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紫外线B照射对小鼠免疫功能影响的研究
目的探讨紫外线B(UVB)照射对小鼠免疫功能的抑制效应和程度.方法UVB照射后小鼠脾细胞对丝裂原反应,混合淋巴细胞培养,溶血空斑形成细胞及脾细胞的白细胞介素-2(IL-2)产生等非特异免疫功能指标的测定.结果发现UVB照射小鼠可抑制小鼠脾细胞对ConA、LPS刺激的反应.在20kJ/m2时,分别为36.6%和41.0%.对异型淋巴细胞混合培养的反应也是有明显抑制效应(抑制率为41.0%),并在约两周恢复正常,对溶血空斑形成细胞(PFC)及脾细胞IL-2的产生亦呈抑制效应(抑制率分别为35.5%和75.0%).结论UVB照射小鼠可使其机体免疫功能下降.
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间充质干细胞对不同刺激条件下Th1/Th2细胞比值的影响
目的 探讨间充质干细胞(MSC)对不同刺激作用下T淋巴细胞向Th1及Th2亚群转化的影响.方法 将MSC植入24孔板中,在第3天加入经佛波脂(PMA)及离子霉素(ionomycin)刺激的T淋巴细胞,或者按照不同比例将MSC加人双向混合淋巴细胞培养体系中,用流式细胞术分析各组T淋巴细胞亚群和内因子IL-4、IFN-γ的分泌变化情况,从而间接了解Th1及Th2亚群的改变.结果 对于共刺激作用下单独培养的T细胞,MSC能轻度抑制其Th1细胞的转化;而在混合淋巴细胞培养体系(MLC)中,MSC能够明显抑制其中的CD8+T细胞亚群和Th1细胞,轻度提高Th2细胞比率.结论 MSC在体外能抑制CD8+T细胞(CTL)和Th1细胞,升高Th2细胞.所以在临床上可能有减轻移植后急性移植物抗宿主病(aGVHD)的发生,而保留移植物抗白血病(GVL)的潜力.
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骨髓间充质干细胞对造血干细胞移植免疫的影响及其机理
骨髓间充质干细胞具有自我更新及多向分化的潜能,在骨髓中合成分泌多种细胞因子,并通过细胞间相互作用为造血干细胞的分裂、增殖与分化提供良好的微环境.有研究显示,骨髓间充质干细胞能够促进异基因造血干细胞植入,并在一定程度上减轻移植物抗宿主病的作用.这种对移植免疫的影响可能与其保护MHC相合造血干细胞逃脱抗原识别,抑制非特异性淋巴细胞活化增殖有关.本文对骨髓间充质干细胞特性、骨髓间充质干细胞影响移植免疫的表现、骨髓间充质干细胞影响移植免疫的机理进行了综述.
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3种同种异基因混合骨髓移植小鼠(A+B+C→A)的模型
本研究目的为建立3种异基因小鼠(BALB/c, H-2d; C57BL/6, H-2b和CBA/N, H-2k)混合骨髓移植模型(A+B+C→A),观察此模型能否延长骨髓移植后受体鼠的存活时间.采用受致死量照射的小鼠接受同基因与2种异基因3种混合(比例为1∶4∶4)的骨髓移植.同时还观察了3种混合淋巴细胞培养及2种不同抗原混合刺激的迟发型超敏反应.结果显示,混合骨髓移植的小鼠存活时间明显长于单纯异基因移植的小鼠,混合移植组平均存活时间为56.6±27天,长者为103天,而单纯异基因移植的对照组存活时间为15±5天,两组比较有显著性差异(P<0.001);3种混合的淋巴细胞培养,不管是2种反应细胞与1种刺激细胞混合培养,还是1种反应细胞与2种刺激细胞混合培养,均表现明显低于一对一的混合淋巴细胞反应,2种混合细胞刺激的迟发型超敏反应亦明显低于1种抗原刺激的反应.结论:同基因与2种异基因3种混合的骨髓移植可使受髓小鼠存活时间明显延长.
