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水解罗非鱼胶原促进人牙周膜细胞活力及成骨分化的效应
目的 探讨水解罗非鱼胶原促进人牙周膜细胞活力及成骨分化的作用.方法 制备水解罗非鱼胶原,原代分离培养人牙周膜细胞(hPDL细胞),分别利用MTT试验和real-time PCR试验检测水解罗非鱼胶原对细胞活力和成骨分化相关基因ALP,COL I,OCN和RUNX2的表达的影响,运用激光共聚焦显微镜观察成骨分化相关蛋白骨钙蛋白的表达,进一步采用western blot技术探讨水解罗非鱼胶原对整合素-ERK信号通路的作用.结果 水解罗非鱼胶原能促进hPDL细胞的增殖,使ALP,COL I,OCN和RUNX2的基因上调,诱导骨钙蛋白的产生,这些生物效应与水解罗非鱼胶原可激活整合素-ERK信号通路有关.结论 水解罗非鱼胶原具有骨诱导性,具有诱导hPDL细胞成骨分化的潜能.
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牵张应变作用下人牙周膜细胞内磷脂酶C-γ1水平变化的实验研究
目的 观察人牙周膜细胞(HPDLCs)内磷脂酶C-γ1(PLC-γ1)水平在机械牵张应变作用下的变化.方法 通过原代和传代培养,获得性状稳定的人牙周膜细胞,使用动态机械应变细胞加载仪对细胞进行1％、10％和20％动态牵张应变加载.并于加载后10 min、20 min、30 min、40 min、50 min和60 min,通过流式细胞仪和激光扫描共聚焦显微镜检测细胞内PLC-γ1水平的变化.应用SPSS13.0软件包对数据进行统计分析.结果 流式细胞仪检测发现:加载初期,细胞内的PLC-γ1水平维持在较低水平,随着牵张应变加载时间的延长,牙周膜细胞内PLC-Y 1水平逐渐升高.50 min时PLC-Y 1水平达到了各个应变组的高值(P＜0.01),60 min时各应变组的PLC-γ1水平都有所下降(P.＜0.01).激光扫描共聚焦显微镜检测发现:各组都有PLC-γ1的表达,其中50 min加载组表达相对较强.结论 机械牵张应变可以引起人牙周膜细胞内PLC-γ1表达量发生改变.
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黄芩素对人牙周膜细胞骨向分化能力的影响
目的:探讨中药黄芩提取物黄芩素对人牙周膜细胞(hPDLCs)增殖和成骨分化功能的影响.方法:原代培养hPDLCs,向hPDLCs中分别加入浓度为0.3125、0.625、1.25 μmol/L的黄芩素作为实验组,对照组不加黄芩素.MTT法检测黄芩素对hPDLCs增殖的影响后,分别采用碱性磷酸酶(ALP)活性测定、茜素红S染色、Real-time PCR和Western Blot法研究黄芩素对hPDLCs ALP活性、矿化结节形成、Ⅰ型胶原(Co1-Ⅰ)mRNA和蛋白表达的影响.结果:与对照组相比,各浓度黄芩素对hPDLCs增殖均无明显影响;各浓度黄芩素组均表现为ALP活性上升;同时骨向诱导21 d后可见黄芩素组矿化结节形成增加,定量分析结果显示1.25μmol/L黄芩素组形成矿化结节数量多;Real-time PCR和Western Blot结果显示各浓度黄芩素组Col-Ⅰ mRNA和蛋白表达均有上升,7 d时随浓度的增加其表达上升,1.25 μmol/L黄芩素组达到高水平.结论:黄芩素能促进hPDLCs的骨向分化能力,具有进一步研究其辅助牙周再生治疗的价值.
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甲壳胺对人牙周膜细胞增殖和分化的影响
目的探讨甲壳胺对人牙周膜细胞增殖和分化功能的影响.方法用原代培养的人牙周膜细胞,采用MTT法、酶动力学法和放射免疫法检测不同浓度甲壳胺(Chitosan,Chi,0.05,0.1,0.2g·L-1)对人牙周膜细胞增殖、碱性磷酸酶活性和骨钙素分泌的影响.结果与对照组比较,(1)Chi(0.05g·L-1)和Chi(0.1g·L-1)2组在3,5,7d时A570值均明显升高(P＜0.05),Chi(0.2g·L-1)组仅在3d时明显升高(P＜0.01);(2)不论是细胞裂解液还是细胞培养液中,甲壳胺均能明显增强牙周膜细胞碱性磷酸酶活性(P＜0.05);(3)不同浓度的甲壳胺刺激牙周膜细胞骨钙素分泌量均较对照组高,但只有Chi(0.1g·L-1)组比较有显著性差异(P＜0.05).结论甲壳胺对人牙周膜细胞的增殖和分化功能有明显的促进作用.
