DN-hTERT后生长受到抑制;转染DN-hTERT的MCF7细胞(MCF7/DN)hTERT mRNA表达升高;TRAP-ELISA检测MCF7/DN细胞端粒酶活性(2.36±0.12)与转染空载体MCF7细胞(MCF7/I)(3.32±0.14)比较显著降低(P＜0.05);反应端粒长度的荧光强度差比较中,MCF7/DN细胞(13.89±0.23)比MCF7/I(19.87±0.36)低,转染DN端粒长度出现缩短;裸鼠肿瘤细胞移植,2周动物致瘤率MCF7/DN为0,与MCF7/I的35%比较有极显著意义(P＜0.01).结论:DN-hTERT能特异性抑制MCF7细胞生长和端粒酶活性.
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利用CRISPR/Cas9系统构建PCGF1基因敲除MCF7稳定细胞系
[目的]构建PCGF1 (Polycomb Group Ring Finger 1)基因敲除的MCF-7稳定细胞系.[方法]以PCGF1序列为模板,设计sgRNA干扰序列,两端加入载体连接序列.通过DNA片段合成所需sgRNA序列.退火形成oligo二聚体序列后,使用T4 DNA连接酶重组干扰序列与pCAG-T7-Cas9-pgk-Puro-T2A-GFP质粒.测序鉴定后,将pCAG-T7-Cas9-gRNA-pgk-Puro-T2A-GFP重组载体通过脂质体转染MCF7细胞系.通过嘌呤霉素进行阳性克隆筛选,Western blotting检测PCGF1表达.[结果]测序结果显示构建的重组载体序列正确.转染筛选后,western blotting验证构建的MCF7细胞系PCGF1表达明显降低.[结论]利用pCAG-T7-Cas9-pgk-Puro-T2A-GFP质粒,成功构建PCGF1敲低载体.转染MCF7细胞系,通过嘌呤霉素筛选和westernblotting验证得到PCGF1稳定敲低的MCF7细胞系.
关键词： 乳腺癌 MCF7 PCGF1 CRISPR/Cas9 -
5-氟尿嘧啶对乳腺癌MCF7细胞中干细胞相关基因Oct4、Bmi-1表达的影响
背景:国内外研究证明乳腺癌干细胞可能是起始乳腺癌生长及辅助治疗后复发和远处转移的根源.目的:观察5-氟尿嘧啶对人乳腺癌MCF7 细胞Oct4、Bmi-1 表达的影响.方法:应用0.1 mg/L 5-氟尿嘧啶处理MCF7,RT-PCR检测处理前G0及处理后6 代细胞G1~G6中Oct4、Bmi-1 mRNA的表达,免疫细胞化学检测处理前G0、G1~G5中Oct4 的表达.结果与结论:5-氟尿嘧啶处理后,Oct4、Bmi-1 mRNA表达水平在G3和G5均较处理前明显增高,OCT4 蛋白表达呈现出降低-升高-更高-降低-升高的趋势.提示MCF7 中可能存在肿瘤干细胞样细胞;5-氟尿嘧啶可能诱导MCF7 中肿瘤干细胞样细胞的数量或比例增加.
