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应用分子伴侣共表达系统表达结核分枝杆菌编码蛋白
目的 研究共同表达分子伴侣能否提高结核分枝杆菌编码基因的表达效率及被表达蛋白的生物活性.方法 将携带有结核分枝杆菌编码基因的表达质粒Rv3790::pET16b、Rv3791::pET16b与能够同时表达3个分子伴侣DnaK、DnaJ和GrpE的质粒pkJE7共同在大肠埃希菌BL21(DE3)表达,之后对所获得的蛋白通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印记分析(Western Blot)检测蛋白产量,并分析蛋白的活性.以Rv3790::pET16b、Rv3791::pET16b单独在BL21(DE3)内的表达作为对照.结果 与分子伴侣共表达的结核分枝杆菌编码基因相对于目的基因单独表达时获得较多的可溶性蛋白,较少的包涵体和蛋白降解;共表达的蛋白也具有相对较好的活性.结论 共同表达分子伴侣能够提高某些结核分枝杆菌编码蛋白的表达效率和生物活性.
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GRP78的表达与癌症治疗和预后的关系
GRP78作为一种分子伴侣在蛋白质的折叠和转运过程及内质网应激反应中发挥重要作用.它在多种肿瘤组织中呈高表达,反义抑制其表达水平或将GRP78启动子连接自杀基因可用于肿瘤行为和治疗反应的生物标记.抑制GRP78表达可能代表根除残留肿瘤的新方法.而且,对于GRP78在癌细胞表面而不是正常组织的近期研究表明,针对GRP78的定向治疗是可行的.
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人神经蛋白synuclein gamma的原核表达及纯化
synucleins是脊椎动物中高度保守的小分子量蛋白家族,主要在神经元表达,在突触前末梢尤为丰富.SNCG(synuclein gamma; spersyn; breast cancer-specific protein 1)是该家族的第三个成员,在脑中广泛表达,其表达异常与神经退行性病变和细胞恶变都有一定的相关性.它在神经元胞质中广泛分布,可能起到维持神经纤维网络完整性的作用[1].γ-synuclein蛋白的N末端与脑中参与多种信号通路的14-3-3蛋白家族成员有较高的同源性,具有分子伴侣的特性,参与 MAPK途径的调节.为了研究SNCG基因及其表达产物在神经系统中的作用,本研究采用RT-PCR的方法克隆得到SNCG基因的全编码区,在大肠杆菌中表达了全长蛋白,并用亲和层析得到纯化的蛋白.
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精神活性物质对热休克蛋白70表达的影响
热休克蛋白70(Hsp70)是热休克蛋白家族中重要的一类蛋白,广泛存在于原核生物和真核生物中,结构较为保守,主要发挥分子伴侣、抗凋亡以及免疫调节功能.精神活性物质可导致高体温,诱导细胞应激,促进细胞凋亡,在非致死剂量下可使细胞内Hsp70适应性表达增高.本文以吗啡、甲基苯丙胺、酒精、可卡因为例,阐明它们对Hsp70表达的影响和涉及的分子机制,为精神活性物质与Hsp70相关性的研究提供一定参考.
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钙网蛋白的生理及病理生理学作用
钙网蛋白(calreticulin, CRT)是内质网/肌浆网主要的Ca2+结合蛋白,通过协助蛋白质正确折叠和维持细胞Ca2+稳态而参与调节细胞凋亡、黏附、类固醇敏感性基因表达和自身免疫反应等,并与多种人类疾病的发生、发展和预后相关.本文综述钙网蛋白的生理功能及其在心肌肥大与衰竭、血管新生和应激等病理状态下的变化.
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分子伴侣幽门螺杆菌Hsp60与UreB的相互作用分析
目的 检测并分析幽门螺杆菌(Hp)尿素酶β亚基(UreB)与Hsp60之间的相互作用. 方法 克隆Hp 26695的尿素酶β亚基基因(UreB)融合GST标签和Hsp60基因融合His标签,分别在大肠埃希菌中进行异源表达.提取两种蛋白,采用pull-down方法检测两者间的相互作用.利用Modeller 9v2软件,以E.coli的GroEL为基础模建HpHsp60的三维结构,再与已知的UreB结构利用AutoDock 4.2软件进行分子共模拟,分析二者的相互作用面和关键氨基酸. 结果 构建了Hp Hsp60和尿素酶β亚基(UreB)的大肠埃希菌异源表达体系并获得纯化蛋白;Pull-down试验显示部分未融合GST标签的Hsp60出现在GST-UreB的洗脱液中,表明Hsp60与GST-UreB之间存在相互作用;以E.coli的GroEL为基础模建了Hp Hsp60的三维结构,利用docking技术构建UreB与Hp Hsp60的相互作用模型,发现其主要的相互作用面位于Hsp60的α9与UreB的α2之间,其可能形成氢键的关键位点为UreB的α2上的T147氨基酸与Hsp60的α9上的E237、K238. 结论 Hp Hsp60能直接与尿素酶β亚基(UreB)相互作用,Hsp60可能通过这种相互作用在UreB成熟过程中发挥分子伴侣功能.这为阐明Hp尿素酶的组装与成熟机制奠定了基础.
