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显性负性突变型TGF-βⅠ型受体腺病毒的构建和功能验证
目的:构建制备显性负性突变型转化生长因子(TGF-β)Ⅰ型受体腺病毒,并验证其对于相应配体功能的抑制效应.方法:利用分子克隆技术构建和重组腺病毒技术,构建制备显性负性突变型TGF-βⅠ型受体腺病毒,并用其感染C3H10细胞,采用荧光显微镜观察和RT-PCR证明显性负性突变型TGF-βⅠ型受体腺病毒在C3H10细胞中的表达.采用碱性磷酸酶(ALP)定量和荧光素酶报告基因实验,分析显性负性突变型TGF-βⅠ型受体腺病毒对骨形成蛋白2(BMP2),TGF-β1功能的影响,证明其抑制相应配体功能的有效性.结果:构建和制备了显性负性突变型TGF-βⅠ型受体腺病毒,其可以感染C3H10细胞并在C3H10细胞中表达相应的显性负性TGF-βⅠ型受体;特定的显性负性突变型TGF-βⅠ型受体腺病毒可分别抑制由BMP2诱导的ALP活性及由TGF-β1诱导的荧光素酶活性.结论:成功构建制备的7种显性负性突变型TGF-βⅠ型受体腺病毒具有抑制相应配体功能的特性,为分析TGF-βⅠ型受体功能及靶向TGF-β信号通路的基因治疗提供了有用的工具.
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重组腺病毒Ad-HGF抑制博来霉素致大鼠肺纤维化的作用
目的:观察携带肝细胞生长因子基因的重组腺病毒(Ad-HGF)对博莱霉素(BLM)致大鼠肺纤维化的抑制作用,为基因防治肺纤维化探索有效途径. 方法: BLM气管内滴注0.5 mL(2 mg)制作大鼠肺损伤模型60只,分为Ad-HGF治疗组(A组)、Ad-GFP治疗组(B组)和模型对照组(C组),各20只. 造模次日A组给予1×109 pfu Ad-HGF,B组给予1×109 pfu Ad-GFP,C组给予0.5 mL生理盐水灌注治疗;于14 d处死动物,检测肺组织匀浆中羟脯氨酸含量;做石蜡切片,用1 g/L苦味酸天狼猩红染色,偏振光显微镜观察胶原及其类型,并对切片中I型胶原进行半定量评估. 结果: Ad-HGF组羟脯氨酸含量(1.91±0.16) mg/g较Ad-GFP组(3.27±0.43) mg/g和模型对照组(3.04±0.26) mg/g低(P<0. 05);肺组织切片中的I型胶原Ad-HGF组(2.12±0.61)明显较Ad-GFP组(3.17±0.56)和模型对照组(3.38±0.66)稀少(P<0.05). 结论: 重组腺病毒Ad-HGF对肺损伤后纤维化有抑制作用.
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pten基因重组腺病毒对卵巢癌细胞生长的抑制作用
目的:观察携带野生型pten基因的重组腺病毒(Ad-pten)体外转染高转移卵巢癌HO-8910PM细胞后的表达,并研究其对卵巢癌细胞抑制增殖、诱导凋亡和抑制迁移的作用.方法:利用Ad-Easy腺病毒载体系统构建Ad-pten,体外转染高转移卵巢癌HO-8910PM细胞,荧光显微镜检测Ad-pten的转染效率. Western印迹检测pten在HO-8910PM细胞中的表达;MTT实验观察pten对细胞生长的影响;HE染色法观察外源性pten基因表达对细胞形态学的影响;细胞划痕实验观察pten对细胞迁移的抑制作用;Hoechest33258凋亡染色检测pten基因对HO-8910PM细胞凋亡的诱导作用.结果:外源性野生型pten基因经腺病毒介导成功转入HO-8910PM细胞,Western印迹检测出有PTEN蛋白的表达,当感染复数MOI为100时,体外转染效率高达90%以上. pten显著抑制HO-8910PM细胞增殖、诱导其凋亡并能抑制其迁移.结论:重组腺病毒是高效的基因转移系统,能将pten目的基因高效地转移到高转移卵巢癌HO-8910PM细胞中,对细胞产生强有力的生长抑制及凋亡诱导作用,并能抑制其迁移.
