腺病毒介导基因治疗与病毒治疗前列腺癌的靶向研究进展

前列腺癌是老年男性高发性肿瘤疾病.运用雄激素去势治疗早期可以有效抑制肿瘤生长,但2～3年后大部分前列腺癌进展为去势抵抗性前列腺癌,或晚期肿瘤发生转移,导致患者死亡.去势抵抗性前列腺癌及转移癌目前缺乏有效的治疗手段,腺病毒介导的基因治疗与病毒治疗是近年来肿瘤治疗的热点,也是前列腺癌治疗的新方法.腺病毒在人体内的肿瘤靶向性是病毒发挥抗肿瘤作用及对人体安全性的关键环节.本文就目前在基础研究中有关腺病毒介导基因治疗与病毒治疗前列腺癌的靶向策略进行综述.

表浅性膀胱癌的腔内基因治疗

膀胱癌是泌尿外科常见的恶性肿瘤.对于非浸润或浅表浸润肿瘤一开始即行经尿道肿瘤切除.这些肿瘤或原位癌在经尿道切除术后,行膀胱灌注化学治疗或卡介苗(BCG)治疗能延长无肿瘤期.但是,约70%的肿瘤将复发,其中10%～20%将发生肌层浸润,此时患者的预后较差并需行膀胱全切术[1].因此,需要更新而有效的局部治疗方法,以改善肿瘤患者的生存并尽可能保留膀胱.基因治疗即是这些新疗法中的一种.由于膀胱解剖位置的特殊性,易于监视肿瘤,因此膀胱肿瘤非常适于基因治疗.

科萨奇-腺病毒受体抑制肿瘤细胞侵袭迁移

FK228对人正常细胞中腺病毒基因表达的干预效应

急性病毒性心肌炎的治疗体会

病毒性心肌炎是指由柯萨奇病毒.埃可.脊髓灰质炎.腺病毒40.41,流感病毒感染引起的心肌局限性或弥漫性的急性或慢性炎症病变,属于感染性心肌疾病.近年来,发病率有逐年增多的趋势.它起病急,来势凶猛,早期并发症多,心电图诊断无特异性,如不及时作出诊断和治疗,短期内可致死亡.现将我院2006年1 月至2008年12月收治的急性病毒性心肌炎病人的诊治体会报告如下:

热毒宁注射液治疗小儿咽结合膜热的疗效及安全性评价

目的：对于治疗小儿咽结合膜热使用热毒宁注射液是否有效及安全性研究分析。方法选取我院60例咽结合膜热患儿在2012年2月～2012年8月期间热毒宁使用治疗下情况。随机分为观察组与对照组两组，两组患者使用相同消炎，抗病毒等常规治疗，7d为一疗程。两组在不同药物下进行治疗，治疗中记录患儿病情及体征变化。结果有效率为94．3％标记为观察组，有效率为72．3％标记为对照组，疗效存在显著性差异（P＜0．05）。结论热毒宁对于治疗小儿咽结合膜热方面效果突出，值得在临床上应用和推广。

氧驱动雾化吸入治疗小儿毛细支气管炎的疗效观察和护理

毛细支气管炎是婴儿常见的呼吸道感染,多发生于6个月以内的小婴儿.冬春季节多见,多由病毒(呼吸道合胞病毒、腺病毒等)引起.常发生于70-300um的毛细支气管.毛细支气管是气管分支的末端靠近肺泡的部分,它的管腔很细,一旦发炎,粘膜充血水肿,容易引起阻塞,造成呼吸困难.重病患儿有烦躁不安、哭闹、呼吸困难、鼻翼扇动、面色苍白、口周发青,非常痛苦.由于呼吸困难,影响吃奶、喝水.喘憋时间长了还可引起心力衰竭,表现为心跳加快,心音低钝,肝脏进行性增大.本病由于喘憋严重,且患几年龄幼小,约1/3的毛细支气管炎患儿可能在日后发展成为哮喘,所以要及早诊治.氧驱动雾化吸入疗法是应用高速氧气把药物变成细微的气雾,给患者吸入进入气管、支气管和肺泡,起到稀释痰液、利于排痰、消炎、解痉、平喘等作用.