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人抑瘤素M在大肠杆菌中的表达、纯化及其对胆固醇代谢关键基因表达的影响
目的构建人抑瘤素 M(OSM)的原核表达载体,通过表达及纯化获得重组蛋白,为深入研究 OSM 的功能及机制奠定基础。
方法利用 PCR 技术,从质粒 pOTB7-hOSM 中扩增出人OSM 蛋白编码序列,与原核表达载体 pET-16b 连接,构建表达质粒 pET16b-OSM。在 BL21(DE3)工程菌中表达目的蛋白,Western blot 法检测 OSM 蛋白的表达。为提高OSM 的可溶性表达,采用共表达分子伴侣的方法提高其上清产物的表达量。将放大发酵的产物处理后,经镍亲和层析法纯化,获得 OSM 成熟蛋白,SDS-PAGE 电泳分析蛋白纯度。MTT 法检测 OSM 对 A375细胞的抑制活性,实时荧光定量 PCR 试验分析 OSM 对 HepG2细胞中胆固醇代谢相关基因(LDLR、ABCA1、ApoA-I 和 SR-BI)表达的影响。
结果成功构建 pET16b-OSM 原核表达质粒,酶切鉴定和测序分析与预期结果完全一致。在 E. coli BL21(DE3)中实现了目的蛋白的表达,通过共表达分子伴侣质粒 pTf16,进一步提高了可溶性表达的水平。放大发酵产物经镍亲和层析纯化获得 OSM 成熟肽,电泳检测纯度大于98%。MTT 法检测所制备的 OSM 蛋白抑制 A375细胞生长的 EC50为315 ng/ml。mRNA 水平检测证实 OSM 能剂量依赖地上调胆固醇代谢相关的低密度脂蛋白受体和 ABCA1基因的表达。
结论成功构建了 OSM 的原核表达载体,获得了具有生物学活性的目的蛋白,证实了其对胆固醇代谢关键基因转录的影响,为下一步功能及机制研究奠定基础。 -
线粒体细胞色素C氧化酶与肿瘤
线粒体是哺乳动物细胞质中惟一含有遗传物质的细胞器,其基本功能是通过氧化磷酸化,以ATP的形式为细胞提供能量,被称为细胞的"动力工厂".线粒体有自己的基因组,执行着各自的作用;基因组能够单独进行复制、转录及合成蛋白质,同时还受核基因的参与和控制.线粒体编码基因排列紧凑、无间隔区且部分区域存在重叠,游离于线粒体基质中,缺乏组蛋白保护,其损伤修复系统也不完善.因此,任何改变都可能累及到基因序列和编码产物中的重要功能区域,引起相关的疾病.线粒体细胞色素C氧化酶(mt-COX)是线粒体内呼吸链复合物Ⅳ,近年的研究显示,mt-COX与肿瘤的发生相关[1].一、mt-COX的基因结构和蛋白特性mt-COX定位于线粒体内膜,哺乳动物mt-COX由13个亚基组成,由亚基组装成有功能的全酶是一个复杂的过程[2],需要多种分子伴侣和装配因子的协助才能完成.
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沙眼衣原体二硫键异构酶DsbG分子伴侣活性研究
主细胞、变性CS复性及EB感染宿主细胞形成包涵体中的作用.结果 EB与宿主细胞接触前与重组融合蛋白DsbG作用30 min后,吸附宿主细胞的能力较对照组增强,吸附的宿主细胞数量与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);同时,DsbG能大大缩短CS的复性时间;DsbG对37℃热处理的裸EB有保护作用,与对照组比较,感染HeLa229细胞形成包涵体的数量提高32%.结论 重组融合蛋白DsbG可以促进EB的吸附、感染宿主细胞HeLa229和加速CS复性,在EB感染宿主细胞过程中可能有分子伴侣作用.
