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血清饥饿对结肠癌HCT116细胞外泌体分泌的影响
目的:本研究尝试使用添加无外泌体血清(Exosome-depleted FBS)的培养基培养细胞并提取外泌体,比较无外泌体血清和传统的无血清两种不同的培养条件对结肠癌HCTll6细胞外泌体分泌的影响,旨在优化外泌体提取条件,使之有利于后续功能研究.方法:采用提取前24 h无血清和添加无外泌体血清培养基培养结肠癌细胞,普通光学显微镜下观察两种培养条件下细胞的生长和形态,用超速离心法分步提取分泌到细胞培养上清中的外泌体,透射电子显微镜下观察外泌体的形态,蛋白免疫印迹法分析外泌体标志蛋白,以及纳米颗粒追踪计数分析外泌体大小和含量.结果:与无血清培养条件相比,添加无外泌体血清培养的HCTll6细胞生长状态良好,细胞无明显死亡现象.两种培养条件分泌的外泌体形态相近,均呈圆形或椭圆形,由脂质双分子层包裹的小囊泡,直径为40-100 nm.无外泌体血清培养条件分泌的外泌体大约是无血清培养的6倍,二种培养条件下提取的外泌体直径均为90 nm左右,与电镜结果一致.两种培养条件提取的外泌体中均检测到HSP70和CD63外泌体标志蛋白.结论:添加无外泌体血清培养HCTll6细胞分泌的外泌体与无血清培养相比无明显差异,但添加无外泌体血清培养的细胞状态比无血清培养的细胞状态好,外泌体的分泌可能更接近生理条件下的生长环境,分泌的外泌体数量更多,因此无外泌体血清培养条件较无血清培养更适合结肠癌来源外泌体的提取和研究.
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肠上皮细胞来源整合素αVβ6对树突状细胞功能的影响
目的:研究肠上皮细胞(intestinal epithelial cells,IEC)来源的整合素αVβ6对骨髓来源树突状细胞(bone marrow-derived dendritic cells,BMDCs)功能的影响.方法:分离、培养小鼠IEC和DC,IEC经卵清蛋白(ovalbumin,OVA)刺激后,多步离心法制备外泌体(exosome).应用免疫胶体金对外泌体中的整合素αVβ6进行定性,通过免疫磁珠技术,分离获取DC,流式细胞仪检测分离后DC纯度,然后将分离后的DC分5组,分别为空白组、OVA组、外泌体组、外泌体+抗整合素αVβ6抗体组、外泌体+羊抗小鼠IgG组,观察各组对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激的反应.ELISA法检测DC在LPS刺激前后IL-12p70的表达.LPS刺激前活性转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)以及总TGF-β1的表达.结果:OVA组与空白组相比,总TGF-β1表达明显增高(226.636±40.355 vs 176.947±23.072,P＜0.05),但活化TGF-β1表达无明显变化(P＞0.05).空白组与外泌体+抗整合素αvβ6抗体组相比,活化TGF-p1表达无明显变化(P＞0.05),但总TGF-β1表达明显增高(P＜0.05).外泌体组和外泌体+羊抗小鼠IgG组与空白组相比,活化TGF-p1和总TGF-β1表达均明显增高(P＜0.05).相比空白对照组,LPS刺激48 h后外泌体组和外泌体+羊抗小鼠IgG组IL-12p70表达明显降低(P＜0.05),OVA组及外泌体+抗整合素αVβ6抗体组IL-12p70表达无明显差异(P＞0.05).结论:IEC来源整合素αVβ6能增加DC活性,以及TGF-β1和总TGF-31的表达量,并拮抗LPS对BMDC的促成熟作用.