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丁酸对人牙周膜细胞增殖的影响
目的:探讨丁酸对人牙周膜细胞增殖的影响.方法:用含不同浓度丁酸(0 mol/L,2 mol/L,4 mol/L,8mol/L)的培养液培养人牙周膜细胞,通过MTT法测定其增殖.结果:人牙周膜细胞进入指数生长期后,丁酸以剂量依赖的方式抑制人牙周膜细胞的增殖.结论:丁酸可能通过抑制人牙周膜细胞的增殖,进而影响牙周膜的改建和更新,促进牙周袋形成和牙周组织破坏.
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红芪多糖对脂多糖诱导的牙周膜细胞凋亡及对Wnt信号通路的影响
目的:探讨红芪多糖对脂多糖(LPS)诱导的牙周膜细胞凋亡及对Wnt信号通路的影响.方法:体外分离培养人牙周膜细胞.实验分为3组,依次为对照组、脂多糖组和红芪多糖组.对照组细胞用正常的细胞培养液培养细胞;脂多糖组和红芪多糖组细胞用含有脂多糖浓度为10 mg/L的培养液培养细胞;红芪多糖组细胞培养液中加入红芪多糖终浓度为10 mg/L的培养液.流式细胞仪检测细胞凋亡情况,探针法检测细胞内的活性氧(ROS)水平.试剂盒检测细胞中碱性磷酸酶活性和分泌的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平.Western blot检测细胞中c-myc、β-连环蛋白(β-catenin)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)单克隆抗体、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)蛋白水平.结果:脂多糖组细胞存活率明显低于对照组(P＜0.01).脂多糖组细胞凋亡率和Bax水平、ROS水平明显高于对照组(P＜0.01).红芪多糖组细胞凋亡率和Bax水平、ROS水平明显低于脂多糖组(P＜0.01).脂多糖组细胞Bcl-2、c-myc、β-catenin水平和碱性磷酸酶活性明显低于对照组(P＜0.01).红芪多糖组细胞Bcl-2、c-mye、β-catenin水平和碱性磷酸酶活性明显高于脂多糖组(P＜0.01).脂多糖组细胞分泌的TNF-α水平明显高于对照组(P＜0.01).红芪多糖组细胞分泌的TNF-α水平明显低于脂多糖组(P＜0.01).结论:红芪多糖能够抑制脂多糖诱导的人牙周膜细胞凋亡,抑制细胞分泌TNF-α,作用机制可与Wnt信号通路、ROS水平有关.
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人牙周膜细胞和牙周膜组织的初级纤毛观察
目的:观察牙周膜组织和体外培养的牙周膜细胞的初级纤毛情况.方法:切取入牙根中1/3的牙周膜组织的冰冻切片和切取小鼠切牙牙周膜组织石蜡切片,原代培养人牙周膜细胞至P3,采用acet-α-tubulin利用间接免疫荧光的方法观察初级纤毛结构.结果:人及小鼠牙周膜组织以及人牙周膜细胞均可见绿色短棒状荧光信号,位于细胞核附近,长度约2～3 μm.结论:牙周膜组织及体外培养的人牙周膜细胞均含有初级纤毛结构.
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茶多酚对内毒素作用下人牙周膜细胞分泌和表达Toll样受体4的影响
目的:观察茶多酚(tea polyphenol,TP)对内毒素(lipopolysaccharide,LPS)作用下人牙周膜细胞(periodontal ligament cells,PDLCs)分泌和表达Toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)的影响.方法:体外分离及培养PDLCs,实验组分别为LPS和不同质量浓度的TP的不同组合,对照组为仅含1％FBS的DMEM培养液.培养24h、48 h和72 h后,通过酶联免疫吸附测定法检测TLR4的分泌量,荧光实时定量PCR法检测TLR4的表达.结果:100 mg/L LPS组PDLCs TLR4分泌量显著高于其它各组(P＜0.05),加入TP进行干预后实验组与对照组TLR4的分泌量和表达量无显著差异(P＞0.05).结论:TP对LPS作用下PDLCs TLR4的分泌和表达有一定的抑制作用.
