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MLPA和PCR-RFLP技术用于脊髓性肌萎缩症的基因诊断
目的:应用多重连接依赖式探针扩增法(MLPA)和PCR-RFLP技术对临床诊断为脊髓性肌萎缩症(SMA)患儿进行基因诊断,并比较两种方法检测SMN基因缺失改变的效果.方法:应用TIANGEN(R)血液基因组DNA提取试剂盒抽提3个SMA家系成员的外周血样品DNA,电泳检测,定量,常规PCR法扩增SMN基因的7号外显子,Dra Ⅰ酶切PCR产物,常规聚丙烯胺凝胶电泳法分离酶切后PCR产物,银染检测.同时应用MLPA检测试剂盒P021进行检测.结果:PCR-RFLP显示3个家系中的患儿均纯合缺失SMN1的第7号外显子,MLPA检测结果与之完全相符,但同时还检测出这3个SMA家系中的患儿均纯合缺失SMN1的第8号外显子.结论:与PCR-RFLP相比,MLPA更加简便、快捷、可靠,是一种高效的遗传病基因诊断手段.
关键词： 脊髓性肌萎缩症 多重连接依赖式探针扩增 基因诊断 -
Duchenne肌营养不良15例临床及基因分析并文献复习
目的：探讨假肥大型肌营养不良（DMD）的临床特征及基因缺失检测方法，为进一步产前基因诊断提供可靠方法。方法选择2011～2013年在南京儿童医院神经科就诊的15例临床诊断DMD患者（均为男性，就诊年龄2～14岁，平均8.1岁），应用多重连接依赖式探针扩增（MLPA）对患儿进行基因诊断，对经基因确诊的患者的临床相关资料及基因缺失结果进行回顾性分析并复习相关文献。结果 DMD好发于儿童，男性为主，异常步态，以肌无力和肌肉萎缩尤其小腿腓肠肌为特点，可有假性肥大，Gower 征阳性。患儿血清激酶异常增高往往伴有肝功能异常，心电图、超声心动图可有异常表现，肌电图显示肌源性损害。15例临床诊断患儿行MLPA检测，其中9例检测出外显子缺失，患儿基因缺失占66.7%，突变热点集中在外显子43～55区域。结论认识DMD临床特征有助于提高对该病临床诊断水平，直接基因分析为临床确诊 DMD 提供了可靠依据，有较高产前诊断和遗传咨询价值。
关键词： 肌营养不良 杜氏 基因 多重连接依赖式探针扩增 -
MLPA 技术检测发育迟缓和智力障碍患儿的染色体微小重排的应用价值
目的：探讨多重连接依赖式探针扩增（ MLPA）在疑似染色体微小重排引起的发育迟缓或智力障碍（ DD/ID）患儿诊断中的应用价值。方法回顾性分析2012年6月至2013年12月在北京大学第一医院儿科神经门诊和病房就诊并临床诊断为不明原因的DD/ID患儿共276例的检测结果。患儿外周血提取基因组DNA，用MLPA方法进行检测，包括检测亚端粒区缺失/重复的P070和P036试剂盒；检测22个常见染色体微缺失和重复综合征的P245试剂盒。结果在276例患儿中检测到58例异常，检出率为21％。累及1条常染色体亚端粒区重排者32例，其中缺失突变25例，重复突变7例；同一条染色体两臂亚端粒区均缺失者2例；累及2条常染色体亚端粒区者9例，均表现为一条染色体亚端粒区缺失，而另一条重复；累及3条染色体亚端粒区者1例，2条表现为重复，1条为缺失。累及性染色体亚端粒重复1例，缺失1例（Xq/Yqdel）。检测出了22种常见微缺失重复综合征中的11种综合征，6种位于亚端粒区。结论 MLPA技术可以作为一种高效和特异的方法对诊断不明确的DD/ID患儿进行遗传病因学检测。
关键词： 染色体 发育障碍 智力障碍 亚端粒 多重连接依赖式探针扩增 -
中国人群中苯丙酮尿症患者苯丙氨酸羟化酶基因大片段缺失突变分析
目的 分析苯丙酮尿症(PKU)患者苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因大片段缺失突变的类型及分布情况.方法 2006至2014年北京协和医院产前诊断中心和甘肃省医学遗传学中心共对953例PKU患者进行了PAH基因诊断,对其中43例经Sanger测序仍存在未知突变的PKU患者采用多重连接依赖式探针扩增技术(MLPA),进行PAH基因的外显子缺失或重复分析,并采用间隙PCR(Gap-PCR)及测序技术确定缺失突变的断点位置.结果 43例PKU患者的47个未知突变等位基因中,22例患者检测到24个大片段缺失/重复突变等位基因,占突变性质不明等位基因的51.1％(24/47).其中缺失突变6种,分别是Ex1 del3758突变(10个)、Ex4_5del突变(4个)、Ex4_7del突变(3个)、Ex1 del5329ins56突变(3个)、Ex3del6599ins8突变(2个)、Ex4del突变(1个);重复突变1种,为Ex12dup(1个).在这些缺失/重复突变中出现频率较高的为:Ex1del3758 (21.3％)、Ex4_5del(8.5％)、Ex4_7del(6.4％).结论 中国人群中存在PAH基因大片段缺失突变,具有明显的热点突变种类.