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外泌体与肿瘤预转移龛形成的新进展
转移是影响肿瘤患者治疗效果与预后的大障碍,揭示肿瘤转移机制对肿瘤诊疗水平提高具有重大意义.以往转移机制的研究多集中在原发瘤中癌细胞与间质细胞相互作用,而近年研究显示,原发瘤癌细胞也可释放一些活性物质随血循环到达靶器官,招募骨髓衍生细胞并与靶器官组织固有细胞相互作用,对靶器官组织微环境进行改造重塑,加速预转移龛形成,以利于转移在靶器官中的实现.其中,癌细胞来源的外泌体在介导原发瘤及远端靶器官预转移龛形成中发挥重要“桥梁”作用,本文就外泌体与肿瘤预转移龛形成的新进展进行总结阐述.
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外泌体在消化系统肿瘤诊断中的应用
外泌体是细胞分泌的一种纳米级囊泡结构,在血液、唾液、尿液等多种体液中均有分布.作为一类重要的细胞间通信分子,外泌体含有核酸和蛋白质等多种具有生物活性的成分,可通过多种方式在人体中发挥调节作用.在多种类型的细胞中均发现外泌体的存在,肿瘤来源或肿瘤相关的外泌体是调控肿瘤发生发展的重要机制,对肿瘤外泌体的分析和检测可以辅助肿瘤的早期诊断、疗效评价和预后分析,已成为肿瘤领域的研究热点.本文将就近年来外泌体在消化系统肿瘤诊断中的作用进行简要综述.
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外泌体与糖尿病肾病的研究进展
DN是糖尿病的重要并发症之一.目前,DN的致病机制尚不完全清楚,有效的治疗手段尚不足,因此,早期诊断和防治DN已成为医学领域的重要问题.近年,外泌体相关研究倍受关注,以外泌体为主的细胞外囊泡因参与运载细胞特异性蛋白、脂质体及遗传物质在细胞间信息交流而成为研究热点.本文将针对外泌体的生物学特性及其在DN中的相关研究进行简要综述.
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外泌体——糖尿病发生及其心血管并发症的重要信号分子及运动干预的潜在靶点
外泌体(EXs)是一种成分多样性和功能多效性的信号分子,可将生物信号传递至受体细胞,导致功能变化,调节多种病理生理过程,是一种极具特点和优势的信号传递方式,也是糖尿病发生及其心血管并发症的重要调控因素.EXs的数量、成分与疾病状态密切相关,对糖尿病心血管病的形成及进展能提供有价值的信息,特别是内含物miRNA的表达模式有明确的指示作用.作为EXs数量及成分的调节机制,运动通过EXs途径改善糖尿病心血管病,具备坚实的理论基础.
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外泌体基本生物学特性及其治疗心肌梗死的研究进展
心肌梗死是所有心血管疾病死亡的首要原因。心肌梗死后受损心肌启动修复及心室重构的分子机制显示心肌细胞所分泌的可溶性因子在细胞局部交流及远程信息交换中发挥重要作用。目前，大量研究证实，以外泌体为主的细胞外囊泡因其运载的细胞特异性蛋白、脂质体及遗传物质在细胞及组织交流过程中扮演重要角色。本文将针对外泌体基本生物学特性的研究进行综述，并评价不同来源的外泌体治疗心肌梗死的潜能。
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外泌体在肿瘤中的研究与进展
近年来,越来越多的人开始对外泌体进行研究.外泌体具有传递信息,转录RNA的功能,其非编码区mRNAs是肿瘤等疾病发病机制的研究焦点.大量研究表明,肿瘤细胞可以释放大量外泌体,产生局部效应和全身反应.这篇文章中,我们针对外泌体新研究进行总结,大致归纳为两点:(1)外泌体在肿瘤的生物学功能和机制有着重要作用;(2)外泌体可以作为肿瘤诊断的标志物,并可以监测病情变化.