毛细支气管炎48例患儿的护理体会

毛细支气管炎是一种特殊类型的感染性疾病,仅发生于两岁以内婴幼儿,多数是1～6月的小婴儿.起病急,四季均可发病.早产儿及营养不良、先心病患儿病情较重,甚至可造成死亡.呼吸道合胞病毒是常见的病原,副流感病毒、腺病毒、流感病毒、呼肠病毒与鼻病毒均可引起本病,少数由人肺炎支原体引起[1].国内报道单纯病毒感染占56.5％,混合感染占30.4％[2].现将我科2011年1月～12月收治的48例毛细支气管炎患儿的护理体会报道如下.

SFRP2基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的:成功构建携带SFRP2基因的腺病毒载体.方法:从pGBKT-SFRP2质粒中扩增SFRP2基因,将SFRP2基因亚克隆至质粒穿梭载体pAd-Track-CMV.用脂质体转染法将重组腺病毒pAd-Track-PPAR γ 2-CMV和pAdEasy-1共转染293细胞,成功构建的重组腺病毒Ad-SFRP2,确定转染效率.原代培养增生性瘢痕成纤维细胞,利用Ad-SFRP2感染该细胞.通过RT-PCR和Western Blot分别检测感染后人瘢痕成纤维细胞及对照组细胞中SFRP2基因mRNA和蛋白表达水平.结果:RT-PCR检测结果显示腺病毒Ad-SFRP2的PCR产物约为904bp,SFRP2 mRNA表达水平明显增高；用抗SFRP2多克隆抗体进行Western blot检测为阳性,感染的重组腺病毒载体在人瘢痕成纤维细胞中SFRP2蛋白有较高的稳定表达.结论:成功构建含有人SFRP2基因的重组腺病毒Ad-SFRP2;它可有效提高人增生性瘢痕成纤维细胞中SFRP2基因的表达水平.

腺病毒与慢病毒载体对人脂肪间充质干细胞转导效率及基因表达的差异

目的:比较重组腺病毒、慢病毒载体介导增强型绿色荧光蛋白对体外培养的人脂肪来源干细胞(hADSCs)的转导效率和外源基因表达差异.方法:原代分离培养hADSCs并鉴定,应用Ad5F35-EGFP及LV-EGFP以MOI=0、25、50、100、200、400、800感染hADSCs,在1、3、7、14、21天应用荧光显微镜、流式细胞仪观察检测表达EGFP细胞阳性率.MTT法检测转导对hADSCs增殖的影响.Von Kossa染色、油红0染色检测体外诱导转导EGFP的hADSCs向成骨及成脂方向分化能力.结果:hADSCs细胞表面标记CD31、CD34、CD45、CD106和HLA-DR阴性,CD29、CD44、CD49d、CD105、CD166阳性.荧光显微镜观察Ad5F35-EGFP感染hADSCs后(1～7天)可见EGFP高表达,此后逐渐减弱;LV-EGFP感染hAOSCs后21天,仍可见EGFP高表达.流式细胞仪检测Ad5F35-EGFP、LV-EGFP对hADSCs转导效率与MOI值呈正相关.MTT显示Ad5F35-EGFP在高MOI值(800)检测A值与对照组相比差异显著(P<0.01).转导EGFP的hADSCs经体外诱导14天可向成骨、成脂方向分化.结论:与腺病毒相比,慢病毒能够更为安全,有效地感染体外培养hADSCs,并长期表达外源基因,是研究基因修饰hADSCs的理想载体.

