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Bcl2抑制NNK诱导的DNA损伤后修复的分子机制研究
目的 为了探索Bcl2抑制NNK诱导的DNA损伤后修复的分子机制.方法 Western Blotting检测Bcl2、APE1和XRCC1蛋白的表达情况,定量检测AP位点来观察DNA损伤程度,免疫沉淀检测Bcl2蛋白和APE1蛋白,APE1蛋白和XRCC1蛋白相互作用,免疫荧光染色检测Bcl2蛋白的细胞分布情况及其变化,亚细胞结构分离提取蛋白观察Bcl2蛋白在细胞核及线粒体中表达水平及其变化.同位素测定APE1核酸内切酶活性观察Bcl2对APE1核酸内切酶活性的影响及其Bcl2的BH结合域的关系.结果 Bcl2下调APE1核酸内切酶活性与抑制AP住点修复有关.4-(N-甲基-N-亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-丁酮(NNK)与细胞接触导致Bcl2在细胞核中积聚,并且与APE1相互作用,这种相互作用需要Bcl2的所有BH结合域参与.Bcl2的BH结合域的任一缺失导致Bcl2与APE1相互作用的能力和对APE1活性、AP位点修复的抑制作用消失.Bcl2在细胞中的过度表达减少了APE1/XRCC1修复复合物的形成,并且Bcl2纯蛋白在体外直接使APE1/XRCC1复合物分裂从而抑制APE1核酸内切酶活性.结论 Bcl2蛋白下调APE1核酸内切酶活性抑制NNK诱导的DNA损伤后AP位点的修复.
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Bcl2对NNK诱导的DNA损伤后修复的抑制作用
目的 为了探索Bcl2对DNA损伤后修复的抑制作用.方法 Western Blotting检测Bcl2蛋白的表达情况,单细胞电泳、定量检测AP位点来观察DNA损伤程度.结果 NNK诱导DNA损伤产生大量的AP位点,去掉NNK后未转染Bcl2质粒的H1299细胞中AP位点数量逐渐下降,转染野生型Bcl2质粒的H1299细胞中AP位点数量也在下降,但比前一组慢,仍维持在较高水平,说明去掉NNK后来转染Bcl2质粗的H1299细胞中DNA损伤在逐步修复,而转染野生型Bcl2质粒的H1299细胞中DNA损伤后AP位点的修复受到抑制.NNK处理1h后两组H1299细胞的细胞核均有拖尾现象,说明NNK可以使H1299细胞中DNA发生损伤;去掉NNK诱导剂后24h观察发生未转染H1299细胞中DNA的细胞核未有拖尾现象现象,说明DNA损伤已得到修复,但另一组细胞中仍有部分细胞核有拖尾,说明DNA损伤仍有部分未得到修复.结论 Bcl2蛋白对NNK诱导的DNA损伤后的修复有抑制作用.
