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血塞通胶囊对大鼠梗死脑组织自体神经干细胞修复和再生的影响
目的 探讨血塞通胶囊对大鼠梗死脑组织自体神经干细胞增殖分化的影响. 方法 参照改良Zea-Longa法建立大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤模型,将造模成功大鼠随机分为模型组和中药高、中、低剂量组,每组40只,另设健康大鼠40只为正常组.中药高、中、低剂量组分别以血塞通胶囊60、40、20 mg/(100g·d)灌胃,正常组和模型组以1ml/ (100g·d)生理盐水灌胃,各组均灌胃28天.分别于给药后1、3、7、14、28天取材8只大鼠,检测梗死边缘区5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)、微管相关蛋白-2(MAP-2)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、3型β微管蛋白(Ⅲβ-Tubulin)表达变化. 结果 正常组偶见BrdU、MAP2、GFAP、Ⅲβ-Tubulin表达阳性细胞,模型组和中药高、中、低剂量组各时间点梗死边缘区BrdU、MAP-2、GFAP、Ⅲβ-Tubulin表达阳性细胞均较正常组显著增加(P＜0.05);中药高、中剂量组在给药后1、3、7、14天时BrdU、MAP-2、GFAP、Ⅲβ-Tubulin阳性细胞数较模型组同时间点显著增多(P＜0.05). 结论 血塞通胶囊可促进梗死脑组织神经干细胞增殖分化,参与损伤脑组织的修复和再生作用.
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HCMV感染抑制人海马神经干细胞分化
研究HCMV感染对体外培养的人海马源性神经干细胞(Neural stem cells,NSCs)分化的影响.体外分离、培养人海马NSCs.应用免疫荧光方法检测其NSCs标记物-巢蛋白(Nestin)的表达.10%胎牛血清诱导NSCs贴壁分化,同时用MOI为5的HCMV AD169株感染NSCs,7d后使用激光共聚焦显微镜免疫荧光方法检测Nestin、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和HCMV即刻早期蛋白(IE)的表达,计算阳性细胞比率.本实验所培养的细胞(4～6代)95±8%表达Nestin;分化诱导7d后,感染组86±12%细胞表达IE,未感染组和感染组Nestin阳性率分别为50±19%和93±10%(t=6.03,P<0.01),GFAP阳性细胞率分别为81±11%和55±17%(t=3.77,P<0.01).以上结果表明分化过程中的NSCs是HCMV的容许细胞;HCMV感染可以抑制NSCs的分化.
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骨形态发生蛋白-4在体内外诱导成年大鼠脑神经干细胞向胆碱能细胞分化的效应
目的 了解骨形态发生蛋白4 (BMP4)是否具有诱导成年大鼠脑神经干细胞(NSCs)向胆碱能细胞分化的效应.方法 将从两月龄大鼠脑海马、纹状体等区域分离的细胞培养于含EGF、bFGF的DMEM/F12培养液中,在光镜下观察细胞的形态特征,并行Nestin细胞化学染色,24h后换成含有BMP4的培养液,培养8d时,行ChAT间接免疫荧光染色,在光镜下观察细胞形态的变化,并行FITC标记的流式细胞术检测NSCs分化.以脑立体定位术给成年大鼠右侧海马齿状回内注射BMP4或生理盐水0.5μL；14d后取大鼠脑组织切片,行ChAT免疫组织化学染色；以图像分析仪测量ChAT阳性细胞总面积.结果 分离出的大鼠脑海马、纹状体等区的细胞约48％为Nestin阳性的NSCs.培养8d时,光镜下见加BMP4组约34％的细胞呈神经元形态特征；间接免疫荧光染色见呈较强绿色荧光的ChAT阳性细胞较多；FITC标记流式细胞术检测到16％的细胞呈ChAT阳性.而未加BMP4组呈ChAT阳性的细胞约7％,明显少于加BMP4组,且荧光较弱.给大鼠海马齿状回区脑组织中注射BMP4后14d时,可见该区细胞出现较高的胆碱能表达.结论 BMP4可在体外培养及体内注射条件下诱导大鼠脑神经干细胞向胆碱能细胞分化.