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不同管径的TiO2纳米管对人牙周膜细胞的毒性研究
目的:研究不同管径的阳极氧化TiO2纳米管对人牙周膜细胞(HPDLCs)的毒性效应.方法:采用阳极氧化法在钛基底表面制备不同管径的TiO2纳米管,扫描电镜观察其表面的微结构,肌动蛋白染色研究细胞在材料表面的粘附生长情况,活/死细胞双染色研究对原代培养的HPDLCs的毒性效应.结果:HPDLCs的肌动蛋白骨架在30 nm管径的TiO2纳米管表面比70 nm和120 nm管径的TiO2纳米管更规律,培养24 h后,70 nm和120 nm管径的TiO2纳米管对HPDLCs的毒性显著大于30 nm管径的TiO2纳米管.结论:30 nm管径的TiO2纳米管有利于HPDLCs的肌动蛋白组装,同时毒性效应小,有利于HPDLCs的粘附和增殖.
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周期性张应力对牙周膜细胞内基质金属蛋白酶-8和13表达的影响
目的:观察周期性张应力作用下牙周膜细胞(human periodontal ligament cells,HPDLC)中基质金属蛋白酶(MMPs)的表达变化.方法:通过建立体外应力加载系统,对培养在弹性膜六孔板的HPDLC施加0.1 Hz,硅胶膜形变率分别为6％、12％、18％的周期性张应力,分别在加载2、6、12h后利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western Blot技术检测HPDLC的MMP-8,MMP-13的表达变化.结果:HPDLC在加载周期性牵张力后,细胞生长方向顺应力方向而发生改变,MMP-8和MMP-13的表达明显增加.结论:周期性循环张力可诱导HPDLC中MMP-8、MMP-13表达增强,为MMP-8、MMP-13可能参与正畸力下牙周组织的改建提供了依据.
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淫羊藿苷对人牙周膜细胞增殖及骨向分化的影响
目的:探讨淫羊藿苷对人牙周膜细胞增殖及骨向分化的影响,为淫羊藿苷在治疗牙周病方面的应用提供一定依据.方法:体外培养人牙周膜细胞,矿化诱导条件下将第3代细胞与10～0.001 mg/L,6个浓度的淫羊藿苷作用,通过噻唑蓝( MTT)比色法、ALP活性测定及BSP表达水平,反应其对人牙周膜细胞增殖及分化的影响.结果:作用24 h,各药物浓度均能促进人牙周膜细胞增殖(P＜0.05).作用48 h,1～0.001 mg/L组可促进人牙周膜细胞增殖(P＜0.05).作用72 h,0.1～0.001 mg/L组可促进人牙周膜细胞增殖(P＜0.05),10 mg/L组抑制人牙周膜增殖(P＜0.05)；作用72 h,1～0.001 mg/L组可促进人牙周膜碱性磷酸酶(ALP)活性(P＜0.05)；作用72 h,0.1～0.001 mg/L组的BSP表达水平较对照组显著增加(P＜0.05).结论:淫羊藿苷在一定浓度范围内可促进人牙周膜细胞增殖及骨向分化.
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MiR-34a在牙周膜细胞成骨向分化中的作用
目的:探讨微小RNA-34a在牙周膜细胞成骨向分化中的作用.方法:体外分离培养人牙周膜细胞(hP-DLCs),取第3～6代用于实验.首先,对hPDLCs进行成骨诱导液处理,在3、7、14 d后利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-34a基因的表达变化.然后,构建慢病毒载体pCDH-pre-miR-34a和pCDH,将慢病毒载体感染hPDLCs,构建pre-miR-34a过表达细胞模型(hPDLCs/34a)和空载体对照细胞模型(hPDLCs/pC-DH),并诱导hPDLCs成骨分化3、7、14和21 d.分析成骨标志基因碱性磷酸酶(ALP)、Runt相关转录因子2(Runx2)、骨钙素(OCN)及骨涎蛋白(BSP)表达变化,ALP活性及钙化结节形成的茜素红染色情况.结果:hPDLCs经成骨分化诱导后,miR-34a基因表达在第3天开始明显升高,并呈逐渐增高趋势,差异均有统计学意义(P＜0.001).与hPDLCs/pCDH组相比,hPDLCs/34a组的ALP活性和茜素红染色均有明显减弱.qRT-PCR结果显示:hPDLCs/34a组的ALP表达量在成骨诱导7d时较hPDLCs/pCDH组降低(P＜0.05);Runx2、OCN及BSP表达量的差异在各时间点基本无统计学意义.结论:在体外条件下,miR-34a抑制人牙周膜细胞成骨向分化.
