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草酸铂对CHO细胞系野生型AA8和突变型UV20的DNA损伤作用
目的 探讨交叉互补集团1基因(ERCC1)蛋白在草酸铂毒性作用的影响,找寻草酸铂药物抵抗性的关键因子.方法 中国仓鼠卵巢细胞系野生型AA8以及ERCC1表达缺失型UV20可以作为细胞对照模型.SRB细胞抑制率实验、改良彗星实验、Rad51免疫荧光实验评价草酸铂染毒后不同时点的DNA损伤程度.结果 AA8和UV20对草酸铂的敏感性不同,IC50相差近16倍.改良彗星实验和Rad51免疫荧光实验同时表明,AA8与UV20相比,具有修复草酸铂所致DNA损伤能力.结论 ERCC1蛋白具有重要的核酸内切酶功能,对于修复草酸铂所致DACH-Pt-DNA加合物具有重要意义.
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二氯乙烷对小鼠DNA损伤的器官特异性及时效关系研究
为了研究1,2-二氯乙烷(DCE)的遗传毒性、探测其致癌的靶器官,应用组织匀浆提取细胞核进行彗星试验,检测了DCE灌胃染毒3、8、24h后对小鼠肝、肺、肾、脾、骨髓、睾丸、胃、肠、膀胱和外周血淋巴细胞的DNA损伤作用及修复动力学改变.实验结果:1) DCE在小鼠体内遗传毒性的靶器官是肝、肺、肾、骨髓、结肠及胃粘膜细胞和外周血淋巴细胞;2) DNA损伤和修复的动力学改变在器官间存在较大的差异,DNA损伤明显且修复较慢的器官或组织(肺、胃和血液系统)与其致癌的靶器官有较好的一致性.提示:体内多器官的彗星试验对确定体内遗传毒性和预测致癌的靶器官是非常有用的;对暴露DCE的生物和人群,外周血淋巴细胞在彗星试验的拖尾,可作为体内DNA损伤效应的生物标志.
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丙烯酰胺对小鼠脏器细胞DNA损伤及修复作用
目的 研究丙烯酰胺的遗传毒性,探测其遗传毒性的靶器官.方法 应用彗星试验检测50mg/kg丙烯酰胺腹腔注射染毒0、3、6、12和24h后小鼠肺、肝、脾、肾、睾丸、骨髓和外周血淋巴细胞的DNA损伤情况.结果 丙烯酰胺染毒后不同时间,可引起小鼠肝、脾、睾丸、骨髓和外周血淋巴细胞彗星尾长、尾部DNA百分含量及尾矩的显著增加,随时问延长有下降趋势;未观察到对肺和肾脏细胞的明显影响.结论 丙烯酰胺可以诱导小鼠多种组织细胞的DNA损伤,机体对丙烯酰胺造成的遗传损伤有一定的修复能力.
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焦炉作业工人核苷酸剪切修复酶基因多态性与染色体损伤的关系
目的 研究核苷酸剪切修复酶基因多态性与焦炉作业工人外周血淋巴细胞染色体损伤易感性的关系.方法 以140名焦炉作业工人(暴露组)和66名医务人员(对照组)作为研究对象,测定尿中1-羟基芘浓度反映多环芳烃暴露内剂量,用双核淋巴细胞微核评价个体外周血淋巴细胞染色体损伤,采用聚合酶链-限制性片段长度多态性方法 分析ERCC1、ERCC2、ERCC4、ERCC5、ERCC6基因多态性,多元统计方法 分析不同基因型与染色体损伤水平的关系.结果 在校正年龄、性别、mEH基因型、自然对数转换后的尿1-羟基芘水平后,暴露组中ERCC1基因19007位点CC基因型个体微核率[(1.05±0.68)%]显著高于CT基因型[(0.81±0.66)%](P=0.01),或TT[(0.66±0.37)%](P=0.05),或CT+TT基因型个体[(0.75±0.63)%](P=0.004).ERCC6基因3368位点AA基因型个体微核率[(1.00±0.69)%]显著高于AG[(0.67±0.42)%](P=0.05),或AG+GG基因型个体[(0.66±0.41)%](P=0.02).进一步按焦炉工年龄均数(39.1岁)分层,发现在高年龄组ERCC1 C19007T和ERCC6 A3368G位点多态性与染色体损伤水平相关联;另外,高年龄组中ERCC2 G23591A位点GA基因型个体微核率[(1.40±0.63)%]高于GG基因型个体[(0.98±0.59)%](P=0.01).结论 ERCC1 C19007T、ERCC6 A3368G以及ERCC2 G23591A位点的多态性能够影响职业性多环芳烃暴露导致的外周血淋巴细胞染色体损伤水平.