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Cdc42小干扰 RNA对乳腺癌 MCF7细胞增殖的影响
目的：观察细胞周期分裂蛋白Cell division cycle 42（ Cdc42）小干扰RNA （ siRNA）对人乳腺癌细胞增殖的影响。方法设计并合成靶向Cdc42编码区的siRNA，将其瞬时转染至MCF7细胞中。48 h后应用RT－PCR和Western－blot分别检测细胞转染siRNA后Cdc42 mRNA及蛋白的表达。 CCK8及饱和密度实验检测Cdc42小干扰RNA对MCF7细胞增殖能力的影响。结果 RT－PCR和Western－blot检测显示Cdc42－siRNA能显著下调MCF7细胞中Cdc42 mRNA及其蛋白表达水平。 Cdc42－siRNA转染后MCF7细胞增殖能力受到明显抑制。结论 Cdc42小干扰RNA可以有效抑制MCF7细胞的增殖能力，提示Cdc42可能成为抑制乳腺癌MCF7细胞增殖的新靶点。
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人参二醇皂甙抑制人乳腺癌细胞增殖的实验研究
目的 观察人参二醇组皂苷(PDS)对人乳腺癌细胞MCF7的抑制作用.方法 观察PDS作用后MCF7细胞的形态学改变;利用MTT法检测PDS作用后MCF7细胞的生长抑制率.结果 PDS作用后的MCF7细胞生长状态变差,细胞变圆漂浮在培养液中;MTT结果显示:细胞生长明显受到抑制,72 h生长抑制率可达到80.6%;且生长抑制率呈时间依赖性和剂量依赖性.结论 PDS对人乳腺癌细胞MCF7有抑制作用.
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Smad蛋白在乳腺癌和正常乳腺上皮细胞中的表达及意义
目的:检测TGFβ1、TGFβ受体Ⅱ及其下游Smad调节因子等基因在乳腺癌和正常乳腺上皮细胞中的表达,探讨TGFβ在乳腺癌发展过程中发挥作用的分子机制.方法:分离纯化人正常乳腺上皮细胞,应用RT-PCR检测乳腺癌细胞系MCF7及正常乳腺上皮细胞中TGFβ1、TGFβ受体Ⅱ、Smad4、Smad6、Smad7的表达.结果:TGFβ1、TGFβ受体Ⅱ、Smad6、Smad7与内参照GAPDH比值在正常乳腺上皮细胞中(0.721±0.214、1.001±0.312、0.689±0.12和0.221±0.124)与MCF7细胞(0.698±0.324、0.998±0.217、0.718±0.257;0.246±0.138)比较表达水平差异无显著性,Smad4在乳腺癌细胞中的表达水平(0.498±0.221)低于正常乳腺上皮细胞(1.132±0.314)(P＜0.05).结论:Smad4在乳腺癌细胞中的低表达可能与TGFβ对乳腺癌的促癌作用有关联.
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5-氮杂脱氧胞苷对MCF7细胞中MEG3基因表达及细胞增殖活性的影响
背景与目的:MEG3(maternal expressed gene 3)基因是一类印记基因,其转录缺失可能诱导多种肿瘤的发生发展.本研究通过检测乳腺癌MCF7细胞中MEG3基因mRNA的转录情况及细胞增殖活性,以探讨DNA甲基化抑制剂5-氮杂脱氧胞苷对MEG3基因转录的诱导作用及其对细胞增殖活性的影响.方法:以浓度为5 μmol/L的5-氮杂脱氧胞苷分别作用MCF7细胞0、2、4和6 d后,用RT-PCR及Northern blot技术检测MEG3基因mRNA的转录水平;用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖活性的变化.结果:与未处理组相比,5-氮杂脱氧胞苷分别作用2、4和6 d后,MCF7细胞中MEG3基因mRNA表达显著增强,并呈现时间依赖性(P<0.01);MTT检测结果显示MCF7细胞的增殖活性受到抑制.与未处理组相比,药物作用2、4和6 d的细胞增殖抑制率分别为(23.16±3.93)%、(49.39±2.38)%和(64.73±2.24)%,差异有显著性(P<0.01).结论:MEG3基因可能具有抑制MCF7细胞生长的作用,其基因转录下调与DNA甲基化有关,可能参与了乳腺癌的发病机制.