腺病毒-VEGF基因重组体促进预构皮瓣成活的实验研究

目的:应用大鼠预构皮瓣模型,探讨基因治疗技术产生的血管内皮生长因子促进预构皮瓣血管新生和皮瓣存活的可能性,为临床上寻找加速预构皮瓣成熟的新方法提供实验依据.方法:20只SD大鼠每只腹部两侧各构建一个预构皮瓣,共构建40个皮瓣,每只大鼠两侧皮瓣按随机原则进行不同的处理,分别归于实验组或对照组,每组各20个皮瓣.于大鼠腹部两侧各标记3cm × 2cm矩形预构区,短边平行于腹股沟韧带,自尾侧短边中点向后纵向切开后肢皮肤,剥离出长约2cm的股动静血管束,远端结扎切断.在两侧预构区域的中轴线上,于真皮与肉膜层间各制作一皮下隧道,实验组的隧道壁皮下组织内注射携带有VEGF基因的腺病毒,同法向所有对照组的隧道壁软组织内注射等量生理盐水.将已剥离好的血管束向颅侧翻转置入相应皮下隧道内.所有已植入股血管的预购区域2周后均被制成以植入血管束为蒂的岛状皮瓣,从两组中各取一个皮瓣进行免疫组化染色,观察有无VEGF生成,其余岛状皮瓣均缝回原处.形成岛状皮瓣后第七天观察皮瓣存活及血管新生情况.结果:实验组与对照组的皮瓣平均存活率分别为(90.48±1.89)%、(69.75±2.36)%,其差异有统计学意义(P<0.01);血管放射显影图上,实验组植入血管周围见广泛白色显影,尤以血管两端明显,而对照组新生血管显影仅局限于植入血管周围;组织学切片显示实验组植入血管周围新生血管丰富,以毛细血管为主,并见肉芽成份,对照组新生血管相对较少,两组间新生小血管管腔大小则无明显差异;免疫组化检测显示仅实验组皮瓣中有VEGF表达.结论:腺病毒-VEGF基因重组体能通过促进预构皮瓣的血管新生,增加预构皮瓣的存活率.

腺病毒介导外源基因经动脉转染大鼠腹壁浅动脉岛状皮瓣的研究

目的:探讨腺病毒载体介导外源基因经动脉灌注转移修饰大鼠腹壁浅动脉岛状皮瓣(Superficial inferior epigastric artery flap,SIEA)的可行性、安全性并对其转染条件作出评价.方法:本研究通过血管夹暂时夹闭形成局部封闭环境,应用腺病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因(Ad5-CMV-EGFP)经动脉灌注带蒂SIEA 60min.60只SD大鼠随机分为6组:A、B、C、D组分别为:3.0×106、3.0×107、3.0×108、3.0×109pfu/ml,E组:PBS、F组:腺病毒空载体.术后7天应用活体荧光成像系统观察皮瓣的荧光强度,应用共聚焦显微镜、RT-PCR检测皮瓣组织中EGFP的表达和分布情况,通过组织学分析对皮瓣的安全性影响.结果:术后7天B组、C组、D组活体观察皮瓣可见体表绿色荧光信号.共聚焦显微镜观察结果与活体观察结果一致,EGFP在皮瓣内血管内、外膜均可见表达,血管周围组织包括脂肪、毛囊可见EGFP表达,皮瓣外组织未见EGFP表达.对照组E组、F组未见EGFP表达.RT-PCR结果显示,EGFP仅在皮瓣内表达,其他重要脏器(心脏、肝脏、肾脏)无表达.对皮瓣组织学观察未见明显炎症反应.结论:复合组织瓣转移修复创面是一种成熟的手术方式.本研究从大体观察、组织形态学和分子生物学三方面评价外源基因经动脉内灌注转染大鼠带蒂皮瓣的可行性,为进一步深入研究基因修饰复合组织瓣,使其发挥治疗性修复创面作用提供理论依据

hBMP-2基因转染兔骨髓间充质干细胞的表达及生物学效应的观察

目的:观察人骨形态发生蛋白-2(human bone morphogenetic protein-2,hBMP-2)基因转染兔骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell s,BMSCs)后的表达及表达产物对BMSCs增殖和向成骨细胞分化的影响.方法:利用腺病毒表达载体Adeno-XTM将hBMP-2基因转染兔BMSCs,用免疫组化染色.检测细胞内BMP-2的表达.然后通过MTT法分析其对细胞增殖的影响,并分别通过体外检测Ⅰ型胶原合成和表达情况、碱性磷酸酶染色和钙结节Von Kossa染色,观察腺病毒介导hBMP-2基因转染兔BMSCs的成骨分化能力.结果:转基因细胞6周时仍能表达外源性基因.基因表达产物hBMP-2能明显促进BMSCs的增殖以及Ⅰ型胶原的合成,转染后第14天碱性磷酸酶染色多数细胞为阳性,第21天出现钙结节.结论:hBMP-2基因转染BMSCs后可获得稳定表达,且基因表达产物能促进BMSCs增殖,并诱导其向成骨细胞分化.