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60Coγ射线对hOGG1低表达细胞株放射敏感性的影响
目的研究60 Co γ射线对DNA碱基切除修复基因hOGG1低表达细胞株放射敏感性的影响.方法以A549细胞和通过稳定转染hOGG1核酶而获得的hOGG1低表达的A549-R细胞为研究对象,用MTT法测定不同剂量γ射线照射后两种细胞的存活率;单细胞凝胶电泳检测60 Coγ射线处理后两种细胞DNA损伤与修复的差异;流式细胞术检测照射后两种细胞的周期分布、凋亡率和细胞增殖指数.结果照射后两种细胞的存活率均随照射剂量的增加而下降,但A549-R细胞组的存活率显著低于相同剂量组的A549细胞(P＜0.05);所设剂量均可诱导细胞DNA损伤,但DNA迁移长度和彗星细胞率在两种细胞间差异无统计学意义(P＞0.05);损伤后的修复在两种细胞间差异有统计学意义(P＜0.05),A549-R细胞的修复能力远远低于A549细胞.流式细胞术检测结果表明:照射后两种细胞都表现为G0/G1期细胞阻滞,细胞凋亡随照射剂量的增加而增加,细胞增殖指数随照射剂量的增加而降低,这些变化均以A549-R细胞更为明显.结论hOGG1低表达使得细胞DNA修复能力降低,细胞周期阻滞于G0/G1期、细胞增殖减慢、凋亡增加、存活率下降,从而使细胞对60Coγ射线的放射敏感性增强.
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锌对D-半乳糖诱导的衰老小鼠学习和记忆行为的影响
目的:研究缺锌和补锌对衰老小鼠的学习和记忆能力的影响及其机制.方法:取雄性小鼠70只,随机分组,按剂量100mg/kg bw给予D-半乳糖注射液,颈背部皮下注射,青龄对照组给予等剂量的生理盐水,连续30 d.衰老缺锌组和补锌组开始均给予缺锌饲料(含锌1.61 mg/kg),其他组给予正常饲料(含锌50 mg/kg).补锌组在实验后2w给予补锌饲料(100mg/kg).在实验的后1 w进行有关行为学试验,期满后断颈处死小鼠后取样检测.结果:与衰老模型组相比,衰老缺锌组血清锌水平下降,老年小鼠自主活动度降低,学习和记忆能力下降.彗星试验显示缺锌使得老龄小鼠脑细胞DNA损伤程度加重,彗星细胞尾长/总长比值显著增加.补锌后上述指标均有显著改善.结论:缺锌可以降低DNA的损伤修复功能,进而影响小鼠的学习和记忆能力.而补锌则有助于改善这一现象.