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川芎嗪对乳腺癌MCF7细胞凋亡的影响及机制研究
目的 观察川芎嗪(TMP)对乳腺癌MCF7细胞株凋亡的影响及其可能的机制.方法 建立乳腺癌MCF7细胞体外培养体系.MTT法检测不同浓度TMP对乳腺癌MCF7细胞增殖的影响,流式细胞仪、电子显微镜和免疫印迹法分别检测各组细胞凋亡比例,观察细胞凋亡特征,检测MAPK信号通路相关基因如ERK、p38和JNK表达水平.结果 予0.25、0.50、1.00、1.50、2.00mg/mL TMP处理48h后,MCF7细胞抑制率分别为(2.95±2.45)%、(18.62±4.60)%、(31.15±3.58)%、(47.13± 4.15)%和(62.14±5.23)%;0、0.50、1.00、1.50、2.00mg/mL的TMP处理48h, MCF7细胞凋亡率分别为1.58%、3.29%、13.21%、19.23%、29.38%,形态学观察显示典型的凋亡特征.TMP处理后细胞中p-p38和p-JNK蛋白表达以剂量依赖的方式增加,而p-ERK以剂量依赖的方式减少.结论 TMP能诱导乳腺癌MCF7细胞凋亡,其机制可能与激活MAPK信号通路有关.
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人血白蛋白增强顺铂对MCF7细胞的耐药作用
[目的]探讨人血清白蛋白(HSA)联用顺铂(DDP)对MCF7细胞耐药的影响.[方法]不同浓度DDP干预MCF7细胞72h,CCK8检验细胞增殖抑制率.选用DDP的IC50浓度分别与10、20μmol/L HSA联用,进一步检测联合用药对MCF7细胞的增殖抑制率.样品分为空白对照组、顺铂组、HSA组、顺铂联合HSA治疗组(10或20μmol/L).各组处理MCF7细胞72h,实时荧光定量PCR (qRT-PCR)和免疫印迹法检测ERCCI mRNA和蛋白表达.[结果]DDP联用10或20μmol/LHSA对MCF7的增殖抑制率分别为(50.97±1.50)％、(45.15±2.10)％,单独用药组DDP对MCF7的增殖抑制率为(55.60±5.20)％.qRT-PCR和Western blot检测表明DDP联用HSA (20μmol/L)显著增强ERCCl mRNA和蛋白的表达.[结论]DDP联合使用高浓度HSA可通过上调ERCC1表达诱导化疗药物耐药.
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Hint2促进乳腺癌细胞株MCF7对紫杉醇注射液的敏感性
目的 探讨高表达三联组氨酸核苷酸结合蛋白2 (Hint2)增强人乳腺癌细胞株MCF7对紫杉醇注射液敏感性的影响.方法 构建高表达Hint2的载体pCMV-HA-Hint2并转染MCF7细胞,通过免疫荧光和Western blot方法检测Hint2的表达,采用噻唑蓝(MTT)法检测高表达Hint2后MCF7细胞对紫杉醇注射液的敏感性,采用流式细胞AnnexinV方法检测细胞凋亡.结果 pCMV-HA-Hint2转染36 h后,细胞的Hint2基因表达明显增加,5μmol·L-1的紫杉醇注射液处理24 h后,Hint2高表达组细胞活性为33.78％,而对照组细胞活性为44.12％.结论 Hint2高表达能显著增加MCF7细胞对紫杉醇注射液的敏感性.
关键词： 紫杉醇注射液 三联组氨酸核苷酸结合蛋白2 乳腺癌 MCF7 -
松针油引起人乳腺癌MCF7凋亡、自噬的机制研究
目的：探讨松针油对人乳腺癌细胞（MCF7）影响及可能损伤、凋亡及自噬的机制。方法：用不同浓度的松针油处理MCF7细胞24、48及72h后观察，用噻咗蓝（MTT）比色法测定MCF7细胞生长抑制；电镜下观察细胞凋亡的形态改变；流式细胞仪测定P53的表达及荧光法测定乳腺癌细胞自噬，流式细胞仪测定细胞凋亡率及银染法（TRAP-PCR）法测定端粒酶的活性变化。结果：不同浓度下的松针油对MCF的增值均有一定的抑制作用，能诱导MCF7细胞损伤、凋亡及自噬，且与作用时间及剂量明显相关。结论：松针油可通过抑制端粒酶的活性，促进P53、LC3-II表达来诱导MCF7细胞损伤、凋亡及自噬。