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血管生成素1和报告基因EGFP双基因共表达腺病毒的构建
目的:构建并制备血管生成素-1和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体.方法:采用基因克隆技术克隆目的基因ANG-1,并将得到的基因亚克隆至含有报告基因EGFP的穿梭载体pAdTrack-CMV;使用Padeasy-1腺病毒系统将含有目的基因的穿梭载体与腺病毒骨架质粒在细菌BJ5183中同源重组,产生重组腺病毒载体;线性化重组的腺病毒转染入QBI-293A细胞中对重组的腺病毒进行包装并扩增. 结果:ANG-1基因与腺病毒穿梭载体连接成功,经Xho I/EcoR V双酶切后琼脂糖电泳可见在1.5 kb处出现特异性条带,证明pAdTrack-CMV-ANG-1重组质粒构建成功;重组的穿梭载体与pAdeasy-1质粒重组后,产物经Pac I酶切后琼脂糖电泳可见一大一小两个片段. 大小约为30 kb和4.5 kb,与预期结果相符,证明重组腺病毒pAd-ANG-1-EGFP构建成功;线性化重组的腺病毒转染入QBI-293A细胞后包装成功. 扩增后病毒滴度为2×1014 v.g./L,EGFP活性检测腺病毒感染细胞阳性率在30%以上. 结论:成功制备了pAd-ANG-1-EGFP腺病毒. 为骨组织工程血管化的研究打下基础.
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针对HBVx基因的siRNA重组腺病毒的制备及其对HBVx基因表达的抑制作用
目的:构建针对乙型肝炎病毒x基因(HBx基因)的小干扰RNA (siRNA)重组腺病毒表达载体,并在能表达HBx基因的人肝癌细胞株HepG2中观察其对HBx基因表达的抑制作用.方法:重组腺病毒穿梭载体pShuttle-HBx与骨架载体在大肠杆菌BJ5183中同源重组得到重组腺病毒载体,后者转染HEK293细胞,包装并扩增出病毒颗粒.用获得的病毒感染能表达HBx基因人肝癌细胞株HepG2,收集细胞总RNA和总蛋白,采用RT-PCR和Western Blot方法检测细胞中HBx基因表达的变化.结果:经限制性内切酶酶切鉴定,证实针对HBx基因的siRNA重组腺病毒载体构建成功.RT-PCR和Western Blot方法证实,在HepG2细胞中,HBx基因在mRNA和蛋白水平均有降低.结论:腺病毒介导的针对HBx基因的siRNA在体外能够高效、特异地抑制HBx基因的表达.
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细菌内同源重组快速构建和制备表达hSDF-1α的重组腺病毒
目的:利用细菌内同源重组快速构建携带hSDF-1α cDNA重组腺病毒质粒和制备表达hSDF-1α重组腺病毒. 方法: 制备感受态BJ5183,将pAdEasy-1转化BJ5183,制备含pAdEasy-1的BJ5183感受态,将线性化的pShuttle-EGFP-hSDF-1α转化含pAdEasy-1的BJ5183感受态菌. 采用细菌中同源重组法构建重组腺病毒质粒pAd-EGFP-hSDF-1α. pAd-EGFP-hSDF-1α用Pac Ⅰ线性化后,再用LipoVec介导其转染至AD293细胞内包装扩增出重组腺病毒颗粒,采用CsCl密度梯度离心法纯化重组腺病毒Ad-EGFP-hSDF-1α. 采用荧光显微镜下观察LipoVec介导的重组腺病毒质粒的转染效果及病毒包装情况. 结果:pShuttle-EGFP-hSDF-1α成功地转化了含pAdEasy-1的BJ5183,并在其内发生了同源重组. 荧光显微镜下观察证实了pAd-EGFP-hSDF-1α转染AD293后,产生了重组腺病毒Ad-EGFP-hSDF-1α. 病毒滴度为4.1×1015 pfu/L. 结论:用细菌内同源重组法可快速、高效制备表达hSDF-1α的高滴度重组腺病毒. 为研究hSDF-1α在动员骨髓源干细胞迁移到组织损伤部位修复组织损伤的研究奠定了基础.
