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呼吸道合胞病毒的蛋白特征及抗原变异
呼吸道合胞病毒是非节段性的单链负股RNA病毒,是引起婴幼儿下呼吸道感染的重要原因.本文就近年来对呼吸道合胞病毒的蛋白特征和抗原变异的研究作一综述.
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丙型肝炎病毒基因1b型F蛋白对人肝细胞癌细胞株HepG2凋亡的影响
目的 研究丙型肝炎病毒(HCV)基因1b型F蛋白对人肝细胞癌细胞株HepG2凋亡的影响.方法 构建真核表达重组质粒pcDNA3.0-F-EGFP,并利用Lipofectamine 2000转染人肝细胞癌细胞系HepG2,同时设pcDNA3.0-C-EGFP-HepG2阳性对照、pcDNA3.0-HcpG2为阴性对照及未转染HepG2为空白对照,以Act-D、TNFα诱导四组细胞系发生凋亡,Annexin V-FITC/PI双染检测肿瘤细胞凋亡率,并使用细胞凋亡DNALadder检测,进一步验证HCV 1b型F蛋白在肝细胞凋亡的生物学功能效应.结果 pcDNA3.0-F-EGFP-HepG2细胞系在发生凋亡的时间上比peDNA3.0-C-EGFP-HepG2快,但相对空白质粒转染组及未转染HepG2细胞系有明显延迟,凋亡的发生率也明显低于阴性对照及空白对照细胞系(P<0.001).结论 外源性基因HCV 1b型F的引入及表达,对HepG2细胞的凋亡有抑制作用.
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江苏省宜兴地区丙型肝炎病毒F蛋白抗体检测
目的 检测江苏省宜兴地区丙型肝炎(丙肝)患者血清丙肝病毒(HCV)-F抗体及其分布.方法 利用基因重组获得的HCV-F/GST蛋白作为抗原,包被酶联反应板,ELISA间接法检测120例丙肝患者、15例乙肝患者、3例戊肝患者及10份正常人血清HCV-F抗体,结合丙肝患者的临床资料及疾病特征,统计分析HCV-F抗体的分布情况及与HCV感染的关系.结果 120例丙肝患者血清HCV-F抗体阳性82例,阳性率68%,而15例乙肝、3例戊肝患者及10份正常人血清标本均未检出阳性;资料分析显示HCV-F抗体阳性率与HCV患者年龄、临床类型之间差异有统计学意义,51岁以上年龄组的HCV-F抗体阳性率是20～50岁组的6.675倍(95%CI:2.407～19.071),并且随着病程进展,阳性率也随之增高(OR=2.749,95%CI:1.470～5.141).结论 江苏省宜兴地区HCV感染者血清中存在HCV-F抗体,并可能与病程相关.
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急黄汤抗大鼠急性肝衰竭的动态观察
目的:探讨急黄汤抗实验性急性大鼠肝衰竭的作用和机制.方法:以D-G1aN 9 00mg/kg剂量一次腹腔注射制成大鼠急性肝衰竭模型,治疗组造模前3d开始灌胃急黄汤清膏1 0mL/(kg@d),浓度为200%,于造模后24、48、72h,模型组及治疗组各取8只大鼠断头处死采血测定ALT、TB、PT、FP、TNFα,取肝组织作病检.结果:急黄汤在不同时相能明显降低急性肝衰竭大鼠ALT、TB、PT、FP、TNFα水平,改善肝组织病变,与模型组比较,P＜0.05或P＜0.01,有显著性差异.结论:急黄汤具有抗D-GlaN大鼠急性肝衰竭作用,可能与降低急性肝衰竭的重要介质TNFα及肝细胞损伤的标志物FP有关.
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尼帕病毒F糖蛋白在重组牛痘病毒中的表达及鉴定
尼帕病毒(NiV)F蛋白在病毒侵入细胞和诱导中和抗体等方面具有重要作用.通过over-lapping PCR合成密码子优化的F蛋白基因构建了表达NiV F蛋白的重组牛痘病毒(WR株)rWR-NiV-F.利用兔抗NiV血清为检测抗体,通过间接免疫荧光(IFA)检测到了F蛋白在重组病毒感染细胞中的表达.SDS-PAGE和Western blot检测证明重组蛋白F0被裂解为F1和F2.以rWR-NiV-F感染瞬时转染共表达NiV受体结合囊膜糖蛋白G的BHK细胞,可诱导细胞膜融合及合包体形成,证明该重组病毒表达F蛋白保持良好的抗原性及生物学活性,为NiV诊断及重组活载体疫苗研究奠定了重要基础.
