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应用Cre/loxP系统构建含人PTEN基因的重组腺病毒载体
目的构建含人PTEN基因的重组腺病毒载体.方法将PTEN cDNA定向克隆至穿梭质粒pDC315上,然后与骨架质粒pBHGloxΔE1、3Cre共转染293细胞,产生重组腺病毒AdCMV-PTEN并进行鉴定、扩增后测定重组病毒的滴度.结果重组腺病毒AdCMV-PTEN的滴度为5×1010 pfu/L,PCR扩增出目的片断.结论成功构建了含人PTEN基因的重组腺病毒载体,为进一步研究其功能奠定基础.
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体外腺病毒介导的HSV-tk/GCV对产生AFP的人肝癌细胞的影响
目的观察腺病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-tk)/丙氧鸟苷(GCV)自杀基因系统在体外对人肝癌细胞的选择性杀伤效应.方法采用含有甲胎蛋白基因启动子、增强子和HSV-tk基因的嵌合基因,插入腺病毒中形成重组腺病毒(AdrAFPTK),将该重组腺病毒分别感染体外培养的甲胎蛋白阳性人肝癌细胞BEL-7402和甲胎蛋白阴性人肝癌细胞SMMC-7721,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测HSV-kt基因的转录表达,观察GCV对人肝癌细胞的选择性杀伤作用.结果GCV在体外对重组腺病毒转染的甲胎蛋白阳性的人肝癌细胞BEL-7402有明显的杀伤作用和"旁观者效应",而对重组腺病毒转染的甲胎蛋白阴性的人肝癌细胞SMMC-7721无明显作用.结论在体外,表达HSV-tk基因的甲胎蛋白的人肝癌细胞可被受甲胎蛋白基因表达调控序列控制的自杀基因HSV-tk特异性杀伤,表现出极高的细胞专一性.重组腺病毒AdrAFPTK可望用于肝癌的特异性基因治疗.
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抗菌药物临床应用指导原则(7)--各类细菌性感染的治疗原则及病原治疗
1急性细菌性上呼吸道感染急性上呼吸道感染是常见的社区获得性感染,大多由鼻病毒、冠状病毒、流感病毒、副流感病毒、腺病毒等病毒所致,病程有自限性,不需使用抗菌药物,予以对症治疗即可痊愈.但少数患者可为细菌性感染或在病毒感染基础上继发细菌性感染,此时可予以抗菌治疗.
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儿童腺病毒肺炎的诊疗误区
通过复习有关儿童腺病毒肺炎的文献，结合儿童腺病毒肺炎临床特点及儿科临床医疗现状进行讨论和分析，找出儿科临床诊治儿童腺病毒肺炎中的误诊原因，提高临床的病毒快速检测手段，早期诊断合理用药，缩短病程，尽量减少并发症的发生。
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地塞米松预培养兔BMSCs促进腺病毒介导BMP2转基因的高效表达
目前,骨形态发生蛋白2(BMP2)的基因治疗在骨组织工程中正成为广泛研究的热点.国外新研究表明,以腺病毒为载体转染骨髓间充质干细胞(BMSCs)表达BMP2的效率取决于细胞的分化状态,1 μmol/L地塞米松诱导培养人BMSCs后再进行腺病毒转染,其BMP2的表达量是单纯转染组的20倍[1]..
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腺病毒介导的人骨形态发生蛋白2基因修复兔桡骨缺损
目的评价腺病毒介导的人骨形态发生蛋白2(Adv-hBMP-2)基因对兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)的诱导成骨活性及修复长骨干骨缺损的效果. 方法 (1)抽取兔骨髓行BMSCs培养,经Adv-hBMP-2转染后分别行免疫沉淀加Western印迹法和碱性磷酸酶(ALP)检测及von Kossa染色,并行裸鼠肌内诱导成骨试验.(2)修复兔桡骨缺损:15只兔30侧、1.5 cm的骨缺损分为Adv-hBMP-2转染BMSCS加珊瑚及胶原载体组、β半乳糖苷酶(Adv-βgal)转染BMSCs加载体组、未转染BMSCs加载体组、载体组和未治疗组,术后行X线、组织学检查. 结果 (1)Adv-hBMP-2组BMSCs表达hBMP-2,其ALP活性升高,并有钙结节形成,裸鼠肌内注射后有异位成骨.(2)在兔桡骨缺损处,Adv-hBMP-2转染组有明显骨痂形成,5个组的愈合率分别为4/5、2/5、2/5、0/5、0/5. 结论 Adv-hBMP-2基因转染的BMSCs是修复骨缺损的好方法.