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可溶性mPDL1-hIgGFc表达载体构建、表达及对诱导细胞增殖与凋亡的影响
目的 可溶性mPDL1-hIgGFc(mouse PDL1-human IgG Fc)表达载体的构建与表达,及其对诱导细胞增殖与凋亡的研究.方法 以含有mPDL1基因的载体pmPDL1为模板,采用PCR的方法获得mPDL1胞外段基因,定向连接于含有hlgGFc基因片段的载体phIgGFc,构建表达载体pmPDL1-hIgGFc;采用脂质体将重组子转染CHO细胞,转染后的CHO命名为cHOp;ELISA和Western blot法检测目的 蛋白的表达,流式细胞术检测CHOp培养上清对混合淋巴细胞培养(MLC)的影响.结果 测序结果和酶切鉴定显示构建的表达载体pmPDL1-higGFc完全正确;ELISA和Westernblot法检测CHOp培养上清中有目的 蛋白表达;流式细胞术检测表明CHOp培养上清可体外抑制小鼠MLG,并诱导活化T细胞凋亡,其效应呈剂量依赖性.结论 成功构建mPDL1-hIgGFc表达载体;mPDL1-hIgGFc在体外可抑制MLC和诱导活化T细胞凋亡,具有负性调节T细胞的功能.
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小鼠PTA1/CD226分子参与杀伤性T细胞(CTL)的分化
目的阐明小鼠PTA1(mPTA1)/mCD226对杀伤性T淋巴细胞(CTL)分化的影响.方法 构建小鼠PTA1-hIgFc真核表达载体,表达并纯化mPTA1融合蛋白,免疫家兔,获得抗mPTA1的多克隆抗体,并用偶联mPTA1-Fc融合蛋白的Sepharose-4B亲和层析柱纯化多克隆抗体.间接免疫荧光染色后经流式细胞术鉴定多克隆抗体的特异性.通过混合淋巴细胞培养(MLC)诱导产生CTL效应细胞,以51Cr释放试验检测mPTA1多克隆抗体在MLC中对T淋巴细胞分化及杀伤功能的影响.结果获得了mPTA1-hIgFc融合蛋白和针对mPTA1胞膜外区的多克隆抗体,该抗体能与转染细胞表面天然mPTA1分子结合.mPTA1多克隆抗体对MLC诱导的CTL的杀伤有明显的抑制作用,并呈剂量依赖关系,mPTA1多抗加入的时间愈早,抑制杀伤作用的效果愈明显.结论抗小鼠PTA1的多克隆抗体可在小鼠混合淋巴细胞培养中明显抑制CTL的分化.
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小鼠胸腺树突样细胞系与胸腺树突状细胞抗原提呈能力的比较研究
目的 MTSC4(小鼠胸腺树突样细胞系)能诱导胸腺细胞阴性选择,为阐明该功能是否与其抗原提呈能力有关,对MTSC4 与新鲜胸腺树突状细胞(T-DC)的抗原提呈能力进行了比较研究. 方法应用MLR实验系统进行抗原提呈能力的比较分析;利用抗体阻断实验研究CD11c分子在抗原提呈中的作用. 结果 T-DC的抗原提呈能力分别是MTSC4、MTSC4-10(MTSC4 的10号克隆)、MTEC1(小鼠胸腺上皮细胞系1)的64、58、73倍,MTSC4、MTSC4-10、MTEC1之间APC能力无显著性差异.在联合细胞因子GM-CSF,IL-4,IFN-γ和anti-CD40 McAb诱导下,MTSC4-10的表型变化显著,其MHC classⅠ、MHC classⅡ、B7.1表达阳性率分别由10%、阴性、10%上调到95%、44.7%、52.7%;MTSC4-10表型改变伴随抗原提呈能力增加,但仍只有T-DC的1/23.T-DC 与MTSC4-10的表型,抗原提呈能力的差异提示我们关注CD11c的作用,并首次证实anti-CD11c单抗(N418)能明显阻断新鲜分离T-DC的抗原提呈作用,anti-B7.2单抗对其抗体阻断有协同作用. 结论 MTSC4的抗原提呈能力大大弱于T-DC;高表达于T-DC的CD11c分子在抗原提呈中可能有重要作用.