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骨形态发生蛋白4对大鼠脑神经干细胞的胆碱能诱导分化效应
观察了骨形态发生蛋白4(BMP4)对原代分离培养的大鼠脑神经干细胞(NSC)的胆碱能诱导分化效应.将从2个月龄大鼠脑海马、纹状体等区域分离的细胞培养于含EGF和bFGF的DMEM/F12培养液中, 在光镜下观察细胞的形态特征, 并行神经巢蛋白(nestin)细胞化学染色.24h后, 改换成含有BMP4的培养液, 继续培养7或8天.在光镜下观察细胞的形态变化, 并行胆碱乙酰转移酶(choline acetyltransferase, ChAT)和nestin双标免疫细胞化学染色.结果表明, 加BMP4继续培养7或8天后,光镜下见有34%的培养细胞具有神经元的形态特征.用免疫细胞化学染色可见ChAT阳性的细胞与nestin阳性的细胞共存,其中ChAT阳性细胞占28%, nestin阳性细胞占38%.总之, 在培养液中加入BMP4, 可以诱导NSC分化成具有胆碱能特性的细胞.
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神经干细胞体外诱导分化为胆碱能神经细胞
本文观察骨形态发生蛋白4(BMP4)在体外对原代分离培养的大鼠脑神经干细胞(NSCs)的胆碱能诱导分化效应.将从两月龄大鼠脑海马、纹状体等区域分离的细胞, 培养于含EGF和bFGF的DMEM/F12培养液中, 在光镜下观察细胞的形态特征, 并行nestin免疫细胞化学染色.24h后, 一半细胞改换成含有BMP4的培养液培养作为实验组, 另一半细胞继续用原培养液培养作为对照组.在培养第8天, 采用间接免疫荧光染色, 观察培养细胞的胆碱乙酰转移酶(ChAT)抗原的表达.结果表明实验组呈ChAT阳性的细胞较多, 发出较强的绿色荧光, 具有神经元的形态特征;对照组呈ChAT阳性的细胞较少, 发出的荧光较弱.另外行FITC标记的流式细胞术, 检测NSCs的分化、结果表明实验组有16%的细胞呈ChAT阳性,而对照组只有约7%.由此认为BMP4具有诱导NSCs分化成具有胆碱能特性的细胞的功能.
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神经干细胞移植对帕金森病模型大鼠的治疗作用
目的 观察大鼠神经干细胞(NSC)植入帕金森病(PD)模型大鼠的脑纹状体后的存活、分化及功能状态.方法 体外分离培养NSC,单克隆培养,免疫细胞化学检测多向分化潜能和特异性标记nestin.建立PD大鼠模型,纹状体内植入DAPI标记的NSC,检测6-羟基多巴胺(6-HHDA)诱发的旋转行为,荧光检测标记细胞的分布情况,免疫细胞化学和高效液相色谱检测细胞分化和神经递质含量.结果 培养的NSC表达nestin,具有自我更新和多向分化能力;NSC植入PD模型大鼠纹状体后大鼠诱导旋转行为显著改善(P＜0.05);NSC在脑内迁移,并在纹状体内形成少量酪胺酸羟化酶(TH)阳性细胞、纤维;植入后纹状体内多巴胺(DA)及其代谢产物含量上升,2个月时分别增加3.6倍和2.8倍,4个月时增加3.4倍和2.4倍(P＜0.01).结论 神经干细胞在体外大量扩增后植入PD脑内能长期存活并分化、分泌神经递质,从而部分改善PD症状.
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神经干细胞定向分化过程中编码基因表达谱分析
目的 探索小鼠神经干细胞定向分化为神经元及胶质细胞过程中重要发育基因的表达变化.方法 1)神经干细胞培养及定向分化诱导培养;2)分化神经元、星形胶质细胞的流式分选;3)针对编码基因表达谱芯片的生物信息学分析,包括基因功能聚类、通路分析等.结果 1)经细胞分选获得神经干细胞、神经元、星形胶质细胞;2)Sox2、Nestin等神经干细胞、神经元及星形胶质细胞的标志性基因表达谱式明显;3)Wnt通路、Insulin通路、P53通路活性的改变在定向分化细胞类群中存在细胞特异性.结论 神经干细胞的分化过程是一个多基因通路综合变化的复杂网络.
