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福氏志贺菌历史菌株血清型转换的分子特征研究
目的 研究1949—1965年间出现血清型转换的福氏志贺菌的分子特征.方法 255株福氏志贺菌均来源于中国医学细菌保藏管理中心(CMCC).其中,进行血清型转换研究的20株福氏志贺菌收集自1949—1965年,分别来源于中国12株、苏联3株、捷克斯洛伐克1株、美国2株、匈牙利1株、法国1株.分别使用玻片凝集和多重PCR法进行血清分型,并进行gtrⅡ基因检测.对出现血清型转换的菌株进行gtrⅡ基因序列比对以及PFGE分型.结果 255株福氏志贺菌中,79株携带gtrⅡ基因;其中19株玻片凝集为Y血清型菌株,多重PCR法检测分别为福氏2a血清型;1株玻片凝集为X血清型,多重PCR法检测为2b血清型;20株菌株发现了血清型转换,并出现了多处位点的核酸突变,除3株菌出现了3个氨基酸突变外,其余17株菌氨基酸序列均提前出现了终止密码子,导致gtrⅡ功能性失活.PFGE分析发现,携带gtrⅡ基因的Y血清型菌株与2a血清型菌株相似性为75.8％～100％,携带gtrⅡ基因的X血清型菌株与2b血清型菌株相似性为81.6％～100％.结论 发生血清型转换的福氏Y或X血清型菌株,gtrⅡ基因出现的突变更加复杂;发生血清型转换的福氏Y或X血清型菌株可能来源于福氏2a或2b血清型,并将血清型转换出现的时间向前推进至1949年.
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儿童福氏志贺菌Ⅰ类整合子的检测及其与耐药性的关系
目的 了解儿童福氏志贺菌是否存在Ⅰ类整合子及其发生率以及与耐药性的关系.方法 对2004年6-11月从本院细菌性腹泻患儿大便培养标本分离到的福氏志贺菌共51株,应用PCR检测Ⅰ类整合子的5′保守区int Ⅰ 1、基因盒区ant(3″)-Ⅰ和3′保守区qacE△1-sul1;用K-B(Kriby-Bauer)法测定志贺菌对7种抗菌药物的敏感性.结果 51株福氏志贺菌中46株检出int Ⅰ 1,Ⅰ类整合子阳性率90.2%;24株检出qacE△1-sul1,阳性率47.1%;int Ⅰ 1、ant(3″)-Ⅰ和qacE△1-sul1区段均阳性的为22株,阳性率43.1%;46株int Ⅰ 1阳性福氏志贺菌ant(3″)-Ⅰ基因均阳性;46株intⅠ 1阳性福氏志贺菌中qacE△1-sul1同时阳性的菌株为22株,占47.8%(22/46)、qacE△1-sul1阴性的菌株24株,占52.2%(24/46).Ⅰ类整合子阳性志贺菌对多种抗生素耐药,尤其是对氨苄西林(χ2=10.13,P＜0.01)和氯霉素(χ2=19.97,P＜0.01)的耐药性明显高于Ⅰ类整合子阴性志贺菌.结论 从福氏志贺菌检出Ⅰ类整合子,携带率为90.2%;携带Ⅰ类整合子阳性志贺菌与抗生素耐药相关.
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自杀质粒同源重组方法构建弗氏志贺菌htrA可控表达菌株
目的：构建弗氏志贺菌HtrA蛋白的可控表达菌株。方法构建自杀质粒同源重组载体，利用重组方法在基因组htrA前插入阿拉伯糖启动子，同时构建并导入外源表达AraC蛋白的表达载体，实现对HtrA蛋白的可控表达；在此基础上，通过蛋白印迹实验，检测诱导前后全菌以及周质中HtrA蛋白的表达情况。结果测序结果表明，自杀质粒同源重组载体以及外源表达载体构建成功；蛋白印迹实验结果显示，对比阿拉伯糖诱导菌株，未诱导菌株中基本未检测到HtrA蛋白的表达。结论自杀质粒同源重组方式可在无阿拉伯糖时有效阻遏HtrA蛋白的表达；同时在诱导后，还可恢复HtrA蛋白的正常表达，有利于后续功能研究。
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弗氏志贺菌ΔlysA突变株的构建及SILAC技术的应用尝试
目的 构建弗氏2a志贺菌301株赖氨酸营养缺陷型突变株,为将细胞培养条件下稳定同位素标记(SILAC)技术应用于志贺菌蛋白质组学研究奠定基础.方法 采用λ-Red重组系统对弗氏2a志贺菌301株lysA基因进行缺失,对野生株和突变株进行基本的表型测评和毒力评价,并利用双向电泳技术比较二者在全菌蛋白表达谱上的差异,后将突变株分别在含有12C6-赖氨酸和13C6-赖氨酸的培养基中培养,根据双向电泳胶图取对应蛋白点进行胶内酶切及MALDI-TOF/TOF分析.结果 成功构建了301 lysA基因缺失突变株,蛋白鉴定结果显示所取对应蛋白点为同一蛋白,在质谱图上轻重同位素峰位移为6 amu.结论 本研究所构建的赖氨酸营养缺陷型突变株适合进行SILAC分析.