关键词： 小鼠胸腺树突样细胞系 胸腺树突状细胞 抗原提呈 混合淋巴细胞培养 CD11c -
分泌型PD-L1真核表达载体的构建、表达及其体外效应的初步研究
目的 构建分泌型PD-L1真核表达载体,并对其生物学活性进行初步研究.方法 以RT-PCR方法从孕鼠胎盘中获得程序性死亡因子-1(programmed death-1,PD-1)配体PD-L1的胞外段基因片段,定向连接于pcDNA3.1上构建真核表达载体pcDNA-PDL1;用脂质体将重组子导入NIT细胞,转染后的NIT命名为NITp.以Western blot鉴定重组蛋白的表达.MTT比色法检测NITp细胞培养上清对同种混合淋巴细胞培养反应的影响;用ELISA试剂盒检测NITp细胞培养上清对反应性T细胞分泌的细胞因子的影响.结果 RT-PCR得到约730bp目的基因片段,测序结果显示该目的基因与Gen-Bank上的序列相符;Western blot分析提示NITp分泌性表达目的蛋白;NITp培养上清可抑制混合淋巴细胞增殖,其效应呈剂量依赖性;反应性T细胞分泌的细胞因子检测结果显示,培养上清中IL-4、IFN-γ、IL-2水平降低,与正常对照组差异有统计学意义.结论 成功构建PD-L1基因真核表达载体pcDNA-PDL1,PD-L1蛋白对同种细胞刺激的增殖反应有抑制作用,并可在一定程度上抑制特异性T细胞的活化.
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强直性脊柱炎患者外周血CD4+调节性T细胞的变化及意义
目的 探讨强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)患者外周血中CD4+调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)的表达、功能及意义.方法 采用流式细胞术检测78例AS患者和50例健康志愿者外周血中CD4+CD25+CD127lo/- Treg、细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL)和NK细胞,采用ELISA法检测血清中β型转化生长因子(transforming growth factor-β,TGF-β)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的表达水平.从患者外周血单个核细胞中磁珠分选出CD4+CD25+ Treg细胞,混合淋巴细胞培养(mixed lymphocyte culture, MLC)分析其免疫抑制功能.结果 AS活动期患者外周血中CD4+CD25+CD127lo/-Treg占CD4+ T淋巴细胞的百分比为(4.36±1.21)%,MLC中CD4+CD25+ Treg抑制同种异体T淋巴细胞增殖功能低下,与其Treg分泌TGF-β减少相关,CD4+ Treg含量及功能均低于健康志愿者(P<0.05).AS患者外周血中CD4+CD25+CD127lo/- Treg水平与TGF-β呈正相关,与TNF-α呈负相关.结论 AS患者外周血中Treg表达水平低,且存在功能缺陷,导致体内诱导免疫耐受机能不足,可能参与AS免疫发病.
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口服抗原对同种异体移植免疫反应的影响
将Wistar大鼠预先喂养同种异基因SD大鼠脾细胞7天,然后接受SD大鼠的皮肤移植.7天后,再接受SD大鼠的心脏移植,观察口服抗原后体外混合淋巴细胞培养(MLC)、体内迟发型超敏反应(DTH)以及心脏存活时间.口服抗原后,体外MLC及体内DTH反应均出现明显的抗原特异性降低;口服抗原组大鼠并接受供者皮肤致敏后的心脏移植存活时间达到7天,与对照组未致敏鼠的心脏移植存活时间一致;而未口服抗原组接受皮肤致敏后的心脏移植存活时间不超过2天.提示口服抗原可以使异基因抗原的特异性免疫应答降低,延长移植物存活时间,阻止皮肤移植物的事先致敏反应的发生,并使加速性排斥反应时间明显延迟.
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段木栽培及袋栽灵芝多糖对体外培养小鼠脾淋巴细胞增殖活性的比较
目的比较段木栽培灵芝多糖(wood-cultured Ganoderma lucidum polysaccharides, Gl-PS-WC) 及袋栽灵芝多糖(bag-cultured Ganoderma lucidum polysaccharides, Gl-PS-BC)对体外培养小鼠脾淋巴细胞增殖活性的影响,探讨袋栽灵芝多糖替代段木栽培灵芝多糖的可能性. 方法检测两种灵芝多糖对混合淋巴细胞培养(MLC)反应的影响;观察对刀豆蛋白A (Con A)、细菌脂多糖(LPS)诱导淋巴细胞增殖的影响以及对环孢素A (CsA)、丝裂霉素C(Mit C)、足叶乙苷(VP-16) 等抑制MLC反应的影响.结果当质量浓度为0.2～12.8 mg*L-1时,两种灵芝多糖均可促进MLC反应,增强Con A或LPS诱导的淋巴细胞增殖,并拮抗CsA, Mit C或VP-16对MLC反应的抑制作用.未发现两种多糖之间有显著性差异.结论 Gl-PS-WC及Gl-PS-BC对体外培养脾淋巴细胞的增殖活性有类似作用.