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干细胞胞外囊泡在急性呼吸窘迫综合征中的治疗作用
急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是在直接和间接原因触发下免疫系统与肺泡上皮毛细血管屏障相互作用,急性炎症反应引起肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞损伤,导致肺蛋白通透性增加、弥漫性肺间质及肺泡水肿,进而造成难以纠正的急性低氧血症[1].目前主要的治疗方式限于肺保护性策略即小潮气量机械通气,治疗效果欠佳,死亡率仍高达40％ ～ 70％[2].
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外泌体作为非小细胞肺癌诊断标志物的研究进展
外泌体(exosomes)是具有脂质双层膜结构、直径为30～100 nm的微小囊泡,是细胞经过“内吞-融合-外排”等一系列调控过程后由细胞主动分泌的一种物质.外泌体的产生和分泌受多种蛋白质精确调节[1].在正常或应激条件下,几乎所有类型的细胞都可以分泌外泌体,如网织红细胞、树突状细胞、脂肪细胞、内皮及上皮细胞等.与来源同一组织器官类型的正常细胞相比,肿瘤细胞能分泌更多的外泌体.
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大鼠血清外泌体对MCF-7细胞自噬的影响
目的 观察SD大鼠血清外泌体对乳腺癌(MCF-7)细胞自噬的影响.方法 将MCF-7细胞分为正常对照组、雷帕霉素组、外泌体组及联合给药组,外泌体组为加入10％(v/v)外泌体培养48 h,雷帕霉素组为加入雷帕霉素(30 nM)作用24 h,联合给药组为加入10％(v/v)外泌体培养48 h后,再加入雷帕霉素(30 nM)作用24 h,正常对照组仅使用10％DMEM培养基培养48 h.采用CCK-8法检测各组乳腺癌细胞的存活率;荧光显微镜观察MCF-7细胞LC3B蛋白的荧光强度;Western blotting法检测MCF-7细胞LC3B.结果 4组细胞的存活率无显著性差异,MCF-7细胞LC3B2/LC3B1比值分别为1.317±0.430、2.308±1.085、0.808±0.350、1.110±0.496.外泌体组与雷帕霉素组有显著性差异;联合给药组与雷帕霉素组也有显著性差异.结论 大鼠血清外泌体能减少MCF-7细胞的自噬现象.
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骨细胞及干细胞分泌的外泌体在骨重塑中的作用
外泌体是由多泡体与细胞膜融合后,以外分泌的形式释放到细胞外的直径为30~100 nm 的细胞外囊泡,目前大量研究发现其广泛参与骨相关疾病及骨重塑过程,具有较好的生物学活性.由于成骨细胞和破骨细胞之间的动态平衡在骨重塑过程中起关键作用,而且干细胞在骨重塑方面已显示了巨大的前景,因此,本文就骨细胞及干细胞分泌的外泌体在骨重塑中的作用进行综述,希望能为骨科相关疾病的防治提供研究思路.
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髓核细胞来源外泌体对骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化的作用
目的:探讨人髓核细胞(NPCs)外泌体对人骨髓间充质干细胞(BMSCs)向髓核样细胞分化的作用.方法:取腰椎间盘突出症患者手术切除的髓核组织,体外分离培养人NPCs,采用差速离心法提取NPCs的外泌体,利用透射电镜及Western blot对外泌体进行大小形态及标志蛋白的检测,同时用PKH67荧光染料标记外泌体后与BMSCs共孵育0.5h、2h、4h,在激光共聚焦显微镜下观察BMSCs对NPCs外泌体的摄取情况;取人BMSCs经NPCs外泌体诱导3d、7d、10d、14d后应用RT-PCR检测BMSCs中蛋白聚糖(ACAN)、SOX-9、Ⅱ型胶原(COL2A1)、角蛋白19(KRT19)及缺氧诱导因子1α(HIF-1α)的mRNA表达情况.结果:提取的人NPCs外泌体为直径为30～ 100nm的圆形或椭圆形结构,其表达CD63和Tsg101,不表达Calnexin蛋白.经PKH67标记的NPCs外泌体可以被BMSCs摄取;经NPCs外泌体诱导后7d开始BMSCs中的ACAN、SOX-9、COL2A1、KRT19及HIF-1α基因mRNA表达均显著性高于未经诱导的BMSCs (P＜0.05).结论:在体外实验中,人NPCs可以分泌外泌体并被BMSCs所摄取,诱导BMSCs分化为髓核样细胞,可为椎间盘退变的组织工程修复提供更为简单有效的NPCs来源.