关键词： 同源重组 人基质细胞源衍生因子-1 腺病毒 基因治疗 -
Cav1.2和Cav3.1在犬左心室不同部位中表达的比较
目的:研究犬左心室三层心肌L型钙通道(ICa-L)、T型钙通道(ICa-T)主要亚单位mRNA的表达情况,探讨其复极异质性的可能分子基础及意义. 方法:应用RT-PCR半定量分析犬左心室外、中、内三层心肌ICa-L α亚单位(Cav1.2)、ICa-T主要的亚单位(Cav3.1) mRNA的表达量. 结果:Cav1.2 mRNA的表达在左心室中层、内层均明显高于外层(P＜0.05),但在中层和内层之间无统计学差异(P＞0.05). Cav3.1 mRNA在外层几乎缺如,在中层、内层也只有少量表达且无明显统计学差异(P＞0.05). 结论:Cav1.2,Cav3.1 mRNA在犬左心室三层心肌中表达存在明显的差异,这种差异可能构成左心室三层心肌ICa-L及ICa-T分布差异的分子基础,在折返性心律失常的产生及药物治疗中可能起着重要的作用.
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人端粒酶催化亚单位基因正反义腺病毒表达载体的构建及鉴定
目的: 构建hTERT正义和反义腺病毒表达载体. 方法: 用EcoRⅠ从pGRN145质粒上切下约3.5 kb的人端粒酶全长cDNA片段,然后连入pDC315质粒的EcoRⅠ酶切位点上,经BamHⅠ酶切鉴定出正义和反义表达载体,并对正反义重组质粒进一步测序鉴定其方向. 结果: 经BamHⅠ酶切后,正义质粒形成1.0+6.4 kb两条带. 反义重组质粒为1.0+2.5+3.9 kb三条带,与理论计算值完全一致,测序结果进一步确认了方向的正确性. 结论: 成功构建了hTERT的正、反义腺病毒表达载体.
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人骨形成蛋白-7基因重组腺病毒的构建及其在兔骨髓间充质干细胞中的表达
目的:克隆人骨形成蛋白-7(BMP-7)基因并构建其重组腺病毒,观察其在兔BMSc中的表达. 方法:用RT-PCR方法从人胎肾组织中克隆人BMP-7基因全长cDNA并测序;将BMP-7基因cDNA克隆到穿梭载体形成转移质粒pAdTrack-CMV-BMP-7,经PmeI酶切线性化后与骨架质粒感受态细胞AdEasier-1 Cells经电穿孔法同源重组得到腺病毒质粒pAdBMP-7并酶切鉴定,PacI酶切线性化后转染293细胞包装后获得复制缺陷型重组腺病毒AdBMP-7,将AdBMP-7体外感染兔BMSc后,以RT-PCR方法及观察AdEasy系统上的绿色荧光蛋白表达鉴定BMP-7基因的表达. 结果:用RT-PCR方法从胎肾组织中克隆出1296 bp的cDNA,测序证实为人BMP-7基因;酶切鉴定表明BMP-7基因已插入到pAdTrack-CMV穿梭质粒且腺病毒重组质粒pAdBMP-7构建成功;经293细胞包装3 d后可观察到绿色荧光蛋白表达(GFP),氯化铯梯度离心法终获得约3×109 efu/L滴度的重组病毒;体外感染兔BMSc后RT-PCR方法及荧光显微镜证实BMP-7基因可在兔BMSc中表达. 结论:成功克隆人BMP-7基因并构建其重组腺病毒,证实了其在BMSc的表达,为骨再生的局部基因治疗打下基础.