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抗CD132抗体介导同种异型抗原激活的T细胞凋亡
目的研究抗CD132单抗在体外对T细胞增殖的抑制作用以及其可能的临床应用价值.方法分离BALB/c、C57BL/6小鼠的脾细胞进行双向混合淋巴细胞培养(MLC).分别于第一天(组1)或第三天(组2)加入抗CD132单抗(终浓度达到100 mg·L-1 ).用流式细胞技术检测细胞增殖(CFSE), T细胞凋亡 (PE-CD3, FITC-Annexin-v)以及细胞分裂周期 (propidium iodide stain ).T细胞Survivin 的表达则用免疫化学染色法检测.结果混合淋巴细胞培养的结果显示CFSE 标记的脾细胞出现了不同程度的荧光强度减弱, 提示不同分裂次数的细胞存在.与MLC组比较,组1和组2中均未发现有进一步细胞分裂的迹象存在 .在第3天时,组1可以检测到部分T细胞凋亡, 而在培养的初两天并无此现象.在组2中, 第4天处于G2/M期的细胞出现减少而凋亡细胞增多.对照组无此现象发生(P<0.01). 同时,在MLC组中可检测到survivin在T细胞表达, 而在组1和组2中则未能检测到.结论研究表明阻断CD132信号途径可以通过诱导同种异型抗原活化的T细胞凋亡而抑制T细胞增殖.因此,抗CD132单抗很有希望成为器官移植中抗排斥的临床药物.
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氧化锌纳米材料对小鼠混合培养的脾淋巴细胞的影响
目的 评价氧化锌(ZnO)纳米材料对不同品系小鼠脾淋巴细胞混合培养的影响.方法 提取BALB/C和C57BL/6小鼠脾细胞进行混合淋巴细胞培养,通过对细胞增殖率、IL-2水平的检测及电镜观察来研究氧化锌纳米材料对混合淋巴细胞培养的影响.结果 氧化锌纳米材料的加入提高了淋巴细胞增殖率及上清液IL-2水平,电镜下可见纳米材料吸附于淋巴细胞表面并促进淋巴细胞间的接触.结论 氧化锌纳米材料促进混合淋巴细胞培养中淋巴细胞的增殖,增强了免疫应答的强度.
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灯盏花提取物对异基因大鼠肾移植外周血树突状细胞的影响
背景:鉴于树突状细胞迁移在急性排斥反应发生机制中占据重要地位,人们通过使用某些药物延缓树突状细胞的迁移或通过阻断未成熟树突状细胞向成熟树突状细胞的转变来防治急性排斥反应.目的:观察灯盏花提取物对异基因大鼠肾脏移植模型血液中树突状细胞的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2008-11/2009-05在天津市人民医院进行.材料:灯盏花提取物由南开大学化学元素研究所提供.灯盏花属掌叶大黄类植物,提取物中包含2,5.二甲基-7-羟基色原酮、5,7,4'-三羟基黄酮(黄酮甙元).肾脏供体为32只清洁级雄性Wistar大鼠,32只SD大鼠为受体.方法:行原位左肾移植手术并同时切除受体右侧肾脏,移植后,按照随机数字表法分为生理盐水组、灯盏花提取物低、中、高剂量组.灯盏花提取物低、中、高剂量组分别腹腔注射灯盏花提取物5,10,15 mg/(kg·d),生理盐水组腹腔注射生理盐水.术后5 d收集大鼠外周血,经红细胞裂解液和淋巴细胞分离液处理后,接种于培养皿中,2 h后除去悬浮细胞,调整浓度1×109L-1加入1640完全培养液放于37℃、体积分数5%CO2培养箱中,第3天半量换液,第7天收获细胞.主要观察指标:观察树突状细胞形态并测定成熟状态;酶联免疫吸附法检测白细胞介素12水平;混合淋巴细胞培养测定细胞的抗原递呈功能.结果:生理盐水组树突状细胞树突分支增加、增粗、近圆形,体积较大,多角形或具有特征性的星形.灯盏花提取物作用下的细胞相对幼稚、稀疏,高剂量时差异更明显.灯盏花提取物组CD40、CD80、主要组织容性抗原Ⅱ表达率和白细胞介素12分泌量较生理盐水组明显降低(P＜0.01),随灯盏花提取物剂量增加,下降更明显(P＜0.01).反应和刺激细胞按10:1比例混合后,生理盐水组树突状细胞刺激淋巴细胞增殖的作用强(P＜0.01),随灯盏花提取物剂量增加,刺激作用逐渐降低(P＜0.01).结论:灯盏花提取物能抑制大鼠肾移植后外周血中树突状细胞的成熟和功能,随剂量加大,抑制作用增强.