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脱氧雪腐镰刀菌烯醇致Vero细胞核基因组DNA损伤与修复的彗星实验观察
目的应用彗星实验技术观察脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)对Vero细胞DNA损伤与修复特征,探讨DON的遗传毒性.方法①1 μmol、5 μmol、10 μmol DON对指数生长期的Vero细胞分别染毒4、16 h后,观察DNA的损伤.②10μmol DON处理的细胞重新孵育15、30、60、120 min,观察DNA损伤修复.③以彗星实验技术结合"彗星图像分析软件(KIAS)"获得彗星细胞主要参数,并进行统计分析.结果①随染毒剂量增加,染毒时间延长,受损伤细胞的数量逐渐增加,细胞DNA损伤程度逐渐加重;短时间染毒(4 h),损伤以DNA碎片的数量增加为主;较长时间染毒(16 h),损伤以DNA碎片变小为主.②去除DON,重新孵育若干时间,随修复时间延长,受损伤细胞数量逐渐减少,细胞DNA损伤程度逐渐减轻,提示受损细胞在进行自我修复;短时间染毒(4 h)修复启动时间较短(＜15 min),而长时间染毒(16 h)修复启动时间也相应延长(＞15 min);孵育120 min后,修复完成.结论DON毒素可致Vero细胞DNA损伤,重新孵育若干时间后损伤可修复.
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二甲双胍对肺癌细胞A549放疗增敏作用及机制研究
目的 探讨二甲双胍对肺癌A549细胞的放射增敏作用及其潜在的机制.方法 采用CCK-8法检测不同浓度二甲双胍对A549细胞的抑制作用,计算IC50值;细胞克隆形成实验检测二甲双胍联合放疗的增敏作用;流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡;免疫印迹法检测DNA损伤蛋白γ-H2AX,DNA修复蛋白DNA-PK,Ku80,Ku70的表达.结果 我们发现5mM浓度的二甲双胍增强了A549细胞的放射敏感性.克隆形成实验结果显示放疗联合5 mM二甲双胍24小时后细胞存活分数(SF值)为1.39,单纯放疗组SF值为0.1;流式细胞技术结果显示6Gy放疗联合5 mM二甲双胍组24小时后G2/M期比例为8％,早期凋亡率为34.9％,而单纯放疗组G2/M期比例为26％,早期凋亡率为10.6％.免疫印迹结果显示5 mM二甲双胍与6 Gy放射联合作用于A549细胞24小时,二甲双胍能够上调DNA损伤蛋白γ-H2AX表达,下调DNA修复蛋白DNA-PK,Ku70及Ku80表达(P＜0.01).结论 体外实验中,我们发现二甲双胍增敏放疗的机制是降低放疗相关的G2检查点及抑制DNA损伤修复.
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miR-223通过SEPT6抑制NCK-SOCS7信号通路促进前列腺癌细胞增殖及侵袭
目的 探讨 miR-223 是否通过 GTP 结合蛋白基因 SEPT6 调控 NCK-SOCS7 信号通路并影响前列腺癌进展. 方法 通过 miR-223 模拟物(miR-MM)及其反义寡核苷酸(miR-AO)分别上调及抑制前列腺癌细胞系 DU145 中 miR-223 的表达,并与 miR-223 空载体组(miR-NC)进行比较.通过 SEPT6 抑制剂 siR-1219 及空白载体 siR-NC分别与 miR-NC共转染 DU145 细胞,同样再分别与 miR-AO 共转染DU145 细胞.利用 QPCR检测 miR-223、SEPT6、NCK和 SOCS7 基因的表达,MTT法及Transwell小室法分别进行细胞增殖和侵袭实验. 结果 在 miR-MM组,提高 miR-223 表达,能够显著抑制 SEPT6、NCK及 SOCS7 表达水平,并且促进细胞增殖及侵袭力[细胞数为(103±37)个];反之在 miR-AO 组,则 SEPT6、NCK及 SOCS7 基因表达显著增高,细胞增殖及侵袭力明显减弱[细胞数为(29±11)个].进一步研究发现,在miR-NC+siR-1219 组,miR-223 及SEPT6 表达分别较高和较低,NCK 及 SOCS7 与 SEPT6 表达趋势一致,也较低,此时细胞增殖及侵袭能力较强[细胞数为(63±25)个];而在miR-AO+siR-NC组,miR-223 及SEPT6 表达分别较低和较高,NCK 及 SOCS7 与 SEPT6 表达趋势也一致,也较高,而细胞增殖及侵袭能力较弱[细胞数为(21±6)个](P＜0.05). 结论 miR-223 能够抑制 SEPT6 基因表达,导致下游 DNA 损伤修复信号通路NCK-SOCS7 被抑制,从而增加前列腺癌的恶性程度.本研究可能为前列腺癌的进展及潜在的治疗靶点提供基础研究依据.