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低氧对胎鼠中脑NSCs的促体外增殖作用
目的观察低氧对大鼠中脑神经干细胞体外增殖的影响,并探讨其增殖的可能机制.方法取孕13.5 d的Wistar大鼠,麻醉后取胚胎,分离中脑神经干细胞(NSC),常规培养鉴定后分3组:对照组;10%O2组;3%O2组.采用4孔板培养3～4 d后进行神经球记数,用流式细胞仪测定其增殖指数,后用RT-PCR方法测定低氧(10%O2)不同时间点(1、3、6、12、24、48和72 h)低氧诱导因子-1α(HIF-1α)mRNA的表达水平.结果低氧组神经球记数和增殖指数明显高于对照组,尤以10%O2组为明显(P＜0.01);10%O2组12 h和48 h时的HIF-1α mRNA表达水平比同一时间点的对照组明显增加.结论轻中度低氧有利于NSC的体外增殖,而HIF-1可能在其中发挥了重要作用.
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成年大鼠脑梗死后自体神经干细胞的原位增殖
制作大鼠脑梗死模型,采用免疫组化染色方法,观察脑梗死后1、3、7、14和28d时,梗死侧神经干细胞增殖及其表达标记物BrdU和nestin的动态变化.与对照组相比,伤侧皮层、海马及室下区的BrdU和nestin阳性细胞数于伤后1d开始增多,7d达高峰,28d后接近正常水平.结果表明:脑梗死可激发成年大鼠自体神经干细胞原位增殖;自体神经干细胞对脑梗死损伤有一定的反应能力,可能对脑梗死后机体自我修复有潜在的治疗作用.
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小鼠睾丸支持细胞对大脑皮质细胞的体外营养作用
目的 通过观察睾丸支持细胞(SCs)对大脑皮质细胞体外的营养作用,探讨移植的SCs在体内对神经组织营养作用的方式.方法 将原代分离的小鼠大脑皮质细胞单独培养(对照组)或与小鼠SCs共培养(实验组),比较两组中神经元、神经干细胞(NSC)及神经胶质细胞的生长情况.结果 实验组的神经元数及其突起数、神经元特异性烯醇化酶光密度(P＜0.01)和神经胶质细胞数均较对照组高,两组各时期的神经元胞体面积也不相同(P＜0.05),实验组于第3天出现NSC的集落形成.结论 SCs在体外对大脑皮质的神经元、NSC和神经胶质细胞均有较强的营养作用,在中枢神经系统疾病的细胞移植治疗中将具有很大的应用价值.
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小鼠胚胎干细胞来源的神经干细胞的稳定传代体系探索
目的 探讨体外诱导、获取均一的神经干细胞群(NSCs)的有效方法,并建立神经干细胞体外稳定传代扩增体系.方法 首先采用无血清的诱导培养基贴壁诱导mESCs形成神经上皮祖细胞(NPCs).然后将经添加表皮生长因子(EGF)和成纤维细胞生长因子-2(FGF2)的无血清培养基短暂悬浮培养后的NPCs再贴壁培养,诱导形成NSCs.通过细胞系46C监测NPCs的形成,同时对分化细胞进行定量PCR和免疫荧光染色,在不同水平检测细胞分化效果.结果 mESCs神经诱导5 d出现大量Soxl+的NPCs；NPCs悬浮培养后,进一步诱导可得到形态均一的NSCs.第2代和第6代NSCs的神经干细胞标志定量PCR检测结果为:Pax6、Nestin、Mashl、BLBP高表达.第8代NSCs免疫荧光染色显示90％以上的细胞均为Nestin、RC2和Pax6阳性.结论 成功诱导mESC生成神经干细胞群,并且可以在体外连续稳定的传代.
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移植胚鼠神经干细胞对大鼠脊髓损伤后红核神经元损伤的影响
目的 研究神经下细胞(NSCs)移植对大鼠脊髓损伤(SCI)后红核神经元的作用.方法 5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)法标记处于对数生长期的NSCs,采用电控脊髓损伤打击装置制作大鼠脊髓损伤模型.实验分为3组:NSCs组、SCI组和假手术组(Sham组).SCI后3 d进行NSCs移植,用免疫组化法观察移植细胞的存活及迁移情况,用辣根过氧化物酶(HRP)逆行示踪技术标记红核神经元,并用四甲基联苯胺(TMB)呈色反应显示红核脊髓束神经元的存活情况,用行为学(BBB)评分法观察大鼠瘫痪肢体的恢复情况.结果 在损伤脊髓区域可检测到BrdU标记的阳性NSCs,中脑HRP标记红核神经元数目明显多于SCI组(P<0.01),BBB评分亦明显高于SCI组(P<0.01).结论 体外培养的胚胎大鼠NSCs在移植到脊髓损伤区域后可存活和迁移,对SCI后巾脑红核神经元具有保护作用,从而促进了大鼠肢体功能的恢复.