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FTY720对体外混合培养淋巴细胞增殖和凋亡的影响
目的 观察FTY720对体外混合培养小鼠脾脏淋巴细胞的增殖、分化和凋亡的影响.方法 将C57BL/6J小鼠与BALB/c小鼠的脾脏淋巴细胞体外混合培养5d,培养液中加入不同浓度的FTY720.分别运用MTT法和流式细胞仪检测在不同浓度FTY720作用下,混合培养淋巴细胞的增殖状况、细胞表型和凋亡率.结果 当FTY720为400ng/mL时,体外混合培养淋巴细胞的增殖即受到明显抑制,抑制率为47.6%(P＜0.05);当FTY720为3 200ng/mL时,其抑制率达到为51.6%,呈剂量依赖性.FTY720为1 600ng/mL时,混合培养淋巴细胞中的CD4+CD25+T细胞比例显著增加(P＜0.05).FTY720在200ng/mL时,混合培养淋巴细胞的细胞凋亡率即显著增加(P＜0.05).结论 在小鼠混合淋巴细胞培养体系中加入高浓度的FTY720,能显著抑制淋巴细胞增殖能力,增加调节性细胞的比例并促进细胞凋亡.
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阻断B7/CD28途径诱导异种免疫耐受的体外研究
目的探讨B7单抗阻断B7/CD28通路在体外异种细胞免疫反应中的作用.方法分离豚鼠,大鼠外周血单个核细胞(PBMC),豚鼠细胞经丝裂霉素处理作为刺激细胞,大鼠细胞作为反应细胞,通过异种单向混合淋巴细胞培养(Xeno-MLC),3H-TdR掺入,酶联免疫吸附分析方法(ELISA),流式细胞仪(FCM)检测对照组,反应组,B7单抗组的淋巴细胞增殖效应(cpm),以及IFN-γ,IL-4和CD3+,CD3+CD25+,CD4+,CD8+,CD4+/CD8+的动态变化.结果 B7单抗组的淋巴细胞增殖效应(cpm),以及IFN-γ,IL-4和CD3+,CD3+CD25+,CD4+,CD8+的变化均显著低于反应组,但其对CD4+/CD8+比值无影响.结论 B7单抗可以部分抑制异种细胞间免疫反应,但仍存在其他机制有待阐明.
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混合淋巴细胞培养上清液中细胞因子水平与移植肾急性排斥反应的联系
目的:探讨混合淋巴细胞培养(MLC)上清液中细胞因子水平与肾移植术后急性排斥反应的关系,评价肾移植术前检测MLC上清液中细胞因子水平,作为预测急性排斥反应指标的临床价值. 方法: 选取48例接受同种异体肾移植术的患者为检测对象.在手术当日,分离其外周血单个核细胞(PBMC)与供者单个核细胞进行混合培养(反应组),同时以受者单纯自身PBMC进行培养(对照组).在培养第1、3、5天测MLC上清中IL-2和TNF-α水平,并观察其分泌动态变化.结果: 发生急性排斥反应的患者,在3次时间点上,两种细胞因子水平均高于肾功能稳定组,差异显著.在发生急性排斥反应和肾功能稳定的两组受者中,反应组较对照组细胞因子水平都有增加;急排的患者增加量高于肾功稳定的受者,差异显著.排斥组与肾功能稳定组两种细胞因子的分泌规律基本一致,但排斥组峰值都高于肾功能稳定组.结论:检测MLC上清液中细胞因子水平可以作为合理选择供受者、预测急性排斥反应的方法.