前列腺癌的基因治疗

面对治疗前列腺癌有限的几种治疗模式,其有限的成功率势必需要一种更加有效的治疗方案作为替代或补充,随着生物科技的迅速发展,前列腺癌基因治疗的研究也在不断的深入,基于前列腺癌的分子表达,通过基因介导以达到治疗的目的,在研究过程当中多种基因治疗方案已经取得了很大的发展,这些方法主要有以下几类:免疫基因治疗;细胞减数基因治疗;条件复制型腺病毒.我们相信这些新的治疗方案在不久的将来定将给患者带来巨大的福音,现对这一方法进行综述.

Sirt3对肝癌细胞增殖与侵袭的影响

目的:探讨线粒体去乙酰化酶Sirt3基因对肝癌细胞增殖及侵袭的影响.方法:构建Sirt3载体,利用腺病毒感染方法建立Sirt3过表达的肝癌细胞(AdEasy-Sirt3),并设置相应对照(AdEasy-EGFP).采用PCR与Western blotting实验分别鉴定病毒载体构建以及病毒感染后Sirt3蛋白过表达效果.采用EdU增殖实验与Transwell侵袭实验分别观察评价Sirt3对肝癌细胞的增殖与侵袭作用.结果:Sirt3腺病毒载体以及Sirt3蛋白过表达的肝癌细胞构建成功;与对照Ad-EGFP相比,Ad-Sirt3腺病毒感染的肝癌细胞增殖速度明显降低,差异具有统计学意义(P＜0.05);Ad-EGFP组与Ad-Sirt3组肝癌细胞的侵袭能力差异亦具有统计学意义(P＜0.01).结论:过表达Sirt3可显著抑制肝癌细胞(HLF与HLE细胞株)增殖和侵袭,提示Sirt3可能是肝癌治疗的潜在靶点.

携带干扰素基因的内皮祖细胞靶向抑制肿瘤的实验研究

目的:研究携带阿尔法干扰素(hαIFN)基因的内皮祖细胞(EPCs)对肿瘤免疫治疗的效果.方法:用健康捐献者的骨髓体外诱导培养EPCs,携带hαIFN基因的腺病毒Ad5-hαIFN转染EPCs制备EPCs-hαIFN,ELISA法检测EPCs-hαIFN培养上清液中hαIFN浓度.体外EPCs-hαIFN与HepG-2肝癌细胞按照1∶5的浓度混合培养,观察肿瘤细胞增殖情况.制作裸鼠肝癌模型,静脉注射EPCs-hαIFN,观察对肿瘤的抑制作用和对荷瘤动物生存期的影响.结果:使用人骨髓可以培养出CD133、KDR和CD34阳性的EPCs.携带hαIFN基因的EPCs-hαIFN培养液中可以测得hαIFN,高浓度可以达1400pg/ml以上,在相当长的一段时间内细胞培养液的hαIFN浓度保持稳定.EPCs-hαIFN与HepG-2细胞按照1∶5的浓度混合培养4天,HepG-2细胞的存活率为(70.50±3.33)％(P＜0.05).通过静脉注射EPCs-hαIFN可以抑制肿瘤的生长[肿瘤重量:EPCs-hαIFN组(0.71 ±0.23)g,空白对照组(3.27±1.28)g,P＜0.05],而皮下注射hαIFN和静脉注射EPCs-EGFP对肿瘤没有抑制作用.尾静脉注射EPCs-hαIFN可延长荷瘤裸鼠的生存时间(中位生存时间:EPCs-hαIFN组为39天,空白对照组为33天,P＜0.05).结论:肿瘤靶向性的EPCs-hαIFN可以通过分泌hαIFN抑制肿瘤的进展.

人MUC4启动子驱动HSV-TK腺病毒靶向杀伤胃癌细胞的研究

目的:构建人MUC4启动子驱动下的HSV-TK重组腺病毒,研究其对胃癌细胞的靶向杀伤作用.方法:免疫荧光法检测MUC4在胃癌细胞系中的表达.克隆MUC4启动子区625bp活性序列,利用重组荧光素酶检测系统检测其在SGC-7901胃腺癌细胞及NUGC4胃印戒细胞癌细胞中的转录活性.以AdEasyTM腺病毒系统为载体,构建MUC4启动子驱动下的HSV-TK重组腺病毒,与前体药物GCV联合,检测其对上述两种胃癌细胞的细胞毒作用.结果:MUC4蛋白在两种胃癌细胞的胞浆和胞膜均有表达,而在成纤维细胞中无表达.克隆的MUC4启动子片段在SGC-7901和NUGC4细胞中具有强转录活性,转录活性高于强启动子SV40,而NIH3T3成纤维细胞系中几乎无转录活性.MUC4启动子驱动下的HSV-TK重组腺病毒与GCV联合能够诱导SGC-7901和NUGC4胃癌细胞凋亡,产生特异性靶向细胞毒作用.结论:人MUC4启动子驱动下的HSV-TK重组腺病毒联合GCV对SGC-7901和NUGC4胃癌细胞具有靶向杀伤作用,MUC4启动子可以作为胃癌靶向基因治疗的工具.