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腺病毒介导的低氧诱导因子-1α基因对大鼠脊髓损伤神经细胞凋亡的影响
近年来研究证明减少脊髓损伤后各种有害因子引发的继发性损害, 抑制或减少神经细胞的凋亡,可促进脊髓损伤后功能的恢复.低氧诱导因子-1α(HIF-1α)广泛参与低氧诱导的适应性反应,缺氧条件下,在许多种组织细胞中广泛表达,促进局部组织对低氧的耐受及新生血管形成.笔者通过大鼠脊髓损伤模型,检测转HIF-1α基因后HIF-1α在大鼠脊髓损伤中的表达及其对大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡的影响.
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沉默ERRα对Bak1、Bcl2腺病毒转染骨细胞的影响研究
目的 研究沉默雌激素相关受体α(estrogen-related receptor alpha,ERRɑ)对沉默Bak1、Bcl2重组腺病毒载体转染的人成骨样细胞MG63的细胞活性以及相关蛋白的影响.方法 构建Bak1、Bcl2腺病毒载体,将shBak1、sh-Bcl2腺病毒载体转染的MG63细胞分成空载病毒组(NC对照组)、沉默Bak1组、沉默Bcl2组、沉默Bak1+Bcl2组四组,再用ERRɑ 干预上述四组细胞,MTT法检测细胞增殖,考马斯亮蓝蛋白定量检测碱性磷酸酶(alkaline phos-phates,ALP)活性,流式法测定钙离子浓度,Western blot法分析骨形态发生蛋白-4(bone morphogenetic protein-4,BMP-4)、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)表达.结果 a)与NC对照组比较,(Ad-shERRɑ+Ad-shBak1)组细胞活性、ALP活性、CTGF、OPN、Runx2明显升高(P<0.01),BMP-4(P<0.05)、钙离子浓度、TNF-ɑ 明显降低(P<0.01),(Ad-shERRɑ+Ad-shBcl2)组细胞活性、ALP活性、BMP-4、CT-GF、OPN、Runx2均显著降低(P<0.01),钙离子浓度和TNF-ɑ 明显升高(P<0.01),(Ad-shERRɑ+Ad-shBak1+sh-Bcl2)组的钙离子浓度、BMP-4、CTGF、OPN、Runx2、TNF-ɑ 均降低(P<0.05);b)与(Ad-shERRɑ+Ad-shBak1)组比较,(Ad-shERRɑ+Ad-shBcl2)组与(Ad-shERRɑ+Ad-shBak1+shBcl2)组细胞活性、ALP活性、CTGF、OPN、Runx2明显下降(P<0.01),钙离子浓度明显升高(P<0.05),(Ad-shERRɑ+Ad-shBcl2)组BMP-4、TNF-ɑ 均显著降低(P<0.01),(Ad-shERRɑ+Ad-shBak1+shBcl2)组TNF-ɑ 明显升高(P<0.01);c)与(Ad-shERRɑ+Ad-shBcl2)组比较,(Ad-shERRɑ+Ad-shBak1+shBcl2)组的BMP-4、CTGF、OPN均升高,细胞活性、钙离子浓度 、TNF-ɑ均降低(P<0.01).结论 ERRɑ 沉默可提高Bak1沉默的细胞活性、BMP4、CTGF、OPN、Runx2表达量和降低钙离子浓度、TNF-α表达量;可降低Bcl2沉默的细胞活性、BMP4、CTGF、OPN、Runx2表达量和提高钙离子浓度、TNF-α表达量.
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以腺病毒为载体的基因治疗药物毒性及其机制的研究进展
基因治疗药物已成为当今生物技术药物研发的重点,而腺病毒是目前临床基因治疗较常选用的载体系统.它们在发挥治疗作用的同时,亦会引起机体出现毒性反应.从腺病毒载体及相应药物引发的毒性反应,固有免疫及获得性免疫系统活化等方面对它们的毒性及其机制进行总结.