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Bcl2抑制NNK诱导的DNA损伤后修复的分子机制研究
目的 为了探索Bcl2抑制NNK诱导的DNA损伤后修复的分子机制.方法 Western Blotting检测Bcl2、APE1和XRCC1蛋白的表达情况,定量检测AP位点来观察DNA损伤程度,免疫沉淀检测Bcl2蛋白和APE1蛋白,APE1蛋白和XRCC1蛋白相互作用,免疫荧光染色检测Bcl2蛋白的细胞分布情况及其变化,亚细胞结构分离提取蛋白观察Bcl2蛋白在细胞核及线粒体中表达水平及其变化.同位素测定APE1核酸内切酶活性观察Bcl2对APE1核酸内切酶活性的影响及其Bcl2的BH结合域的关系.结果 Bcl2下调APE1核酸内切酶活性与抑制AP住点修复有关.4-(N-甲基-N-亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-丁酮(NNK)与细胞接触导致Bcl2在细胞核中积聚,并且与APE1相互作用,这种相互作用需要Bcl2的所有BH结合域参与.Bcl2的BH结合域的任一缺失导致Bcl2与APE1相互作用的能力和对APE1活性、AP位点修复的抑制作用消失.Bcl2在细胞中的过度表达减少了APE1/XRCC1修复复合物的形成,并且Bcl2纯蛋白在体外直接使APE1/XRCC1复合物分裂从而抑制APE1核酸内切酶活性.结论 Bcl2蛋白下调APE1核酸内切酶活性抑制NNK诱导的DNA损伤后AP位点的修复.
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Bcl2对NNK诱导的DNA损伤后修复的抑制作用
目的 为了探索Bcl2对DNA损伤后修复的抑制作用.方法 Western Blotting检测Bcl2蛋白的表达情况,单细胞电泳、定量检测AP位点来观察DNA损伤程度.结果 NNK诱导DNA损伤产生大量的AP位点,去掉NNK后未转染Bcl2质粒的H1299细胞中AP位点数量逐渐下降,转染野生型Bcl2质粒的H1299细胞中AP位点数量也在下降,但比前一组慢,仍维持在较高水平,说明去掉NNK后来转染Bcl2质粗的H1299细胞中DNA损伤在逐步修复,而转染野生型Bcl2质粒的H1299细胞中DNA损伤后AP位点的修复受到抑制.NNK处理1h后两组H1299细胞的细胞核均有拖尾现象,说明NNK可以使H1299细胞中DNA发生损伤;去掉NNK诱导剂后24h观察发生未转染H1299细胞中DNA的细胞核未有拖尾现象现象,说明DNA损伤已得到修复,但另一组细胞中仍有部分细胞核有拖尾,说明DNA损伤仍有部分未得到修复.结论 Bcl2蛋白对NNK诱导的DNA损伤后的修复有抑制作用.