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尼帕病毒融合蛋白和受体结合蛋白基因DNA免疫的研究
构建了表达哺乳动物密码子优化的NiV囊膜蛋白F和G基因的真核表达质粒pCAGG-NiV-F和pCAGG-NiV-G.细胞融合试验表明,重组NiV融合蛋白F和受体结合蛋白G在pCAGG-NiV-F、pCAGG-NiV-G共转染BHK细胞中获得表达,并具有良好生物学活性.真核表达质粒pCAGG-NiV-F、pCAGG-NiV-G和pCAGG-NiV-F+pCAGG-NiV-G DNA分别按100μg/只的剂量肌肉注射免疫6周龄BALB/c小鼠,间隔4周加强免疫,第二次加强免疫3周后采血,分离血清备用.分别以重组杆状病毒感染Sf9细胞表达的重组NiV融合蛋白(rNF)和受体结合蛋白(rNG)为包被抗原,应用间接ELISA检测上述质粒DNA免疫血清中的特异性抗体,具有较高的敏感性和特异性.另外,中和试验结果表明,DNA免疫小鼠产生的特异抗体可有效中和NiV囊膜蛋白F和G介导的伪型VSV重组病毒侵入NiV易感宿主细胞的感染性,并且受体结合蛋白G基因DNA诱导中和抗体的滴度高于融合蛋白F基因DNA.结果表明,DNA疫苗具有防制尼帕病毒性脑炎的潜力.
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人偏肺病毒F蛋白与细胞融合机制研究进展
人偏肺病毒(Human metapneumovirus,hMPV)是一种新发呼吸道病毒.hMPV感染可引起广泛的呼吸道疾病,目前已越来越受到人们的重视.多数副粘病毒与宿主细胞膜的融合过程依赖吸附蛋白和融合蛋白的共同参与.hMPV的特别之处在于其融合蛋白(F)既可以结合受体,又可以介导膜融合.本文从hMPV包膜表面具有双重功能的F蛋白入手,简要介绍F蛋白的结构和生理功能,重点阐述F蛋白介导的细胞融合机制和特性,对近几年来国内外研究进展进行了回顾与展望.
关键词： 人偏肺病毒(hMPV) F蛋白 融合机制 -
呼吸道合胞病毒F基因及蛋白的相关研究进展
呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)属副粘病毒科肺炎病毒属,是婴幼儿呼吸道感染重要的病毒病原.F基因序列保守,变异性小,国内外对F基因变异研究并不多.F蛋白(Fusion glycoprotein)为RSV跨膜糖蛋白,介导病毒与细胞膜的融合和穿入,诱导的中和抗体可以同时抑制A、B两个亚型的病毒感染,故F蛋白是单克隆抗体药物及疫苗研制的主要对象.在无有效疫苗的情况下,目前抗F蛋白单克隆抗体是降低高危患儿RSV感染入院率和疾病严重程度的重要方法,但单克隆抗体的使用可造成进化压力,产生抗体耐药株.本文对近10年来有关RSV的F基因变异、抗F蛋白单克隆抗体药物及F蛋白相关疫苗的研究进展进行综述.
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新城疫病毒包膜糖蛋白的结构与功能
新城疫是一种禽类传染病,可对养禽业带来严重的经济损失.其病原新城疫病毒具有包膜,基因组是单股、负链、不分节段的RNA,具有溶瘤活性,编码NP、P、M、F、HN和L六种结构蛋白,其中位于病毒包膜上的融合蛋白(F)和血凝素-神经氨酸酶(HN)两种糖蛋白对NDV的入侵及毒力有着重要的作用.本文首先总结了两种包膜糖蛋白结构与功能的基本情况,在此基础上,整合了近年来国内外的研究,发现了一些矛盾点,并且将HN蛋白的其他功能进行概述,为NDV包膜糖蛋白的研究提供了新的视角.