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人牙周膜细胞体外定向诱导分化为脂肪细胞的研究
目的:体外定向诱导人牙周膜细胞分化为脂肪细胞,探讨人牙周膜细胞的多向分化潜能.方法:体外分离、培养人牙周膜细胞,用地塞米松、吲哚美辛、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)和胰岛素诱导其向脂肪细胞定向分化.倒置相差显微镜、透射电子显微镜观察形态结构的变化,采用油红O染色法进行鉴定.结果:经成脂诱导分化培养后6 d ,人牙周膜细胞内有脂滴出现.随着诱导培养时间的延长,脂滴逐渐增多并融合成脂泡,细胞由梭形变为圆形和椭圆形,体积增大.透射电子显微镜下见脂泡.油红O染色显示细胞内有中性脂肪形成.结论:人牙周膜细胞在体外可以分化为脂肪细胞,具有多向分化的潜能.
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3种根尖倒充填材料对人牙周膜细胞生长及超微结构的影响
目的:观察3种根尖倒充填材料对人牙周膜细胞生长及超微结构的影响,从而指导材料的选择.方法:用材料直接接触细胞并计数以及透射电镜观察细胞结构变化.结果:3种材料接触培养后细胞生长速度减缓,3种材料之间差异有显著意义,细胞内超微结构显示内质网,线粒体等细胞器及细胞核的结构均有改变.结论:本实验的3种根尖倒充填材料对牙周膜细胞均有毒性作用,其中光固化复合树脂和银汞合金毒性较强,而化学固化玻璃离子粘固剂毒性较弱,临床使用较好.
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TP对脂多糖介导人牙周膜成纤维细胞细胞间黏附分子-1表达的影响
目的:检测人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblasts,HPDLF)在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)介导下细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)的表达,探讨TP(tea polyphenols,TP)对其表达的影响.方法:HPDLF采用改良组织块法体外培养,将HPDLF随机分成LPS组、TP100组、TP200组,用酶联免疫吸附试验法(enzyme linked immuosorbent,ELISA)检测不同浓度TP对LPS介导下HPDLF分泌ICAM-1的活性.实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,Real-time PCR)检测ICAM-1 mRNA的表达.结果:在LPS干预下,不同时间不同浓度的TP影响下均可抑制ICAM-1分泌,其活性降低,与LPS组比较差异有统计学意义(P＜0.05);且ICAM-1 mRNA表达水平显著降低,与LPS组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论:TP对ICAM-1的抑制作用明显,100μg/mL TP对其的抑制作用更显著,提示TP的抗炎机制可能与抑制ICAM-1有关.
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外伤性脱位牙浸泡效果比较
目的通过对外伤性脱位牙不同浸泡条件下疗效的比较,选择恰当的方式来处理脱位牙,提高再植牙成功率.方法选用人牙周膜细胞用MTT(四唑盐)比色实验对不同条件下的人牙周膜细胞生长状况进行测定.结果 RPMI-1640完全培养液优于0.9%NaCl,但来源困难;青霉素优于庆大霉素;并尽可能在短时间内完成结扎固定.结论外伤离体牙在RPMI-1640完全培养液中浸泡,其牙周膜活细胞数量增多,其次为0.9%NaCl溶液.这两种液体都是外伤离体牙浸泡的首选浸泡液.