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茜草对人神经胶质瘤U87细胞的生长及丙酮酸代谢的影响
目的 考察茜草对人神经胶质瘤U87细胞生长的影响,并从抗肿瘤作用分子机制及丙酮酸代谢角度探讨作用机理.方法 体外培养U87细胞,以MTT法考察茜草不同提取物对U87细胞的生长抑制作用;人全基因组表达谱芯片初步筛选茜草醇提物抑制U87细胞的可能机制;逆转录PCR验证部分差异表达基因;碘化丙啶(PI)单染法检测细胞周期分布;分光光度法检测细胞内H2O2含量、丙酮酸含量、乳酸含量、Caspase-3活力、丙酮酸激酶(PK)活力、乳酸脱氢酶(LDH)活力、苹果酸脱氢酶(MDH)活力、琥珀酸脱氢酶(SDH)活力;Western Blot检测超氧化物歧化酶1(SOD1)、过氧化氢酶(Catalase)、p-Histone H2A.X(Ser139)、p-乳腺癌易感蛋白1(BRCA1)(Ser1524)、人mutS同源蛋白6(MSH6)、增殖细胞核抗原(PCNA)、单羧酸转运蛋白1(MCT1)的蛋白表达.结果 以不同剂量的茜草醇提物、水提物(终浓度分别为200,100,50,25,12.5 mg·L-1)作用于U87细胞24,48,72 h后,U87细胞生长受到明显抑制,抑制作用具有剂量依赖和时间依赖性,醇提物优于水提物.茜草醇提物50 mg· L-1作用于U87 24 h后,表达谱芯片结果揭示其作用机制与细胞周期、凋亡、氧化-还原平衡、DNA损伤及修复、单羧酸转运等有关.茜草醇提物100,50 mg· L-1处理U87 24 h进行后续实验,逆转录PCR验证MSH6、Catalase、BAX、硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)、PCNA mRNA表达与芯片结果一致,而DNA复制解旋酶/核酸酶2(DNA2)mRNA表达仅100 mg· L-1组与芯片结果相符.茜草醇提物可使U87细胞阻滞在S期、提高Caspase-3活力;还增加了细胞内H2O2含量,而Catalase和SOD1蛋白表达减少;细胞内DNA双链断裂的标志p-Histone H2A.X (Ser139)蛋白表达增加,DNA修复相关的p-BRCA1(Ser1524)、MSH6、PCNA蛋白表达减少.茜草醇提物处理后,U87细胞内丙酮酸含量减少、乳酸含量增加;PK、LDH、MDH、SDH活力增加、MCT1蛋白表达减少.结论 茜草能有效抑制人神经胶质瘤U87细胞在体外的生长活力,作用呈现一定剂量依赖和时间依赖,且醇提优于水提.其作用机制涉及多方面,与细胞周期阻滞、Caspase-3活化、影响氧化-还原平衡、DNA损伤及修复、细胞内丙酮酸代谢有关.茜草是一味具有开发潜力的抗肿瘤中药.
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骨肉瘤DNA损伤修复相关基因表达与预后的关系
目的研究DNA损伤修复基因MPG、APE1、XRCC1和MGMT在人体骨肉瘤中的表达特点及其与患者预后的关系,为判估骨肉瘤对化疗的反应性及其预后提供有价值的指标.方法应用免疫组化方法检测60例骨肉瘤组织和3株骨肉瘤细胞中MPG、APE1、XRCC1和MGMT的表达,按染色强度将其分为低表达组和高表达组.统计分析它们与临床病理及患者预后的关系.结果3株骨肉瘤细胞中APE1和XRCC1呈强阳性,MPG和MGMT呈弱阳性.60例骨肉瘤中MPG、APE1、XRCC1和MGMT高表达分别为40例(65%)、43例(72%)、23例(38%)和32例(53%).APE1表达和患者年龄,Price's分级和WHO分型有显著性差异(P＜0.05),MPG表达和WHO分型有显著性差异(P＜0.05).Spearman秩相关检验显示上述4项指标之间密切相关.单因素相关分析显示APE1和MPG表达与患者预后有显著性差异(P＜0.05),COX比例风险模型显示MPG表达与患者预后有关(P＜0.01).结论DNA损伤修复基因MPG、APE1、XRCC1和MGMT的共同表达是骨肉瘤的特点,APE1和MPG表达对于判估骨肉瘤患者的预后可能更有意义.