关键词： 新城疫病毒(NDV) 包膜糖蛋白 F蛋白 HN蛋白 结构与功能 -
尼帕病毒包膜糖蛋白及细胞融合机制研究进展
尼帕病毒(Nipah virus,NiV)是一种新发人兽共患病病原体,其传染性强,致死率高,不仅严重危害当地人群的生命财产,也对全球公共卫生安全构成严重威胁.本文从尼帕病毒包膜表面两种重要糖蛋白——附着蛋白G和融合蛋白F人手,简要介绍其结构形态和生理学功能,并联系尼帕病毒的组织趋向性,重点阐述G蛋白与其蛋白受体cB2/eB3 (ephrin-B2/ephrin-B3)之间、G蛋白与F蛋白之间的相互作用机制,对近几年来国内外研究的新进展进行回顾与展望.
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北京地区急性呼吸道感染儿童RSV F蛋白抗原位点变异分析
目的 为了解我国北京地区呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus RSV)融合蛋白F基因特征及抗原位点变异情况,本研究对61株RSV分离毒株F蛋白主要抗原位点区进行了基因序列分析.方法 应用RT-PCR方法分段扩增获得F蛋白主要抗原位点区基因,并对产物进行序列测定及拼接.序列比对分析,构建系统发育树,进行亲缘关系分析.结果 61株RSV分离株中,A亚型为43株,B亚型为18株.A、B亚型内核苷酸(氨基酸)同源性较高,分别为95.9％ ～ 100％(98.3％ ～ 100％)及97.5％ ～ 100％ (98.7％ ～ 100％),亚型间为83.2％ ～84.9％(93.1％ ～95.1％).基于F蛋白主要抗原位点区基因亲缘进化分析,所有分离株可分为两个主要亚群,分别对应A/B亚型;两个亚群又可分别分成6个及3个不同的进化分支.两个亚群中分别存在7个及4个氨基酸位点突变,其中抗原位点(Φ)存在209位从Q到K及211位从S到N的变异,帕利珠单抗作用的抗原位点Ⅱ存在276位从N到S的位点突变,其余突变均位于非抗原位点决定区.结论 北京地区RSV流行株与原型株相比,F蛋白存在一定的变异,但仍具有较高的核苷酸及氨基酸同源性;各抗原位点区氨基酸保守,为疫苗及相关药物研究的重要候选蛋白.
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副粘病毒F蛋白HR1和HR2在特异性膜融合中的作用
目的了解副粘病毒融合蛋白(F)分子上的七肽重复序列(HR1、HR2)在特异性膜融合中的作用.方法采用基因定点突变方法,在新城疫病毒(NDV)F与人副流感病毒(hPIV)F基因上创造相同的酶切位点.酶切后采用基因重组方法将F的HR1基因片段相互交换,得到交换HR1的两个嵌合体(chimera),即NDV C-HR1和hPIV C-HR1.用同样的方法又得到交换HR2的两个嵌合体,即NDV C-HR2和hPIV C-HR2.将各种嵌合体DNA与同源及异源HN DNA共转染BHK21细胞后,在真核细胞中表达.Giemsa染色和指示基因法检测细胞融合功能,荧光强度分析(FACS)检测F蛋白的表达效率.结果交换HR1后,NDV C-HR1的融合功能只有野毒株的53.91%,hPIV C-HR1的融合功能达到野毒株的83.15%;交换HR2后,NDV C-HR2的融合功能略高于野毒株,达到野毒株的107.23%,hPIV C-HR2的融合功能却只有野毒株的12.01%.FACS分析表明,交换HR1后的NDV C-HR1和hPIVC-HR1的表达效率均下降.交换HR2后,NDV C-HR2的表达效率没有改变,而hPIV C-HR2的表达效率下降.结论 NDV F的HR1对其特异性膜融合具有重要作用,而HR2则没有病毒特异性;hPIV F的HR1和HR2对hPIV的特异性膜融合都有重要作用.