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腺病毒介导HSV-tk/GCV系统杀伤脑胶质瘤C6细胞
目的: 观察腺病毒介导的单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶/丙氧鸟甘(herpes simplex virus thymidine kinase/ganciclovir--HSV-tk/GCV)系统对脑胶质瘤细胞的杀伤作用. 方法: 将AdCMVLacZ感染胶质瘤细胞C6,X-gal染色,测定腺病毒的转染率. AdCMVtk感染C6细胞后加入10 mg*L-1 GCV,观察肿瘤细胞存活率及旁观者效应. 结果: tk基因对C6细胞的转染率随着腺病毒的感染复数(MOI)量增加而增加(r=0.819, P<0.05),100%转染所需要的MOI为100. AdCMVtk/GCV对C6细胞的杀伤强度与AdCMVtk的量成正相关(r=0.870, P<0.05). 此杀伤作用存在旁观者效应,且较强. 结论: 腺病毒介导的HSV-tk/GCV系统具有杀伤脑胶质瘤的作用.
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腺病毒介导基因转染活体眼组织的研究
目的: 了解活体内不同途径应用腺病毒转染外源基因在眼组织的分布情况. 方法: 将含有β-半乳糖苷酶(beta-galactosidase, β-gal)报告基因的腺病毒,在1×109～1×1011 nfu*L-1的滴度下,分别采用玻璃体腔内注射、前房注射、表面点药及球旁注射到大鼠眼内,3 d, 1, 2, 3和4 wk后用β-gal染色法观察β-gal基因在眼组织内的分布情况. 结果: 各病毒滴度组均可有效地转染外源基因,且未观察到细胞病理改变. 玻璃体腔内注射的大鼠眼球组织包括角膜、虹膜、睫状体、视网膜均有β-gal基因表达,前房注射组角膜、虹膜、睫状体有表达,表面点药组仅有角膜上皮细胞表达,球旁注射组眼外肌有表达. 注射3 d后开始出现β-gal基因阳性表达,持续达4 wk以上. 结论: 腺病毒能有效、稳定地转染外源基因到活体眼组织的角膜、虹膜、睫状体、视网膜.
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腺病毒携带反义HSP70抑制人喉癌细胞的生长
目的: 观察HSP70反义RNA对人喉癌细胞Hep-2的作用,探讨其治疗喉癌的可行性. 方法: 应用电镜、流式细胞仪和免疫组化图像分析技术检测将携带反义HSP70腺病毒感染人喉癌细胞后,诱导细胞凋亡和HSP70基因表达情况. 结果: HSP70反义RNA阻断了Hep-2细胞的HSP70的表达,实验组可以见到典型的凋亡细胞,免疫组化证实,实验组瘤细胞低表达HSP70,而对照和空载体组高表达HSP70. 转染反义HSP70的腺病毒的Hep-2细胞比空载体组和对照组的细胞生长缓慢,细胞周期可见实验组出现亚二倍凋亡峰,而空载体组没有. 结论: HSP70反义RNA能显著减少人喉癌细胞内HSP70的表达,具有抑制肿瘤生长的作用. 有望成为抗喉癌的新基因治疗手段.