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骨髓间充质干细胞来源的外泌体静脉移植对脊髓损伤的修复作用
目的:初步探讨大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow stem cells.BMSCs)来源的外泌体静脉移植对脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)的修复作用.方法:全骨髓培养法培养大鼠BMSCs.收集P2代细胞上清,ExoQuick Precipitation提取法分离并纯化外泌体,通过透射电镜观察鉴定外泌体形态,采用Western blot鉴定外泌体表面标志蛋白CD9、CD63.通过脊髓法建立大鼠SCI模型,造模1h后尾静脉给予外泌体移植500μl(外泌体蛋白浓度为200μg/ml),采用随机数字表法分将30只大鼠为三个组:假手术组、对照组(SCI+磷酸盐溶液)、外泌体组(SCI+外泌体),均采用BBB评分、斜板实验于造模后1、3、7、14、21、28d评价大鼠运动功能恢复情况,并于术后28d处死取材,采用苏木精-伊红(HE)染色、髓鞘(luxol fast blue,LFB)染色观察各组脊髓组织形态学改变,尼氏(Nissl)染色观察神经元存活数目.结果:透射电镜下可见大量直径40～100nm的立体圆形或茶托形的小囊泡结构,外周可见完整的类脂质膜性结构,内含低电子密度物质.Western Blot显示CD9、CD63蛋白表达阳性.造模后假手术组各时间点的BBB评分和斜板评分均正常,对照组和外泌体组BBB评分和斜板评分均低于假手术组(P.＜0.05),造模后7、14、21、28d外泌体组BBB评分分别为6.30±0.95、12.70±1.57、16.60±1.08、17.00±0.67分,均高于同时间点对照组的2.50±1.08、6.90±0.99、10.50±0.85、12.50±1.08分(P＜0.05).造模后7、14、21、28d外泌体组斜板评分分别为43.00±3.50、55.50±4.38、62.50±2.64、65.00±3.33分,均高于同时间点对照组的34.00±3.16、43.00±4.22、49.00±4.59、52.50±4.25分(P＜0.05).造模后28d,假手术组脊髓组织HE染色、LFB染色、Nissl染色正常,对照组脊髓空洞形成、髓鞘排列紊乱、神经元数目减少,外泌体组与对照组比较脊髓组织损伤程度减轻,存活神经元数目增多(P＜0.05).结论:MSCs来源的外泌体可减轻脊髓损伤后的病理变化,改善运动功能,促进脊髓损伤后神经功能修复.