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体外诱导恒河猴骨髓基质细胞分化为神经细胞的分化条件
目的比较血清维甲酸(retinoic acid,RA)、胶质细胞源神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)及脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)等在不同浓度诱导条件下使恒河猴骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells)诱导分化为神经干细胞(NSCs)及成熟神经细胞的分化条件.方法用Nestin、CD133抗体免疫细胞化学染色,鉴定NSCs;用NSE、β-tublin鉴定神经元;用GFAP鉴定神经胶质细胞,膜片钳检测分化成熟细胞的电生理特性.结果培养第8天多数细胞表现出Nestin及CD133抗原阳性,即为NSCs细胞;诱导后3天即有神经元样细胞出现,此后神经元样细胞逐渐增多,膜片钳检测发现这些细胞具有类似神经细胞的电生理特性.同时,与其他培养条件相比较,低浓度血清(2.5%)+RA+GDNF组诱导分化效能高.结论应用RA+GDNF及配合使用低浓度血清能够高效诱导骨髓源NSCs向成熟神经细胞分化.
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体外培养的神经干细胞聚集体结构分析
观察大鼠神经干细胞聚集体的内部结构并分析其细胞组成.培养神经干细胞,分别做HE染色;nestin、GFAP、NSE免疫组化;细胞超微结构应用扫描电镜和透射电镜观察.结果显示,细胞聚集体内有健康细胞和凋亡或坏死细胞,后者被前者包裹形成典型的鸟巢状结构.健康细胞分为两大类,一种是小细胞,电子密度低,细胞表面较光滑;nestin强阳性和/或GFAP阳性.另一种细胞较大,有突起,电子密度高,nestin弱阳性.健康细胞间存在粘附连接,细胞内可见到吞噬体和板层状膜样结构.推测神经干细胞聚集体内的小细胞是较幼稚的神经干细胞,大细胞为处于分化前期的细胞.神经干细胞具有吞噬功能.
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人视网膜前体细胞的体外培养、纯化和诱导分化
目的 体外培养和纯化人视网膜前体细胞,研究其分化的诱导因素.方法 培养3～5个月人胚胎视网膜前体细胞,鉴定其神经干细胞特性.流式细胞术比较其传代前后的含量.观察不同培养条件对其分化的诱导.结果 人视网膜前体细胞能分裂增殖,形成原代和子代神经球,表达Nestin,分化后表达神经烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白、蛋白激酶C和神经突触素.传代后Nestin表达量[(39.3±18.9)%]显著高于原代[(28.7±17.7)%](P＜0.05).视网膜组织片上清液诱导后神经烯醇化酶表达量[(69.3±6.5)%]高于自发分化者[(59.5±7.6)%](P＜0.05).视紫红质表达量[(7.5±2.9)%]则低于自发分化者[(13.2±3.2)%](P＜0.05).组织共培养后,同一区域内细胞集中向特定细胞分化.结论 体外培养的人视网膜前体细胞能自我纯化,不同诱导形式使其分化发生偏差.
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人脂肪组织来源的神经干细胞移植治疗大鼠脑缺血再灌注损伤
目的 探讨人脂肪组织来源的神经干细胞移植治疗大鼠脑缺血再灌注损伤的疗效.方法 线栓法制作大鼠大脑中动脉缺血(MCAO)2 h再灌注模型.体外培养脂肪基质细胞,诱导分化为神经干细胞.移植治疗组经尾静脉移植人脂肪组织来源的神经干细胞悬液(2×106/mL).用MNSS量表测定神经功能,TTC、HE染色观察脑梗死体积及脑组织病理变化.结果 移植治疗组再灌注14、21和28 d的神经功能评分低于缺血再灌组(P<0.05或P<0.01).移植治疗组第14天脑梗死体积(40.20±9.52 mm3)小于缺血对照组(66.60±14.24 mm3)(P<0.01).移植治疗组的神经细胞,变性、坏死数量较缺血再灌组明显减少.结论 人脂肪组织来源的神经干细胞移植治疗可改善脑缺血再灌注损伤大鼠的神经功能,具有神经保护作用.