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治疗用乙型肝炎腺病毒注射液TC007食蟹猴免疫原性、免疫毒性和生物分布研究
目的 重复给予食蟹猴治疗用乙型肝炎腺病毒注射液(TC007),观察其免疫原性、免疫毒性、生物分布.方法 普通级食蟹猴随机分为溶媒对照组,TC007低、中、高剂量(1.0× 109、1.0×1010、1.0×1011 VP/只)组,Ad5-Null (1.0×1011 VP/只,空载对照)组,每组10只,背部肩胛区sc给药,每周给药1次,共7次,停药恢复28 d.应用流式细胞仪进行外周血中淋巴细胞分群检测,检测经TC007刺激后分泌干扰素-γ(IFN-γ)的特异T细胞水平;免疫组化检测肝脏IFN-γ、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-2(IL-2)表达;试剂盒法测定血清中抗Ad5抗体的中和活性,补体成分C3、C4及免疫复合物(CIC)水平;给药期及恢复期结束,进行多个组织取材,HE染色后进行病理学阅片,TaqMan探针qPCR法进行Ad5分布检测.结果 与溶媒对照组比较,各组动物血浆中CD3+CD8+T细胞、CD4+/CD8+、CD3-CD56+ NK细胞、CD3+CD56+NKT细胞、巨噬细胞CD45+CD14+百分率均未见明显异常;Ad5-Null组特异T细胞均未见明显改变,TC007各剂量组针对HBV 3种抗原(Core、Env、Pol)分泌IFN-γ的特异性T细胞水平显著增加(P＜0.05、0.01),停药恢复末期(d68),效应值仍略高;TC007各剂量组和Ad5-Null组食蟹猴肝脏组织中IFN-γ、TNF-α、IL-2均高于溶媒对照组,且呈剂量相关性,但TC007各剂量组与Ad5-Null组比较未见明显差异;TC007各剂量、Ad5-Null组动物均产生抗Ad5抗体,39/40例具有中和活性;TC007各剂量组补体C3、C4未见明显异常,高剂量组CIC轻微升高(P＜0.05).Ad5主要分布于给药局部,在腋下淋巴结有少量分布,其他组织未见分布.TC007及Ad5-Null组均可见给药局部轻微至轻度皮下组织炎性细胞浸润,停药恢复28 d,病变可见明显恢复,其他组织未见病理学改变.结论 TC007在食蟹猴体内具有一定免疫原性,抗Ad5抗体具有中和活性,高剂量组可见轻微免疫复合物形成,未见免疫器官损伤,生物分布主要集中于给药部位,可产生特异性T细胞.
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重组腺病毒对烫伤大鼠肝组织核因子-κB活性的调控
目的探索腺病毒介导IκBα基因对烫伤大鼠肝组织核转录因子NF-κB活性的调控作用.方法应用重组缺陷型腺病毒载体(AdIκBα)预处理大鼠,烫伤后不同时相点取肝组织,提取组织核蛋白,与r-32PATP标记的NF-κB特异性探针共同反应,利用凝胶电泳迁移率改变分析方法(EMSA)检测NF-κB/DNA结合活性;提取肝组织总RNA,用RT-PCR法检测IL-1β、TNFα mRNA的表达.结果与正常对照组相比,烫伤组致伤后0.5 h NF-κB/DNA结合活性显著增强,至伤后24 h,仍保持较强结合活性.AdIκBα预处理组,大鼠NF-κB/DNA结合活性略高于正常,但显著低于烫伤组.RT-PCR分析,大鼠烫伤后0.5 h与对照组相比,IL-1β、TNFα表达显著升高,持续至伤后24 h;AdIκBα预处理组,IL-β和TNFα表达显著低于烫伤组.结论大鼠严重烫伤后,肝组织细胞内NF-κB迅速活化,IL-1β和TNFα的表达随之显著增强;经AdIκBα预处理能显著抑制大鼠严重烫伤后肝组织NF-κB的活化,并下调IL-1β、TNFα的表达.
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热休克蛋白70基因重组腺病毒载体微胶囊化及口服转染的研究
目的为利用热休克蛋白70(heat-shock protein,HSP70)防治严重烧伤后缺血缺氧性损伤的基因治疗提供可行的基因转染途径. 方法利用微胶囊技术包裹含HSP70基因的复制缺陷型重组腺病毒载体,检测其在人工胃、肠液中的融出率,并进行大鼠的口服转染,检测目的基因表达. 结果用微胶囊技术可成功包裹腺病毒载体.制备的微胶囊在人工胃液中仅有少量崩解,而在肠液中则半数崩解.RT-PCR检测大鼠口服转染微胶囊后目的基因表达确切. 结论利用微胶囊技术可成功包裹含HSP70基因的腺病毒载体,并保护其免受胃液损伤,在肠道中被释放吸收.