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仙牌灵芝茶对化学性肝损伤保护作用的研究
目的:研究仙牌灵芝茶对化学性肝损伤是否具有保护作用,并探讨其可能的保护作用机制.方法:采用CCl4亚急性染毒来建立化学性肝损伤大鼠模型,并将灵芝茶以三个剂量(1.65、5.00和15.00g/kg)经口灌胃给药,每天一次,连续25d,后进行血常规、血清生化指标和肝脏组织病理学等项目检查以及体内肝细胞抗氧化实验和彗星实验.结果:与对照组相比,高剂量组的ALT活性显著降低,肝脏组织结构病理损害明显改善,肝脏LPO水平显著降低和GSH-Px活性明显升高,肝细胞彗星百分率和彗星尾长明显下降.结论:仙牌灵芝茶对CCl4所致化学性肝损伤具有保护作用,其保护机制可能主要为:清除自由基和抑制脂质过氧化作用,拮抗DNA损伤、促进DNA修复等.
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DNA聚合酶β对细胞生物学特性及DNA损伤的影响
目的 探讨DNA聚合酶β(pol β)的表达水平对细胞的生物学特性及重铬酸钾诱导的DNA损伤效应的影响.方法 以pol β野生型(pol β+/+)、pol β缺陷型(pol β-/-)及pol β 高表达型(pol β oe)小鼠胚胎成纤维细胞为研究对象,采用四氮唑盐比色法绘制3种细胞的生长曲线;群体倍增实验观察3种细胞的倍增时间;HGPRT基因突变实验检测细胞的自发突变频率;同时用单细胞凝胶电泳实验分析3种细胞的自发DNA损伤和重铬酸钾诱导的DNA损伤效应的差异.结果 3种细胞生长曲线和群体倍增时间基本一致,细胞自发突变频率和自发DNA损伤差异也无统计学意义(P0.05);随着重铬酸钾浓度的增加,3种细胞的拖尾率和尾长均增加,在相同重铬酸钾染毒浓度下pol β缺陷型细胞的DNA损伤明显大于pol β野生型和高表达型细胞, 且以pol β高表达型细胞的DNA损伤效应弱.结论 pol β表达水平对细胞的生长特征无明显影响,也不会造成细胞自发突变的增加;pol β基因缺陷使细胞对重铬酸钾诱导的DNA损伤更敏感,而高表达则对DNA损伤具有一定保护作用.
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hOGG1低表达肿瘤细胞对阿霉素的敏感性研究
目的 研究8-羟基鸟嘌呤DNA 糖苷酶1基因(hOGG1)低表达细胞对阿霉素的敏感性,为化疗增敏提供实验依据.方法 用不同剂量的阿霉素处理肺腺癌A549细胞和通过稳定转染hOGG1核酶而获得的hOGG1低表达的A549-R细胞,用MTT法测定两种细胞的存活率;体外微核试验及单细胞凝胶电泳检测两种细胞微核率及DNA损伤与修复的差异;流式细胞术检测周期分布、凋亡率和细胞增殖指数.结果 A549-R细胞阿霉素半数抑制浓度(IC50)低于A549细胞 (P＜0.05);阿霉素可诱导两种细胞的微核率增高,而在相同阿霉素剂量作用下A549-R细胞微核率较A549细胞更高(P＜0.05);单细胞凝胶电泳结果显示阿霉素作用下两种细胞均有不同程度DNA损伤,A549-R细胞的拖尾率和DNA迁移长度大于A549细胞(P＜0.05);与A549细胞比较,A549-R细胞更不易修复.流式细胞术检测显示:阿霉素处理使两种细胞都表现为G0/G1期细胞阻滞,细胞凋亡随阿霉素浓度增加而增加,细胞增殖指数随阿霉素浓度增加而降低,这些变化均以A549-R细胞更为明显.结论 hOGG1低表达使细胞DNA修复能力降低,从而使细胞对阿霉素的敏感性增强.
关键词： 8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶 阿霉素 敏感性 DNA损伤与修复