关键词： 苯丙酮尿症 苯丙氨酸羟化酶 大片段缺失突变 多重连接依赖式探针扩增 -
多重连接依赖式探针扩增技术在α地中海贫血基因诊断与产前诊断中的应用
目的 探讨多重连接依赖式探针扩增(M LPA)技术在α地中海贫血(地贫)基因缺失检测及产前诊断中的应用.方法 采用全血细胞计数和血红蛋白成分检测对受检者外周血标本进行表型分析,采用常规跨越裂点PCR(gap-PCR)技术及反向斑点杂交(RDB)法检测α地贫基因缺失及点突变,采用MLPA技术检测α珠蛋白基因缺失；产前诊断采用gap-PCR和MLPA法对胎儿标本进行α地贫基因缺失检测.结果 1256份(628对夫妇)受检者外周血标本中,75份检出α地贫表型特征.其中71份经常规方法检出α地贫基因突变且与表型相符；3份经常规方法未检出基因突变和1份具有血红蛋白H病表型且基因型为-α4.2/αα的标本,经MLPA法各检出1例α珠蛋白基因簇大片段缺失；筛出17对高风险夫妇.17份产前诊断标本中,2份受外源DNA污染的绒毛标本经MLPA法获得确诊.结论 MLPA是α地贫基因缺失常规gap-PCR检测方法的有效补充,可防止α地贫基因缺失的漏诊及产前诊断中的假阳性或假阴性误诊.
关键词： α地中海贫血 分子诊断技术 产前诊断 多重连接依赖式探针扩增 -
汉族多巴反应性肌张力障碍患者中的GTP环化水解酶Ⅰ基因缺失
目的:基于对汉族人群中的多巴反应性肌张力障碍(DRD)患者基因突变的研究,进一步探究GTP环化水解酶Ⅰ基因(GCH1)、酪氨酸羟化酶基因(TH)、Epsilon-sarcoglycan编码基因(SGCE)上是否存在外显子缺失.方法:对来自4个DRD家系共8名患者及其5名无症状家属、10名散发性DRD患者和3名正常对照者的GCH1、TH、SGCE基因的22个外显子进行多重连接式探针扩增(MLPA)分析,对MLPA结果出现异常的外显子采用实时定量PCR(qPCR)进行验证,然后使用ddCt法与正常对照者比较分析GCH1、TH、SGCE基因是否存在外显子缺失.结果:1名散发性DRD患者的GCH1基因1号外显子出现杂合缺失,正常对照均未发现此外显子缺失.其余家系或散发性患者未检测到外显子缺失或扩增.结论:在汉族人群中,散发性DRD患者GCH1基因存在外显子缺失,但出现频率较低;对于突变阴性的散发性DRD患者,有必要检测其GCH1基因是否存在缺失.
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运用MLPA进行脊肌萎缩症的基因诊断
目的:应用多重连接依赖式探针扩增法(MLPA)和聚合酶链式限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)技术对30例临床疑似脊肌萎缩症(SMA)患者进行基因诊断,并对两种方法进行比较.方法:盐析方法提取30例家系成员外周血DNA,常规PCR方法扩增SMN7、8外显子,用DralⅠ和DralⅠ酶切PCR产物,琼脂糖凝胶电泳检测PCR及酶切产物.同时利用MLPA试剂盒P021方法进行验证比较.结果:经PCR-RFLP方法判断22例SMN1第7+8号外显子纯合缺失患儿和2例Ex7纯合缺失患儿,与MLPA方法一致；其余6例PCR-RFLP方法未见异常家系,经MLPA方法分析发现1例患儿和2例母亲为SMN1外显子7、8杂合缺失携带者；MLPA方法还在SMA家系中发现3例“2+0”型携带者.SMN2拷贝数在SMA患者中以4、5为主,携带者以2、3为主,正常人以1、2多见,其各拷贝数的频率分布在患者组与携带者组(x2=30.694)、患者组与正常人组(x2=21.997)中差异有统计学意义(P＜0.01),而在携带者与正常人组差异无统计学意义(x2=3.5,P＞ 0.05).结论:与PCR-RFLP相比,MLPA更加简单、准确、高效,还能够准确定量SMN1、SMN2,是一种高效的遗传病基因诊断方法.
关键词： 肌萎缩 脊髓性 多重连接依赖式探针扩增 扩增片段长度多态性分析 SMN基因 基因诊断 -
DMD/BMD患者的dystrophin基因表达研究
目的 探讨杜氏进行性肌营养不良(DMD)/贝氏进行性肌营养不良(BMD)患者的dystrophin基因突变与蛋白质表达之间的关系.方法 用多重连接探针扩增(MLPA)法检测14例DMD/BMD患者dystrophin基因突变,肌肉活检观察组织的形态结构特点,免疫组织化学染色检测患者腓肠肌组织中dystrophin蛋白的表达情况.结果 14例DMD/BMD患者中有3例检出dystrophin基因缺失,其余未检出基因突变.肌肉活检结果显示,14例患者均可见肌纤维大小不一,圆形化,肌纤维明显变性、坏死,不同程度再生;部分肌纤维间可见少量炎性细胞浸润,结缔组织增生.免疫组织化学染色显示,3例未表达dystrophin基因突变患者的肌纤维膜dystrophin蛋白不同程度表达减弱,其余11例患者可见肌纤维膜dystrophin蛋白质表达完全缺失.结论 MLPA联合肌肉活检及免疫组化染色可以鉴别诊断DMD/BMD,为患者的诊治和预后提供了依据.