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p16和p53基因及顺铂联用对胆管癌细胞系QBC939的生长抑制作用
目的: 探索p16基因和p53基因及p16基因和顺铂(CDDP)联合应用对体内外胆管癌细胞系生长的抑制作用. 方法将重组体腺病毒p16(Ad-p16)和Ad-p53及Ad-p16和CDDP联合作用于人胆管癌细胞系QBC939,观察和分析其对体内外胆管癌细胞生长抑制作用及其机制. 结果 Ad-p16在QBC939细胞中表达能抑制QBC939细胞的生长,与p53、CDDP联合应用能明显抑制QBC939细胞的生长,p16和p53基因诱导癌细胞发生G1期阻滞和细胞凋亡,CDDP能诱导癌细胞发生G2期阻滞和细胞凋亡;裸鼠皮下移植瘤模型瘤体内注射Ad-p16及腹腔内注射CDDP均能抑制QBC939肿瘤的生长,两者联合应用具有协同作用. 结论 p16基因和p53基因及CDDP联合应用具有协同作用.
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神经营养素-3重组腺病毒促进脊髓背根神经节的存活
目的观察神经营养素-3（neurotrophin 3， NT-3）重组腺病毒（adenovirus vector for NT-3, Ad-NT-3）对脊髓背根神经节（dorsal root ganglia， DRG）细胞存活的促进作用. 方法原代培养DRG，加入不同感染增殖率（multiplicity of infection, MOI）的Ad-NT-3，观察DRG细胞的形态，MTT法测定DRG细胞的增殖活性. 结果当加入MOI为10和50的Ad-NT-3时，形态学观察发现，DRG细胞数目增加，突起变长，尤其以3 d后表现更为明显；DRG细胞的增殖活性显著增加(P<0.01). 当MOI为100时1 d和3 d，DRG细胞数目明显减少，无突起或变短，部分细胞死亡；MTT法测定DRG细胞的增殖活性均显著降低(P<0.01). 结论 NT-3基因能通过腺病毒介导表达NT-3蛋白，促进体外培养DRG细胞的存活.
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腺病毒介导的p16和顺铂的联合应用对胆管癌细胞系QBC939裸鼠皮下移植瘤模型的治疗实验
目的研究p16基因和顺铂联合应用对细胞系QBC939裸鼠皮下移植瘤模型的治疗作用. 方法将重组体腺病毒p16(Ad-p16)和顺铂 联合作用于胆管癌细胞系QBC939裸鼠皮下移植瘤, 观察和分析其对肿瘤的生长抑制作用. 结果用Ad-LacZ进行重组体腺病毒转导效率的检测,发现 当感染强度在100 MOI (Multiplicity of infetion)以上时,Ad-p16可使90.0%以上的培养的人胆管癌QBC939细胞被转导. 采用裸鼠皮下移殖瘤模型进行的体内治疗实验证实,瘤体内注射Ad-p16重组体腺病毒能抑制QBC939肿瘤的生长,以Ad-LacZ为对照,肿瘤的生长抑制率为30.0%,腹腔内注射顺铂对肿瘤的生长抑制率为41.0%,两者联合应用对肿瘤的生长抑制率为62.6%. 结论 p16基因能够增加QBC939细胞对顺铂的敏感性.
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腺病毒介导的p53对胆管癌细胞生长的抑制作用
目的研究p53基因对胆管癌细胞的作用. 方法将重组体腺病毒p53转移到人胆管癌细胞QBC939, 用RT-PCR、克隆形成实验、流式细胞仪、DNA片段化分析等方法对p53基因的表达、细胞的生长抑制及机制进行分析. 结果用Ad-LacZ进行重组体腺病毒转导效率的检测,发现当MOI为100以上时,重组体腺病毒可使90%以上的培养的人胆管癌QBC939细胞被转导. 用RT-PCR方法检测,在胆管癌QBC939细胞系中p53无表达. 重组体腺病毒能介导外源基因p53在胆管癌QBC939细胞系中高效表达. 重组体腺病毒介导的p53在QBC939细胞中表达,能抑制QBC939细胞的生长和集落形成. 流式细胞计数和细胞DNA Ladder, 证实p53能诱导QBC939细胞发生凋亡并导致其发生G1期阻滞. 结论 p53基因可能通过诱导肿瘤细胞凋亡及G1期阻滞在肿瘤的基因治疗方面发挥作用.