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大鼠髓核细胞来源外泌体对骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化的作用研究
目的:探讨大鼠髓核细胞来源外泌体对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向髓核样细胞分化的作用.方法:采用贴壁法体外分离培养SD大鼠尾椎椎间盘髓核细胞和BMSCs,流式细胞术和三系分化实验鉴定BM-SCs.差速离心法分离髓核细胞外泌体,透射电镜观察其形态并使用蛋白免疫印迹(Western blot)检测其蛋白标志物CD81、Tsg101.分别使用荧光探针CM-DIO和CM-DIL标记BMSCs和髓核细胞外泌体,将两者共培养24h后在荧光显微镜下观察BMSCs对髓核细胞外泌体摄取情况.将第三代BMSCs分为三组:外泌体组,加入髓核细胞外泌体(50μg/ml);共培养组,与髓核细胞非接触式共培养;对照组,未做任何处理.分别于7、14、21d时应用荧光定量PCR (qRT-PCR)检测外泌体组和对照组Ⅱ型胶原(COL2A1)、蛋白多糖(ACAN)、SOX9的mRNA表达量.14d时应用qRT-PCR检测3组的COL2A1、ACAN、SOX9的mRNA表达量.结果:提取的第三代大鼠髓核细胞呈多角形或不规则形状,第三代BMSCs呈形态均一的长梭形.BMSCs高表达CD29 (99.77％)、CD44(93.97％)、CD90(99.67％),低表达CD34(0.82％)、CD45 (0.68％).BMSCs成骨、成脂、成软骨诱导后染色均为阳性.透射电镜观察外泌体为30～100nm类圆形双层膜结构,其表达CD81、Tsg101蛋白,不表达Calnexin蛋白.荧光显微镜下CM-DIL标记的外泌体可被CM-DIO标记的BMSCs摄取.诱导7、14、21d后,外泌体组的COL2A1、ACAN、SOX9 mRNA表达量均显著高于对照组(P＜0.05).14d时共培养组COL2A1、ACAN、SOX9的mRNA表达量均显著高于对照组,低于外泌体组(P＜0.05).结论:大鼠髓核细胞外泌体可在体外诱导BMSCs向髓核样细胞分化,且诱导效果优于与髓核细胞的非接触式共培养,可为椎间盘组织工程提供一种有效的髓核细胞来源.
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iPSC外泌体载体肺血管内皮细胞及肺泡Ⅱ型上皮细胞摄入研究
目的 全身炎症反应在体外循环致肺损伤过程中起关键作用.外泌体载体能否被肺脏靶细胞有效摄入是急性肺损伤(ALI)基因治疗的关键.方法 超速离心法提取体外培养的iPS细胞外泌体,Western Blot鉴定其特征蛋白表达.PKH26标记的外泌体与肺微血管内皮细胞和肺泡Ⅱ型上皮细胞体外共培养,免疫荧光共聚焦技术检测靶细胞对外泌体的吸收、摄取情况.结果 iPS细胞来源的外泌体可以被肺微血管内皮细胞和肺泡Ⅱ型上皮细胞有效摄入.结论 iPS细胞外泌体可以被肺脏靶细胞有效摄入,是ALI基因治疗的理想载体.
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外泌体在胰腺癌患者诊疗中的作用
外泌体是一类直径约30～150 nm的小囊泡,广泛分布于体液中.其内容物丰富,包含蛋白质与核酸等生物活性物质,参与细胞间信号传导和物质转运等过程.外泌体通过促进肿瘤微环境的形成及对吉西他滨的抵抗,影响胰腺癌的发生和发展.血液循环中磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(GPC-1)阳性的外泌体以及外泌体中高表达的miR-10b等均可作为胰腺癌患者早期的无创性诊断方法.同时,外泌体作为一种新型的药物传输系统,可将基因类药物、抗癌药物等传输至肿瘤细胞并发挥作用.本文对外泌体在胰腺癌发生、发展及诊疗中的作用做一综述.
关键词： 外泌体 胰腺癌 磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1 诊断 治疗 -
外泌体源性微RNA在肝细胞癌发生发展及诊断中的作用
外泌体是一种纳米级别的囊性小泡,内含蛋白质、脂质、DNA、RNA(mRNA和miRNA)等多种不同分子,存在于多种体液中.外泌体源性miRNA在机体免疫调节、凝血机制、细胞迁移、细胞分化、介导细胞间交流等方面有重要作用,有望成为肝细胞癌(HCC)诊断的新指标和靶向治疗的新途径.本文就外泌体以及外泌体miRNA的生物学特性及其在HCC发生发展及诊断中的作用作一综述.