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HCV F蛋白体外自组装以及在HCV感染者肝组织中的分布研究
目的 探讨HCV F(frameshift)蛋白是否能自组装为病毒样颗粒以及F蛋白是否存在于HCV患者肝组织中.方法 将0.5～1 g/L大肠埃希菌重组表达的F蛋白与0.006 g/L tRNA混合,于100 μl组装缓冲液中进行反应,取组装产物进行1:10稀释,2%醋酸铀复染后电镜观察是否形成病毒样颗粒.HCV感染者肝组织中F蛋白的检测采用免疫组织化学法.结果 1 g/L F蛋白与tRNA混合(167:1)后,可形成直径35 nm的病毒样颗粒.在20例HCV感染者的肝穿刺组织标本中,有2例患者的肝细胞胞浆中可检测到F蛋白.结论 F蛋白在体外可以形成病毒样颗粒,在部分HCV感染者的肝组织中存在F蛋白,F蛋白在HCV的生活周期中可能有重要功能.
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北京地区呼吸道合胞病毒分离株F蛋白基因序列分析
目的分析中国北京地区4株呼吸道合胞病毒(RSV)F蛋白的基因序列并与RSV原型株A2进行比较,得出中国北京地区RSV F蛋白基因是否存在变异及变异特征.方法用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)分2段扩增F蛋白的基因核苷酸序列,将得到的P1、P2 2段切胶纯化标记后测序,应用Bioedit软件对得到的序列做碱基配对和比较分析.结果4株RSV F蛋白核苷酸序列的同源性为94.92%～95.62%.信号肽区的同源性为99.36%～99.73%.F1、F2亚单位同源性分别为98.93%～99.31%和96.69%～97.33%.氨基酸同源性分别为:F蛋白的蛋白编码区97.39%～97.74%,信号肽区99.13%～99.65%,F1、F2亚单位98 78%～99.48%、98.61%～99.30%.结论中国RSV北京株与原型株A2之间的F蛋白基因变异小,具有很高的同源性.氨基酸在抗原位点Ⅱ保守,此段氨基酸可作为RSV疫苗的候选位点.
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呼吸道合胞病毒F1蛋白截短体(F212-489)的原核表达及纯化
目的 原核表达并纯化呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)F1蛋白截短体(F212-489).方法 从质粒pMD-18T-f中PCR扩增截短f1基因(f212-489),经TA克隆测序正确后,将目的片段插入原核表达载体pET-28a,构建重组表达质粒pET-28a-f212.489,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达.表达的重组蛋白经镍离子亲和层析纯化后,进行Western blot鉴定.结果 重组表达质粒pET-28a-f212-489经双酶切鉴定构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为30 000,主要以包涵体形式表达,表达量约占菌体总蛋白的10％;纯化的重组蛋白纯度为85％,可与羊抗RSV多克隆抗体特异性结合.结论 成功表达了RSV F1蛋白截短体(F212-489),纯化的重组蛋白反应原性良好,为更好地研究RSV的免疫机理及通过基因工程方法研制特定部位的亚单位或多肽疫苗奠定了基础.
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丙型肝炎病毒F蛋白在病毒复制和致病中的作用
丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)属于黄病毒科,是有包膜的单正链RNA病毒.HCV基因组约有9 600个碱基,编码的单一开放读码框(Open reading frame,ORF)翻译出约3 000个氨基酸残基的多聚蛋白前体,在宿主细胞及病毒蛋白酶的作用下,剪切成至少10种结构蛋白和非结构蛋白.近年来,一种新的病毒蛋白在一些实验室相继被发现,称为读码框移位蛋白(Alternative reading frame protein,ARFP),或称为F蛋白(Frameshift protein),也有学者称之为Core+1蛋白.F蛋白是由核心基因读码框移位产生的,虽然从发现至今已有10余年,但其生物学功能仍不明确,对其在肝脏疾病和肝细胞癌的发生发展中的作用及其对HCV复制和感染的影响尚有争议.本文就F蛋白的发现、产生机制、抗原性、生化特性及生物学功能等作一综述.
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小反刍兽疫病毒F蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备
目的 原核表达小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)F蛋白,并制备多克隆抗体.方法 根据GenBank中登录的PPRV Nigeria 75/1株F基因全长序列,采用DNAStar软件设计去除F基因信号肽和跨膜区的引物,进行RT-PCR扩增,并克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达.表达的重组蛋白纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析,免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,并初步应用于PPRV的检测.结果 重组原核表达质粒pET-32a(+)-PPRV-F经双酶切和测序证实构建正确;表达的重组F蛋白相对分子质量约59 000,诱导6h表达量高,且主要以包涵体形式表达;纯化的重组蛋白纯度可达95％以上;免疫小鼠制备的多抗能与纯化的重组蛋白发生特异性反应,抗体效价高于1:64000;间接免疫荧光试验显示,制备的多抗能够识别PPRV Nigeria 75/1株全病毒抗原.结论 原核表达了PPRVF蛋白,并制备了高效价的多克隆抗体,为其进一步研究及小反刍兽疫临床快速检测方法的建立奠定了基础.