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MLPA技术检测热性惊厥患儿SCN1A基因
目的 探讨热性惊厥的临床特点及其与电压门控性钠离子通道α1亚单位基因(SCN1A)的关联.方法 收集34例热性惊厥患儿的临床资料及外周血并提取其DNA,采用多重连接依赖式探针扩增技术对热性惊厥患儿的sCN1A基因进行检测.结果 34例热性惊厥患儿中单纯性热性惊厥29例,复杂性热性惊厥5例,所有患儿均进行SCN1A基因检测,均未发现SCN1A基因外显子缺失或重复.结论 SCN1A基因外显子的缺失或重复可能不是热性惊厥的潜在病因.
关键词： 惊厥 发热性 基因 SCN1A 多重连接依赖式探针扩增 -
宁夏地区苯丙酮尿症患儿苯丙氨酸羟化酶基因突变分析
目的：分析宁夏地区苯丙酮尿症（PKU）患者苯丙氨酸羟化酶（PAH）基因突变分布特征，了解其热点突变位点及区域。方法采用直接测序的方法，首先对30例宁夏地区 PKU 患者 PAH 基因6个热点突变外显子3，5，6，7，11，12进行测序，对未检出突变的患者再进行外显子1，2，4，8，9，10，13测序。采用多重连接探针扩增（MLPA）方法对于通过测序方法未能明确突变基因型的患者进行外显子大片段缺失突变检测。结果通过对30例患者进行全部外显子序列突变分析，在60个等位基因中明确了58个突变等位，检出率为96.7％。其中在外显子3、5、6、7、11、12检出了49个突变，检出率为81.6％。这58个突变等位分属于23个突变位点，包括错义突变9种、剪接突变9种、无义突变2种、微小缺失突变2种、大片段缺失突变1种。其中 R243Q 突变频率高（18.3％），其次是 IVS4-1G ﹥ A（11.7％）和 R111X（11.7％）。在外显子11的测序中发现了一个新的缺失突变 N393del。采用 MLPA 技术在3例患者中检测到了大片段缺失突变 c.-1932+3402del，其中1例为纯合缺失，2例为杂合缺失突变。结论宁夏地区 PKU 患者 PAH 基因突变具有明显的热点突变和突变热点区域。宁夏地区 PKU 患者存在 PAH 基因大片段缺失突变，MLPA 技术是检测 PAH 基因大片段缺失的有效手段。
关键词： 苯丙酮尿症 苯丙氨酸羟化酶 基因测序 多重连接依赖式探针扩增 宁夏地区 -
多重连接依赖式探针扩增技术在遗传病分子诊断中的应用
多重连接依赖式探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)是近年发展起来的基因检测新技术,可通过简单的杂交( hybridization)、连接(ligation)及PCR( polymerasechain reaction)扩增反应于同一管内同时检测出多达40种基因组DNA或RNA拷贝数变化.凭借其操作简单、高通量、稳定可靠等特点,该技术在遗传病的分子诊断等领域的应用已得到迅速的推广,本文就MLPA技术的原理、特点以及在遗传病分子诊断中的实际应用等作一综述.
关键词： 多重连接依赖式探针扩增 遗传病 分子诊断 -
应用多重连接依赖式探针扩增技术快速高通量诊断胎儿染色体非整倍体异常
目的 评价多重连接依赖式探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)在染色体非整倍体诊断中的应用价值,为我国羊水染色体诊断提供一种快速、特异、高通量的分子诊断手段.方法 应用MLPA技术检测了500份羊水标本,所有标本均进行荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)技术检测和常规染色体核型分析,应用RH-MLPA-v511数据分析软件获得MLPA结果,比较MLPA技术与FISH和染色体核型分析结果的准确性,总结MLPA技术临床应用过程中的关键要点.结果 在500份羊水标本中,MLPA检测成功率97%.3个工作日完成结果的为92%,需重复检测的为5%,失败为3%.对染色体非整倍体异常检测敏感性和准确性100%.证实38例非整倍体病例探针信号比值＞正常二倍体4s,2例疑似三体结果＞2s.分析了21号染色体8条探针的杂交效率,21三体患者8条探针中平均4条探针比值＞1.3.结论 MLPA技术具有快速、特异、敏感、高通量、成本低等特点,可用于产前染色体非整倍体数目的快速检测,是传统染色体培养方法的补充,临床应用价值较高.
关键词： 多重连接依赖式探针扩增 核型分析 产前诊断 非整倍体