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弗氏志贺菌2a GadB蛋白的功能研究
目的 探究gadB基因的潜在功能及其对弗氏志贺菌2a 301株致病能力的影响.方法 利用λ-Red重组系统构建弗氏志贺菌2a 301株的gadB缺失突变株,随后进行基本的表型实验测评,并初步评价其毒力,后制备突变株和野生株全菌蛋白样品,利用双向电泳技术比较二者在蛋白表达谱上的差异.结果 成功获得gadB基因缺失株;生化实验发现缺失株不能利用甘油发酵;而豚鼠角膜实验发现突变株炎症反应稍轻于野生株;全菌蛋白表达谱中发现10个差异蛋白.结论 利用双向电泳鉴定到一些可能与GadB有关的蛋白,为gadB潜在功能的研究提供了线索.
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弗氏志贺菌2aphoN1基因功能的初步研究
目的：初步探讨phoN1基因在志贺菌属中的功能。方法使用λ-Red重组系统构建弗氏志贺菌2a 301株phoN1缺失突变株，通过比较蛋白质组学方法研究突变株与野生株的蛋白表达谱差异，并利用豚鼠角膜炎模型、HeLa细胞竞争侵袭实验评价两者之间的毒力差异。结果成功构建了phoN1缺失突变株，蛋白质学研究发现， phoN1缺失对其他胞内蛋白无显著影响，豚鼠角膜实验和HeLa细胞竞争侵袭实验证实，phoN1缺失不影响志贺菌属的侵袭能力。结论 phoN1在体外生存、侵袭宿主细胞过程中未发挥显著作用，其功能有待进一步研究。
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志贺菌rfbA基因突变体的构建
目的 构建弗氏2a志贺菌301 rfbA基因缺失突变株,初步探究志贺菌脂多糖合成与糖蛋白合成通路是否相关.方法 首先用PCR扩增出rfbA基因上下游同源臂,构建含有kan基因的打靶片段,采用λ-Red重组系统对rfbA基因进行缺失,用PCR进行初步验证,然后通过LPS的银染方法进行进一步验证.随后,制备野生株、rfbA缺失突变株的全菌蛋白样品,进行双向电泳后比较野生株301和rfbA缺失株的蛋白表达谱.结果 成功构建了301 rfbA缺失突变株.在LPS的银染实验中,rfbA突变株在凝胶中未形成一长串的梯状条带.在双向电泳实验中,野生株和突变株没有明显的蛋白差异点.结论 获得了301 rfbA基因缺失突变体,初步认为志贺菌中不存在与脂多糖O-抗原合成相关的蛋白糖基化途径.
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实验恒河猴猴群暴发细菌性痢疾的治疗及控制
目的诊断、治疗及控制我所实验恒河猴猴群暴发的细菌性痢疾.方法采集病猴直肠粪便进行实验室细菌培养、生化反应、血清型鉴定、药敏试验对病原菌进行鉴定,寻找有效的治疗药物.采用甲酚皂、优氯净等消毒液对环境、笼舍消毒的方法预防疾病的传播,及时隔离病猴、防止交叉感染和疾病的蔓延.结果猴群发病数为426只,隔离重病猴160只.鉴定病原菌为福氏志贺菌2 A型.病情轻者,采用口服诺氟沙星、黄莲素等药物,病情重者静脉滴注头孢哌酮等,取得显著治疗效果,治愈率为97.9%.结论细菌性痢疾病原菌的鉴定,正确的诊断,科学的用药方案是提高疗效的关键.与国内其它猴场相比较,治愈率提高20%以上.