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腺病毒介导的p16对胆管癌细胞的生长抑制作用
目的研究p16基因对胆管癌细胞的作用. 方法将重组体腺病毒p16转移到人胆管癌细胞QBC939, 对p16基因的表达、细胞的生长抑制及机制进行分析 . 结果用Ad-LacZ进行重组体腺病毒转导效率的检测,发现当MOI为100以上时,重组体腺病毒可使90%以上的培养的人胆管癌QBC939细胞被转导. 用RT-PCR方法检测,在胆管癌QBC939细胞系中p16呈低表达 . 重组体腺病毒能介导外源基因p16在胆管癌QBC939细胞系中高效表达. 重组体腺病毒介导的p16在QBC939细胞中表达, 能抑制QBC939细胞的生长和集落形成. 流式细胞计数和细胞DN A Ladder, 证实p16能诱导QBC939细胞发生凋亡并导致其发生G1期阻滞. 结论 p16基因通过诱导肿瘤细胞凋亡及G1期阻滞在肿瘤的基因治疗方面发挥作用.
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p53重组腺病毒载体的构建
目的构建p53重组腺病毒载体以研究p53过度表达与腺病毒感染对细胞生长的影响.方法将p53 cDNA克隆到转移载体pAdCMV/p53重组质粒, 用该重组质粒及pJM17质粒共转染293细胞获得重组腺病毒,PCR法筛选含p53 cDNA的重组病毒.结果在挑选的5个空斑中,有4个含p53 cDNA阳性重组腺病毒.p53重组腺病毒可感染293细胞并在293细胞内进行有效的复制.结论成功构建了p53重组腺病毒, 为进一步研究p53重组腺病毒的功能提供了条件.
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神经营养素-3重组腺病毒Ad-NT-3的培养和鉴定
目的培养和鉴定重组腺病毒载体Ad-NT-3.方法在293细胞中培养扩增Ad-NT-3, 用组织培养半数感染量法测定其滴度.从病毒培养上清中提取DNA,用聚合酶链反应技术扩增NT-3部分基因片段,将扩增产物克隆并进行序列分析以测定Ad-NT-3中NT-3的存在及种属 .结果 Ad-NT-3扩增后获得了较高滴度的病毒.从形态学证实Ad-NT- 3含有复制能力的腺病毒 ;聚合酶链反应技术证实Ad-NT-3含有NT-3基因;序列分析明确该NT-3基因系人的NT-3 基因.结论 Ad-NT-3 重组腺病毒含有人神经营养素-3基因及有复制能力的腺病毒.
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人突变型低氧诱导因子1α腺病毒载体的构建及鉴定
目的: 构建人突变型低氧诱导因子1(HIF-1)α腺病毒表达载体,研究人突变型HIF-1α基因对冠心病的血管新生作用. 方法: 采用分子克隆技术,由pcDNA3.1(+)-HIF1α(突变型)质粒获得突变型HIF1α cDNA,克隆到穿梭质粒pShuttle2,以PI-Sce I和I-Ceu I双酶切重组穿梭质粒,获得含有突变型HIF1α cDNA的表达盒,通过体外连接法与线性化的腺病毒骨架质粒Adeno-X Viral DNA连接,重组成pAdeno-HIF1α腺病毒质粒,经酶切及测序鉴定正确后,在HEK293细胞中包装成为重组Adeno-HIF1α腺病毒,并进行PCR鉴定及滴度测定. 结果: 经酶切鉴定及基因测序证实重组腺病毒质粒构建成功,包装后冻融细胞的上清PCR检测重组腺病毒包装成功,病毒滴度为2×1012 pfu/L. 结论: 成功构建重组腺病毒Adeno-HIF1α(突变型),为冠心病的突变型HIF1α基因治疗研究奠定基础.