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呼吸道合胞病毒F蛋白研究进展
人呼吸道合胞病毒(RSV)融合蛋白(F蛋白)为病毒表面结构蛋白,可以刺激机体产生保护性抗体和细胞免疫反应.因此对F蛋白的深入研究将有助于了解病毒感染的机理,从而为研究RSV的免疫机理、研制特定部位的亚单位或多肽疫苗提供帮助.
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丙型肝炎病毒F蛋白磷酸化位点突变与细胞内分布
目的 探讨丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白磷酸化位点突变对其在细胞内分布位置及功能的影响.方法 应用NetPhos2.0 Server软件预测F蛋白的磷酸化位点,据此设计重叠引物,利用引物之间相互延伸获得突变型HCV f基因,该基因第13、14、114、121和124位密码子由野生型f基因的TCT突变为GAT,对应氨基酸由丝氨酸(S)突变为天冬氨酸(D).将突变型f基因及野生型f基因定向克隆至pEGFP-N1,得到pEGFP-mf和pEGFP-f重组子.采用脂质体法将重组子转染HepG2细胞,再用激光共聚焦显微镜观察突变型F蛋白以及野生型F蛋白在细胞内的分布情况,拍照并进行半定量分析.结果 在HepG2细胞中,突变型F蛋白主要分布在细胞核内(90%),细胞质内有少量分布(10%),平均荧光强度分别为63.70±3.20和7.06±0.34,两者差异有统计学意义(P《0.001,t=99.2);野生型F蛋白主要分布在细胞质内(94.9%),细胞核内有少量分布(5.1%),平均荧光强度分别为83.34±4.07和4.48±0.22,两者差异有统计学意义(P《0.001,t=106.5).结论 HCV F蛋白在细胞内存在磷酸化和非磷酸化2种形式,其功能也不同.细胞质内以磷酸化F蛋白为主,非磷酸化F蛋白主要位于细胞核内.磷酸化F蛋白可能参与HCV复制调节,非磷酸化F蛋白可能影响细胞核内基因转录.
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HCV感染者F蛋白抗体阳性检出率的Meta分析
目的：采用Meta分析的方法探讨丙型肝炎病毒（HCV）感染者体内抗F蛋白循环抗体的产生。方法检索1968年至2012年11月中国知网、万方数据库、万方医学网、维普、SinoMED、Medline、Pubmed、Splinger-link、Cochrane、Science direct的相关文献，手工检索查全补充，严格根据纳入和排除标准筛选文献，将终纳入文献采用Revman 5．0软件进行数据合并与分析。采用OQAQ量表对结果进行评价。结果 HCV感染者与健康人群对照，共纳入14项病例对照研究，合计1348例 HCV 感染者，F 蛋白抗体检出率差异有统计学意义（P＜0．00001），合并率的优势比＞1，总体比值比（OR）达64．81[95％可信区间（CI）为29．90～140．49]；HCV感染者与非HCV感染者对照，共纳入11项对照研究，合计923例HCV感染者，F蛋白抗体检出率差异有统计学意义（P＜0．00001），HCV感染者F蛋白检出率是非HCV感染者的53．09倍（95％ CI为23．56～119．66）；HCV感染者F蛋白抗体检出率与核心蛋白抗体检出率对照，共纳入8项对照研究，合计770例HCV感染者，差异有统计学意义（P＜0．00001），率差（RD）为-0．42（95％ CI为-0．59～-0．25），核心蛋白抗体检出率比F蛋白抗体高42％。结论 HCV感染者体内抗F蛋白抗体检出率明显高于健康人和非HCV感染者。F蛋白可诱导HCV感染者产生抗F蛋白特异性循环抗体，是HCV产生的特异蛋白，可为实验室诊断HCV感染和监测干扰素联合治疗HCV效果提供理论依据和数据支持。