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福氏志贺菌中超广谱β-内酰胺酶的基因型分析
目的 检测福氏志贺菌中超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的基因型别.方法 琼脂稀释法测定5株福氏志贺菌对多种抗菌药物的敏感性,并进行接合试验;改良三维试验检测产ESBLs菌株,同时对这些菌株进行脉冲场电泳(PFGE)检测;采用TEM、SHV、CTX-M-1组、CTX-M-2组、CTX-M-9组β-内酰胺酶通用引物以及TEM、CTX-M-9组全编码基因引物进行PCR检测,并对全编码基因PCR产物进行DNA序列分析.结果 三维试验结果显示,5株福氏志贺菌均为产ESBLs菌株,对青霉素类、第一代、第二代头孢菌素以及四环素、复方磺胺甲(噁)唑显著耐药,对第三代头孢菌素中头孢曲松、头孢噻肟耐药或中度敏感,对亚胺培南、头孢美唑、氟喹诺酮类、头孢噻肟克拉维酸、头孢他啶、头孢他啶-克拉维酸显示敏感.对于β-内酰胺类的耐药性可以通过接合方式发生水平转移;ESBLs基因型别为CTX-M-14,5株菌株的PFGE谱型可分为A、B两种谱型.结论 5株福氏志贺菌产生CTX-M-14型超广谱β-内酰胺酶,导致对多种β-内酰胺类抗生素耐药,并存在克隆传播,需加强监控.
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泛耐药弗劳地柠檬酸杆菌产β内酰胺酶及同源性
目的 研究泛耐药弗劳地柠檬酸杆菌产β内酰胺酶情况及同源性.方法 采用改良Hodge试验和乙二胺四乙酸(EDTA)协同试验筛选金属酶,等电聚焦电泳(IEF)测定产β内酰胺酶的等电点,blaTEM、blaSHV、blaCTX-M-G1～G3、blaAmpC和blaMBL等引物的聚合酶链反应(PCR)进行β内酰胺酶的基因分型,并对PCR产物进行克隆测序;脉冲场电泳对8株菌的同源性进行研究.结果 8株泛耐药弗劳地柠檬酸杆菌均产TEM-1型β内酰胺酶,CTX-M-14型超广谱β内酰胺酶(ESBLs)及IMP-8型金属酶新亚型,其中4株同时产CTX-M-3型ESBLs.未发现质粒介导的头孢菌素酶.所有菌株脉冲场电泳(PFGE)谱型相似.结论 泛耐药弗劳地柠檬酸杆菌产多种β内酰胺酶.8株泛耐药菌源自同一克隆.
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华南地区出现新型CMY型AmpCβ-内酰胺酶
目的分析多重耐药弗劳地柠檬酸杆菌29号试验菌株耐β-内酰胺抗生素的原因及耐药性的转移性.方法用双纸片扩散法和改良三相试验分析4株弗劳地柠檬酸杆菌所产β内酰胺酶,进行初步分类,再用聚合酶链反应(PCR)扩增和PCR产物测序方法确认β内酰胺酶基因.结果 29号试验菌株产CMY与DHA型AmpC型β-内酰胺酶,同时还有TEM、SHV型超广谱β内酰胺酶.DNA测序表明该基因和CMY-2有97%的同源性,为一种新的CMY型头孢菌素酶.结论 29号试验菌株耐β内酰胺抗生素的原因,可能是产生了可转移的CMY、DHA-1型AmpC及TEM、 SHV型ESBLs,基因位于质粒上.
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福氏志贺菌ipaB基因的克隆表达及免疫原性研究
构建福氏志贺菌ipaB基因的原核表达载体,诱导表达并纯化.探讨重组蛋白IpaB经口服免疫小鼠后,机体产生的免疫应答.方法:用PCR扩增ipaB目的基因,克隆至pQE-30表达载体中,转化宿主菌DH5α,经IPTG诱导表达蛋白IpaB;Western blot分析其抗原性.纯化后灌胃免疫小鼠,ELISA法检测血清IgG、IgA、小肠黏液sIgA和粪便sIgA.结果:ipaB基因全长1 743 bp.经SDS-PAGE分析相对分子量(Mr)约为64 000.Western blot分析能与福氏志贺菌全菌抗血清反应.免疫小鼠后,血清IgA、IgG,粪sIgA,肠黏液sIgA明显高于对照组(P＜0.01).结论:成功构建了ipaB基因的原核表达载体并能高效表达,纯化后口服免疫可有效诱导黏膜免疫应答,产生高水平的sIgA,发挥局部黏膜免疫作用,为进一步研究细菌性痢疾的疫苗和发病机制奠定基础.