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小鼠异体皮移植创面使用细胞毒性T淋巴细胞抗原4-Ig重组腺病毒载体对其免疫功能的影响
目的在小鼠背部移植异体皮后局部使用细胞毒性T淋巴细胞抗原4-Ig(CTLA4-Ig)重组腺病毒载体,观察其对机体免疫功能的影响.方法将60只BALB/c小鼠随机分为手术对照(A)组、CTLA4-Ig转染(B)组及正常对照(C)组,每组20只.A、B组小鼠制作1.5 cm×1.5 cm创面,移植同创面大小的C57BL小鼠皮肤后,A组小鼠创面涂抹不含腺病毒的交联聚丙烯酸树脂(卡波姆霜)0.1 g;B组小鼠创面涂抹含腺病毒的卡波姆霜0.1 g,病毒滴度5 × 109/L.C组小鼠不作任何处理.术后1 d分别向3组小鼠腹腔内注射体积分数10%绵羊红细胞(SRBC)1 ml.术后7、14、21、28 d收集血清进行凝集试验,检测SRBC抗体的效价,同时取BALB/c、C57BL及昆明小鼠的脾淋巴细胞作混合淋巴细胞培养(MLC),观察CTLA4-Ig对脾淋巴细胞的抗原识别特异性及再次应答的影响.结果3组小鼠抗SRBC抗体效价组间比较,差异无显著性意义(P》0.05).术后14 d内与A组比较,B组小鼠脾淋巴细胞与对C57BL小鼠脾淋巴细胞表现出特异性低反应(P《0.05);14 d后,A、B组的再次应答达到或超过C组(P》0.05).结论局部使用CTLA4-Ig重组腺病毒不影响小鼠的体液免疫功能,但可能引起系统性的特异性细胞免疫耐受.
关键词： 皮肤移植 细胞毒性T淋巴细胞抗原4 腺病毒 -
双黄连粉针剂在临床应用中配伍禁忌的观察
双黄连粉针在临床应用甚广,其主要作用是清热解毒,辛凉解表,对流感病毒、副流感病毒、柯萨奇病毒、腺病毒等引起的感染有显著的治疗作用,另对金黄色葡萄球菌、肺炎球菌等有一定的抑制作用.主要用于急性上呼吸道感染、急性支气管炎、急性扁桃体炎.通过在临床的应用、观察,发现它与许多药物之间存在着配伍禁忌,而常用药物配伍禁忌表及本药物的说明书中均未明确指出,故在临床配药过程中往往较盲目,造成大量药品的浪费,为避免此现象的发生,进一步探讨双黄连粉针剂的临床配伍禁忌,我们将其与临床上常用的80种注射剂的配伍情况进行观察,现将结果报告如下.
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介导CTLA4Ig及IκBα重组腺病毒载体对烧伤创面皮片移植的影响
目的探讨重组CTLA4Ig及IκBα重组腺病毒载体延长烧伤创面皮片移植存活情况.方法采用Wistar大鼠36只, 随机分为3组,1组:正常对照组,2组:用AdCTLA4Ig液室温浸泡转染1 h,3组:用Adv CD40LIg-IRES2-CTLA4Ig液室温浸泡转染1 h.麻醉后常规背部备皮,在4 cm×4 cm面积上涂3%凝固汽油2 ml,燃烧20 s,致大鼠背部皮肤Ⅲ度烧伤,于烧伤后第3天,将所制备1.0 cm×2.0 cm大小长方形皮瓣移植于创面,加压包扎.观察重组腺病毒载体转染移植物后,在大鼠背部烧伤创面移植人断层皮肤的存活情况的影响.结果重组腺病毒载体能延长大鼠烧伤创面移植人断层皮肤的存活时间.结论重组腺病毒可用于延长烧伤创面异基因移植皮肤的存活期.