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过氧化氢对人牙周膜细胞增殖及成骨分化的影响
目的:研究低浓度的H2 O2对人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells,hPDLCs)增殖及成骨分化的影响.方法:采用组织块法培养hPDLCs,免疫细胞化学染色鉴定其来源;采用不同浓度的H2O2处理hPDLCs,CCK-8法检测细胞的增殖活性;并对处理后的hPDLCs进行成骨诱导,碱性磷酸酶检测试剂盒测定细胞的碱性磷酸酶(ALP)活性,茜素红染色法(ARS)观察细胞矿化结节的形成情况.结果:采用组织块法成功培养出hPDLCs,细胞抗波形丝蛋白染色阳性,抗角蛋白染色阴性;CCK-8结果显示:低浓度的H2 O2(20～300μM)可提高hPDLCs的增殖活性,更低浓度(0～10μM)和较高浓度(500μM)对细胞增殖活性无影响,而更高浓度(700μM)则抑制细胞的增殖活性;ALP活性及ARS染色半定量结果分析显示:适当浓度范围的H2O2(10～80μM)可提高细胞ALP活性及增加矿化结节形成量,而当浓度上升至100～300 mM时,细胞的ALP活性降低,矿化结节形成量减少.结论:H2O2对hPDLCs的增殖及分化的影响存在剂量效应,一定低浓度范围的H2O2可提高hPDLCs的增殖活性并促进其成骨分化.
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正畸对牙周膜细胞OPG、RANKL表达的影响
目的:探讨正畸力作用对移动牙牙周膜代谢的影响,以及牙周膜代谢在正畸骨改建中的作用.方法:选择临床正畸拔牙病例,在拔除第一前磨牙后,分别在尖牙的牵引移动前、牵引移动3个月时、牵引移动结束3个时间段,从移动牙的压力侧、张力侧分别提取人牙周膜细胞,进行细胞原代培养,并用RT-PCR检测其护骨素(OPG)、细胞核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)的表达变化.结果:人牙周膜细胞原代培养成功.尖牙近中侧OPG的表达以及尖牙远中侧RANKL的表达均在尖牙移动前接近阴性,尖牙移动3个月时强,尖牙移动结束时减弱,而且3个观察时间点两两比较,差异均有统计学意义(P<0.01).结论:OPG、RANKL因子存在于牙周膜细胞中,正畸牙齿移动时其活性增强,可能参与正畸牙移动和局部牙槽骨改建的全过程.
关键词： 正畸 牙齿移动 人牙周膜细胞 护骨素 细胞核因子-κB受体活化因子配体 -
YAP在牵张力介导的人牙周膜细胞成骨分化中的作用
目的:探讨Yes相关蛋白(YAP)在体外牵张力介导的人牙周膜细胞(hPDLCs)成骨分化中的作用.方法:酶消化法分离并体外培养hPDLCs,取第3~8代细胞用于实验.首先通过细胞免疫荧光检测YAP在细胞加力后的定位,然后利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测加力细胞成骨分化相关基因碱性磷酸酶(ALP)、远端缺失同源盒5(DLX5)、Runt相关转录因子2(RUNX2)的表达变化,通过碱性磷酸酶染色实验检测加力细胞ALP的活性.构建YAP基因沉默模型,分析加力的细胞的YAP基因表达受到抑制后成骨分化相关基因ALP、DLX5及RUNX2的表达变化和ALP活性.结果:hPDLCs加力1 d后,同对照组相比,胞核定位的YAP明显升高,且成骨相关基因的表达均明显上调(P<0.05),ALP活性也增强.转染了YAP SiRNA的细胞加力后与对照组相比,成骨相关基因的表达明显受到抑制(P<0.05),且ALP活性也降低.结论:沉默YAP基因对牵张力介导的hPDLCs成骨分化有抑制作用,推测YAP可能是正畸过程中的一个潜在治疗靶点.
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牵张应力对人牙周膜细胞MMP-2表达的影响及相关信号通路的研究
目的:探讨NF-κB通路对牵张应力介导的人牙周膜细胞(HPDLCs)中MMP-2表达的影响.方法:按胶原酶消化法培养HPDLCs,分为5组:非加力对照组(A组);12％形变率,3h组(B组);12％形变率,6h组(C组);12％形变率,12h组(D组);12％形变率+PDTC干预,12h组(E组),通过细胞牵张应力加载系统施加机械牵张应力,结束后收集细胞提取蛋白,用蛋白印迹法检测MMP-2蛋白表达的变化.结果:B、C、D组MMP-2表达大于A组,差异有统计学意义(P＜0.05),且随着作用时间的延长蛋白表达增加;NF-κB通路抑制剂PDTC可抑制机械牵张应力作用下牙周膜细胞MMP-2表达的增加.结论:持续机械牵张应力可诱导人牙周膜细胞MMP-2表达的增加,从而影响牙周组织细胞外基质代谢,机械牵张应力可通过NF-κB通路影响MMP-2蛋白的表达.