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福氏2a志贺菌C0719 RNA基因突变体的构建
目的 构建福氏2a志贺菌301株已验证的但是功能未知的C0719基因突变体,以进行C0719 RNA功能研究.方法根据福氏2a志贺菌301株基因组全序列,采用λ-Red重组系统对C0719 RNA基因进行缺失,并经PCR验证；对野生株和C0719缺失突变株37℃时的生长曲线及生化反应进行比较研究；对野生株和5个sRNAs缺失突变株进行蛋白质组的比较研究；同时利用毒力侵袭模型来评价突变株毒力.结果 构建了C0719缺失突变株；突变株初始生长均较慢,但终和野生株状态一致；对构建成功的C0719缺失突变体进行生化特性分析,结果表明和野生株相比,301△C0719株利用棉子糖的能力比野生株强一些；对C0719缺失突变体进行了比较蛋白质组分析.结论 获得了福氏2a志贺菌301株C0719基因突变体,为深入研究sRNA基因的功能奠定了基础.
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耐碳青霉烯类弗劳地枸橼酸杆菌耐药机制及治疗策略研究
目的 探索耐碳青霉烯类弗劳地枸橼酸杆菌耐药机制及治疗对策.方法 收集来自该院的17株耐碳青霉烯类弗劳地枸橼酸杆菌临床资料,采用PCR方法扩增碳青霉烯类耐药基因;采用琼脂稀释法和肉汤稀释棋盘法测磷霉素单药及联合用药低抑菌浓度(MIC)值,计算部分抑菌浓度指数(ΣFICI).结果 8株菌产blaNDM-1,9株菌产blaIMP,blaKPC、blaoxA-48、blasPM均未检出;磷霉素联合亚胺培南协同作用和相加作用占75.oo％,其中协同作用高达56.25％,磷霉素联合头孢哌酮/舒巴坦钠协同作用和相加作用占50.oo％.结论 磷霉素联合亚胺培南或头孢哌酮/舒巴坦钠体外有较好的抗菌活性,亚胺培南联合磷霉素效果可能更好.
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分离自烧伤患者耐药弗氏柠檬酸杆菌的耐药基因分析
目的 分析分离自烧伤患者的2株耐药弗氏柠檬酸杆菌的耐药基因,了解菌株对β内酰胺类、氨基糖苷类、氟喹诺酮类药物的耐药机制. 方法 笔者单位烧伤科分别于2012年6、8月收治1例分离出弗氏柠檬酸杆菌的大面积烧伤患者(每例患者分离1株菌),应用药敏卡AST-GN13检测分离出的菌株对阿米卡星、氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、头孢唑林、头孢吡肟、头孢替坦、头孢他啶、头孢曲松、环丙沙星、厄他培南、庆大霉素、亚胺培南/西司他丁、左氧氟沙星等20种抗生素的敏感性；采用PCR法检测35种β内酰胺酶编码基因、15种氨基糖苷类修饰酶编码基因、6种16S核糖体RNA甲基化酶编码基因、2种氟喹诺酮类药物作用靶位编码基因和3种氟喹诺酮类药物作用靶位保护蛋白编码基因的表达,选取阳性表达基因进行DNA测序. 结果 2株弗氏柠檬酸杆菌对检测的13种β内酰胺类抗菌药物均耐药,对3种氨基糖苷类抗菌药物均耐药,对2种氟喹诺酮类抗菌药物耐药.1株弗氏柠檬酸杆菌对复方磺胺甲(惡)唑耐药,2株弗氏柠檬酸杆菌均对呋喃妥因敏感.2株弗氏柠檬酸杆菌检出blaTEM、bla SHV和bla IMP3种β内酰胺酶编码基因,检出aac(3)-Ⅱ和aac(6')-Ⅰb2种氨基糖苷类修饰酶编码基因,检出氟喹诺酮类药物作用靶位DNA回旋酶及拓扑异构酶编码基因gyrA、parC.经DNA测序分析,菌株在氟喹诺酮耐药决定区序列存在有义突变,gyrA编码基因第83位密码子由丝氨酸突变为异亮氨酸,parC编码基因第80位密码子由丝氨酸突变为异亮氨酸. 结论 2株弗氏柠檬酸杆菌检出blaTEM、blaSHV和blaIMP3种β内酰胺酶编码基因以及aac (3)-Ⅱ、aac(6')-Ⅰb氨基糖苷类修饰酶编码基因,可解释其对全部β内酰胺类(含碳青霉烯类)药物、氨基糖苷类药物耐药的机制.氟喹诺酮耐药决定区存在有义突变是该2株弗氏柠檬酸杆菌对氟喹诺酮类药物耐药的遗传学基础.