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HCV 感染者中血清外泌体 miRNA-122的检测及其临床意义
目的：探讨丙型肝炎病毒（HCV）感染者血清外泌体 miRNA-122的表达及其与血清中循环 miRNA-122的关系。方法选取2012年1月至2015年12月陕西省汉中市中心医院收治的HCV 感染导致的24例慢性丙型肝炎（CHC）、21例肝硬化和15例肝癌患者，同时选取20名健康体检者作为对照，收集所有研究对象的血清样本，分离血清外泌体并提取外泌体中总 RNA，采用实时定量PCR 检测血清及其外泌体中 miRNA-122的表达。采用方差分析比较四组血清及其外泌体中miRNA-122的表达差异，采用 Pearson 相关系数分析外泌体 miRNA-122和血清循环 miRNA-122之间的相关性。结果以健康对照组血清外泌体和血清循环中 miRNA-122的表达设为1．00，CHC 组、肝硬化组和肝癌组血清外泌体 miRNA-122的表达为1．33±0．11、0．98±0．13和0．52±0．09，差异具有统计学意义（F ＝3．316，P ＜0．05），其中 CHC 组高于健康对照组和肝癌组（t ＝4．028和9．906，P 均＜0．05），肝硬化组高于肝癌组（t ＝5．631，P ＜0．05），肝癌组低于健康体检组（t ＝5．878，P ＜0．05）；CHC组、肝硬化组和肝癌组血清 miRNA-122为3．66±1．11、2．88±0．71和2．16±0．48，差异具有统计学意义（F ＝7．823，P ＜0．05），仅 CHC 组高于健康对照组（t ＝4．653，P ＜0．05）。Pearson 相关性分析显示CHC 组血清外泌体和血清循环 miRNA-122呈正相关（r ＝0．512，P ＜0．05），肝癌组二者呈负相关（r ＝－0．223，P ＜0．05）。结论外泌体 miRNA-122可能成为一种新的检测 HCV 感染导致的慢性肝炎及肝癌的生物学标志物。
关键词： 肝炎抗体 丙型 血清 外泌体 微 RNA-1 22 -
高浓度草酸作用下HK-2细胞系中外泌体的提取与鉴定
目的 探讨高浓度草酸作用下HK-2细胞系中外泌体提取与鉴定的方法.方法 2016年6月至2017年1月进行实验.配制含草酸浓度分别为0、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、5.00、8.00、10.00mmoL/L的DMEM/F12无血清培养基,分别对HK-2细胞干预48 h,然后用CCK-8法检测不同浓度草酸对HK-2细胞生存率的影响.结合倒置显微镜下观察细胞的形态学变化,选择2.00 mmol/L的草酸作为实验浓度.用2.00 mmol/L草酸对HK-2细胞系干预48 h,收集干预后的HK-2细胞系的上清液,采用超速离心法提取外泌体;透射电镜观察外泌体的形态、大小;Nanosight系统检测外泌体的粒径与分布;蛋白质印迹法检测外泌体特异性蛋白HSP70、CD63的表达.结果 CCK-8法检测结果显示0、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、5.00、8.00、10.00 mmol/L组细胞的生存率分别为(100.0±4.0)％、(97.7±1.5)％、(97.3±2.1)％、(87.7±2.1)％、(76.0±1.0)％、(58.1±2.6)％、(52.7±1.5)％、(37.7±3.2)％、(31.3±2.0)％.透射电镜下外泌体呈杯口状,包膜为典型的双层膜结构.Nanosight系统显示2.00mmoL/L组外泌体峰值粒径为56 nm,整体平均粒径为87 nm,粒径为30～150 nm的比例为91.2％.蛋白质印迹法检测结果显示外泌体中明显表达HSP70和CD63蛋白,提取外泌体后的HK-2细胞表达HSP70蛋白,不表达CD63蛋白.结论 2.00 mmol/L草酸作用HK-2细胞48 h后,可以通过超速离心法提取丰富的、较高纯度的外泌体,这将为后续深入研究高浓度草酸背景下外泌体的信号转导奠定基础.