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一种从培养上清获得高滴度腺病毒的方法
目的寻找一种有效的提高腺病毒滴度而又不损害其活性的方法.方法腺病毒原液升华冻干后溶解稀释,通过斑点形成实验和免疫组化方法检验其感染活性.结果升华冻干后稀释的腺病毒液感染滴度达到4.4×1012 pfu.结论冻干、稀释是一种提高腺病毒滴度的有效方法.
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Ad-shRNA-NgR转染EAE大鼠脑组织安全性评估
目的 观察NgR特异性RNA干扰的重组腺病毒(Ad-shRNA-NgR)转染实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)脑组织后,EAE大鼠的存活情况,为EAE干预实验提供依据.方法 80只大鼠建立EAE大鼠模型后,将其随机分成高、中、低、对照组,每组20只.实验组分别用滴度为1×1011 pfu/mL、1×1010 pfu/mL、1×109 pfu/mL的Ad-shRNA-NgR注入EAE大鼠侧脑室.观察注射后第3天、第7天EAE大鼠的存活情况.结果 Ad-shRNA-NgR转染EAE脑组织后,高滴度组在第3天和第7天时EAE大鼠的存活率显著低于中、低滴度组,差异具有统计学意义(P<0.05).中、低滴度组和对照组EAE大鼠的存活率无显著性差异(P>0.05).结论 Ad-shRNA-NgR转染EAE大鼠实验时,滴度从1×1010 pfu/mL到1×109 pfu/mL范围是安全的.
关键词： 腺病毒 实验性自身免疫性脑脊髓炎 转染 安全性 动物模型 -
骨形成蛋白2重组腺病毒的构建及异位诱导成骨的研究
目的构建骨形成蛋白2(BMP2)重组腺病毒,探讨其诱导成骨的作用.方法将BMP2基因克隆到转移载体pAdTrack-CMV中,在细菌BJ5183中与pAdEasy腺病毒基因组进行同源重组,得到BMP2重组腺病毒基因组,通过转染HEK293细胞,包装出重组腺病毒.然后,用其进行裸鼠异位诱导成骨.结果经过PCR及酶切鉴定,证明获得了BMP2转移质粒pAdTrack-BMP2和BMP2腺病毒基因组,并包装出重组腺病毒.组织学观察显示,2周时局部大量纤维样细胞聚集,软骨细胞分化;5周时骨小梁形成,软骨细胞已退化.结论 BMP2组腺病毒的构建及其异位诱导成骨的功能为其在BMP2基因治疗中的应用奠定了良好的基础.
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β4整合素结合蛋白调控成纤维细胞胞外基质生成的实验研究
目的 探讨β4整合素结合蛋白(ITGB4BP)对成纤维细胞胞外基质生成的调控作用.方法 分别构建、包装能在哺乳动物细胞中促进和抑制ITGB4BP表达的腺病毒表达载体pAdEasy-ITGB4BP-EGFP和慢病毒表达载体Lentivirus-FIV-H1/U6-copGFP-ITGB4BP-RNAi,经筛选鉴定有效后,分别感染人正常皮肤成纤维细胞和增生性瘢痕(HTS)成纤维细胞,利用ELISA检测细胞培养上清内基质金属蛋白酶(MMP-9)、转化生长因子-β1(TGF-β1)和Ⅰ型胶原蛋白(collagen Ⅰ)的表达情况.结果 正常皮肤成纤维细胞内ITGB4BP高表达后,引起MMP-9、TGF-β1和collagen Ⅰ表达降低;反之HTS成纤维细胞内ITGB4BP表达抑制后,MMP-9、TGF-β1和collagen Ⅰ表达增高.结论 ITGB7BP对MMP-9、TGF-β1和collagen Ⅰ表达具有重要调节功能.提示ITGB4BP可能具有抗纤维化的重要功能,为下一步深入探讨HTS的形成机制提供了重要依据.
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免疫斑点法对病毒性腹泻病人腺病毒抗体的检测
①目的介绍免疫斑点法对病毒性腹泻病人血清腺病毒抗体检测的效果.②方法经探索多种实验条件,建立了快速、简便、敏感检测病毒抗体的斑点法,温度42℃,作用时间2 h.③结果抗原膜可在室温保存2个月以上,该法对腺病毒检测具有较好的特异度和灵敏度.④结论该方法操作简单,结果易判断,是腺病毒腹泻病人实验室诊断及流行病学调查的一种较为理想的方法.