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猪到猴异种胸腺修饰对受体心脏移植物存活时间及外周血T细胞的影响
目的通过猪-猴心脏移植模型来探讨异种胸腺修饰对移植物存活时间的影响,并在此基础上,研究异种器官移植中T细胞的作用及诱导异种T细胞中枢性耐受的可能性.方法将受体(中国猕猴)分为4组:(1)空白组:对受体不作任何处理.(2)照射组:于心脏移植前30 d(d30),接受60Co 3Gy全身剂量,余同空白组.(3)胸腺注射组:于心脏移植前21 d(d21),胸腺内注射供体脾细胞(5×107),余同空白组.(4)照射+胸腺注射组(8只):于心脏移植前28 d(d28),即1.5月龄时接受60Co 3Gy全身剂量,心脏移植前21 d(d21),胸腺内注射供体脾细胞(5×107),余同空白组.结果照射+胸注组存活期较空白组明显延长(P<0.01),照射+胸注组存活期较胸注组和照射组延长(P<0.05).CD4+、CD8+与同期未照射的另两组相比有显著性差别(P<0.01),但照射的两组同期相比差别不大(P>0.05).照射+胸腺注射组于手术当天MLR刺激效应较空白组、照射组下降明显(P<0.01),同时单独胸腺注射组与照射组、照射+胸腺注射组相比,刺激效应也有所下降(P<0.05).结论 (1)异种胸腺修饰对CD4+、CD8+T细胞亚群的生成与分布情况并无影响,但其针对异种抗原反应能力有所下降.(2)异种胸腺注射可支持T细胞的重建和诱导供体特异性的T细胞功能抑制或耐受,并有效地延长供心存活时间.
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硼替佐米对混合淋巴细胞培养体系细胞因子的影响
目的 探讨蛋白酶体抑制剂硼替佐米(bortezomib)对混合淋巴细胞培养体系中细胞凋亡、细胞因子水平的影响.方法 体外建立单向混合淋巴细胞培养(MLC)体系,分别用2、4、8 nmol/L的硼替佐米干预反应体系,在不同的时间点收集细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡率、ELISA法检测培养上清液中白细胞介素2(IL-2)、γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量.结果 硼替佐米作用于细胞12、24、36 h后细胞凋亡率逐渐增加,8 nmol/L硼替佐米作用36 h细胞凋亡率为(61.67±3.21)% ;硼替佐米作用24 h后上清液中IL-2、IFN-γ、TNF-α浓度减小,8 nmol/L组的IL-2、IFN-γ、TNF-α浓度分别为(88.27±2.76 )ng/L、(57.36±2.08)ng/L、(22.19±0.88)ng/L.结论 硼替佐米能诱导细胞凋亡,使混合淋巴细胞培养体系细胞分泌的Th1型细胞因子减少.
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灵芝多糖肽和小分子灵芝多糖肽抗肿瘤作用和免疫调节作用比较
目的 比较灵芝多糖肽(GLPP)和小分子灵芝多糖肽(GL-LPP3)离体抗肿瘤作用及对免疫调节作用.方法 以GLPP和GL LPP3作用于肿瘤细胞株(SW480、MCF-7、K562细胞),以5 Fu作对照,24、48 h后收集细胞,考察其对肿瘤细胞的抑制率.建立混合淋巴细胞培养体系,以环孢素A为对照,用MTT法测定24,48,72 h细胞活性,观察GLPP和GL-1PP3对免疫的调整作用. 结果 GLPP和GLLPP3对肿瘤细胞株SW480、MCF-7、K562存活率无抑制作用;GLPP和GL-LPP3可增强淋巴细胞免疫作用. 结论 GLPP和GL-LPP3体外不能直接抑制或杀伤肿瘤细胞,可增强T淋巴细胞免疫功能.