CX43腺病毒表达载体的构建及其在人胃癌BGC-823细胞系的表达

目的:构建并鉴定CX43-IRES2-EGFP的重组腺病毒小质粒表达载体,观察其在人胃癌BGC-823细胞系中的表达.方法:将目的基因CX43片段与IRES2-EGFP进行PCR拼接,重组到腺病毒穿梭载体pAd/CMV/V5-DEST上,构建成腺病毒表达载体pAd-CX43-IRES2-EGFP;经酶切后转染293A细胞进行包装,测定滴度;重组病毒转染人胃癌BGC-823细胞后,通过RT-PCR检测耐药基因MDR的变化,Westernblot检测CX43超表达.结果:经测序验证,腺病毒载体pAd-CX43-IRES2-EGFP构建成功.pAd-CX43-IRES2-EGFP病毒的滴度为:2.8×106 ifu/ml.转染人胃癌BGC-823细胞后经Western blot检测到CX43蛋白超表达,耐药基因MDR受到抑制.结论:成功构建腺病毒载体pAd-CX43-IRES2-EGFP高效体外转染表达体系,检测其对人胃癌BGC-823细胞系具有超表达CX43和抑制耐药基因MDR的作用,为CX43基因转染的研究及基于CX43为靶标的基因药物筛选平台的奠定了基础.

Ad-PTEN体外对SGC-7901胃癌细胞生长的抑制作用

目的:探讨腺病毒介导的PTEN基因表达体外对SGC-7901胃癌细胞生长抑制作用及其分子机制.方法:将携有PTEN基因的复制缺陷型腺病毒载体(Ad-PTEN)感染SGC-7901胃癌细胞,用RT-PCR法检测Ad-PTEN在细胞中的表达,光学显微镜及荧光显微镜下观察Ad-PTEN感染细胞前后形态的变化,MTT法检测Ad-PTEN对SGC-7901胃癌细胞生长的抑制作用,用流式细胞术(FCM)检测SGC-7901胃癌细胞凋亡率.RT-PCR分析Bax、Bcl-2、p53、Survivin细胞凋亡相关基因的表达.结果:Ad-PTEN基因组感染SGC-7901胃癌细胞后,RT-PCR结果显示PTEN目的基因能在SGC-7901胃癌细胞中转录,其表达可明显抑制该胃癌细胞的生长,并诱导细胞凋亡.其凋亡机制可能与Bax/Bcl-2比值、p53基因表达上调、Survivin下调有关.结论:重组腺病毒Ad-PTEN具有抑制SGC-7901胃癌细胞生长和诱导细胞凋亡的作用.

反义CⅡTA基因对鼠异位气管移植慢性免疫排斥反应的抑制作用

目的:构建携带鼠MHCⅡ类分子反式激活因子(MHC class Ⅱ molecule transactivator,CⅡTA)反义RNA的腺病毒载体,观察腺病毒介导该基因对小鼠异位气管移植慢件免疫排斥反应的抑制作用.方法:设计鼠CⅡTA mRNA为模板的反义片段,构建可表达反义片段的腺病毒载体(AdEasy-1系统),经HEK293细胞包装产生含反义片段重组腺病毒Ad-asCⅡTA,扩增、纯化.建立小鼠异位气管移植模型,用包装后的腺病毒注射并感染移植体周围,观察其对免疫排斥反应的抑制作用.结果:成功包装出含CⅡTA反义基因的重组腺病毒;重组腺病毒可感染气管移植体,Ad-asCⅡTA感染组移植气管组织炎症反应和纤毛上皮变性坏死等较对照组明显减轻.结论:重组腺病毒表达的小鼠反义CⅡTA基因能通过对MHCⅡ类分子的抑制而抑制异位气管移植的慢性免疫排斥反应.这为气管移植治疗气管肿瘤和气管狭窄等疾病奠定了一定的实验基础.