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米非司酮对大鼠胚胎神经干细胞存活、增殖及分化的影响
目的 观察米非司酮处理后大鼠胚胎神经干细胞(NSCs)增殖、凋亡和分化变化,分析其对神经发育的可能影响.方法 以不同浓度米非司酮处理体外培养的NSCs,通过活细胞计数、流式细胞仪检测细胞周期及线粒体膜电位、免疫细胞化学染色等方法检测NSCs存活、增殖、凋亡及分化情况.结果 10-5 mol/L米非司酮处理后NSCs存活和增殖明显下降(P＜0.05),10-6和10-8 mol/L对细胞无明显影响,而10-7 mol/L处理第4天后细胞增殖明显,但其对NSCs线粒体膜电位及增殖指数影响不大；处理后NSCs仍保持多向分化能力,神经元和胶质细胞分化比例与对照组相比无差异.结论 大剂量米非司酮抑制NSCs增殖,小剂量则促进细胞增殖、不影响NSCs命运决定.
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NSCs-HA-NT-3复合物移植修复兔面神经损伤
目的 观察NSCs-HA-Col支架-NT-3复合物对兔面神经完全横断损伤修复效果.方法 新西兰大耳白兔41只.随机分为6组.E组为NSCs-HA支架-NT-3联合移植组.电生理于术前、术后1、4、8和12周记录肌电图的潜伏期、阈值、振幅.术后12周取桥接处神经,行BrdU及S100免疫组化染色,半薄切片及图像分析,透射电镜观察再生情况.结果 E组术后12周可见较多BrdU阳性细胞,电生理检测与正常对照无显著性差异,桥接处纵断面呈现连续或不连续波浪状;横断面髓鞘结构与正常对照组的较为相似.结论 NSCs-HA支架-NT-3复合物可以显著提高面神经损伤修复的效果.
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SHH-N基因腺相关病毒表达载体的构建及其对神经干细胞增殖相关基因的影响
目的 构建rAAV-SHH-N-EGFP载体并检测其对神经干细胞增殖相关基因影响.方法 分离并培养大鼠脑室下区神经干细胞,提取RNA、反转录、PCR得到SHH-N的cDNA,克隆入pSNAV2.0-CMV-IRES-EGFP,包装得到腺相关病毒rAAV-SHH-N-EGFP,感染神经干细胞48 h后,采用实时定量PCR检测SHH信号通路下游相关基因的mRNA水平变化,并观察rAAV-SHH-N-EGFP载体在神经干细胞内的表达情况.结果 (1)克隆得到SHH-N基因,测序结果与NCBI报道序列一致.(2)成功构建pSNAV2.0-CMV-SHH-N-EGFP表达载体并鉴定,包装得到rAAV-SHH-N-EGFP.(3)实时定量PCR分析rAAV-SHH-N-EGFP感染神经干细胞48 h后,rAAV-SHH-N-EGFP处理组较感染rAAV-EGFP的对照组,Glil和Nmyc的mRNA水平上调.(4)rAAV-SHH-N-EGFP可有效感染神经干细胞,在感染14 d后稳定表达SHH-N.结论 成功构建rAAV-SHH-N-EGFP过表达载体并使其在神经干细胞内稳定表达.过表达SHH-N可使神经干细胞内SHH信号通路相关基因Glil转录水平上调,并使细胞增殖相关基因Nmyc转录水平上调.
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重组γ-神经胶质成熟因子诱导体外神经干细胞分化为星形胶质细胞
目的 探索γ-神经胶质成熟因子(GMFG)能否促进大鼠神经干细胞增殖并分化成神经胶质细胞.方法 无菌分离大鼠胚胎脑组织进行原代培养和传代培养,将第3代含有神经球的培养基制成细胞悬液,经Nestin免疫荧光染色检测呈阳性后,分4组培养,1组、2组每天分别加入5μg/L、10μg/L重组GMFG,3组加入10%胎牛血清(FBS),对照组为培养基.结果 对照组细胞培养4 d后见少数细胞增殖并长出细长的分支;FBS组细胞培养3 d后大量增殖并分化,形态学上为原浆型星形胶质细胞,呈扁平片状贴在培养皿表面;GMFG组细胞培养2 d后大量增殖并分化,形态学上为纤维型星形胶质细胞,5μ/L组细胞分化不如10μg/L组细胞分化明显.结论 GMFG能诱导神经干细胞在体外增殖并分化为星形胶质细胞.
关键词： γ-神经胶质成熟因子 神经干细胞 增殖 分化 大鼠