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自噬对适应性免疫的调控
自噬(autophagy)是一种蛋白降解系统,根据细胞内底物运送到溶酶体腔方式的不同,可分为大自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)、分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA)三种[1].大自噬中,孤立的双层膜结构包裹变性坏死的细胞器,聚集的蛋白质和病原体等成分,形成自噬体( autophagosome).然后与溶酶体膜融合,形成自噬溶酶体(autophagic lysosome),降解所包裹的物质.自噬在固有免疫和适应性免疫调控中发挥重要作用.就适应性免疫而言,自噬在抗原提呈中起着必不可少的作用[2].经典免疫学认为,MHC Ⅰ类分子把内源性抗原提呈给CD8+T细胞,而MHCⅡ类分子把外源性抗原提呈给CD4+T细胞.
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哺乳动物自噬检测技术的研究进展
自噬是细胞内部分细胞器及细胞质与溶酶体结合,进而被降解的过程.自噬包括三种类型:巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬,其中研究广泛的是巨自噬[1].近10年来,自噬在哺乳动物机体发育及内环境平衡的研究领域取得了重大的进展.而关于自噬功能的下调与哺乳动物各种疾病之间密切相关性的研究,使得自噬成为临床疾病治疗中的一个重要靶点[1-2].如何进一步准确地鉴别、观察、定量细胞自噬是哺乳动物自噬研究的基础.现就目前常见自噬检测技术的研究进展及优缺点予以综述.
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细胞自噬在急性肝损伤中的变化及作用
近年来,细胞自噬已成为热点研究领域,而细胞自噬在肝脏疾病中的作用也越来越受到重视,抑制或促进自噬可能成为一个新的治疗靶点,本文就细胞自噬在急性肝损伤中的变化及作用作一综述。
1细胞自噬的概述
细胞自噬(autophagy)是存在于真核细胞内的一种溶酶体依赖的降解途径,形成过程包括膜状结构包裹部分胞质和细胞内需降解的长寿蛋白质、受损的细胞器等形成自噬小体,再与溶酶体融合形成自噬溶酶体,降解其所包裹的内容物,产生的氨基酸、脂肪酸、核糖酸等降解产物再被细胞重新利用[1,2]。在自噬发生过程中,Ⅰ型微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein light chain 3, LC3)脂酰化形成Ⅱ型LC3并聚集到自噬小体膜上[9],当自噬小体和溶酶体融合形成自噬溶酶体后,LC3-Ⅱ就会去脂酰化又转变成LC3-Ⅰ释放到胞质中,因此可知LC3-Ⅱ可在一定程度上反映出自噬的变化。根据底物转运到溶酶体途径的不同,细胞自噬可分为3种类型:巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬,通常说的自噬泛指巨自噬,本文若无特殊说明均指巨自噬。 -
抗增殖蛋白在肝脏疾病中的研究进展
抗增殖蛋白(Prohibitin ,抑制素)是一种高度保守的蛋白质,广泛分布于细菌、酵母、原虫、植物和哺乳动物等真核生物细胞中,具有高度的同源性.人抗增殖蛋白基因(phb )位于人染色体17q21 ,编码分子量为32 kD 的抗增殖蛋白.抗增殖蛋白作为重要的细胞膜蛋白超家族成员之一,主要存在于线粒体内膜上,发挥着分子伴侣的作用,目前抗增殖蛋白为确定的功能是作为分子伴侣参与稳定细胞线粒体蛋白.
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血红素加氧酶-1对烟草烟雾提取物诱导健康人支气管上皮细胞凋亡的作用
COPD是严重危害人类健康的常见疾病,其主要的病理特征为气流受限不完全可逆并呈进行性发展.烟草中含有4000多种化学物质,是导致COPD的主要元凶之一.我们在前期的研究中发现,过度的内质网应激可启动细胞凋亡[1].分子伴侣葡萄糖调节蛋白78 (glucose regulated protein,GRP78)与生长停滞DNA损伤可诱导基因153( C/EBP homologous protein/growth arrest-and DNA damage-inducible gene 153,CHOP/GADD153)表达显著增多是发生内质网应激的2个经典标志物[2-3].内质网应激时,CHOP是由抵抗细胞凋亡向促进细胞凋亡转换的重要信号分子[3-4].血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)是广泛存在的抗氧化酶,具有抗炎、抗氧化、抗凋亡和抗增生的细胞保护效应.
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热休克蛋白27抗细胞凋亡的分子机制
热休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)是存在于细胞内的一种主要分子伴侣,在生理和应激条件下均能表达.它们是在结构上拥有高度保守晶体蛋白序列的一组多肽,按分子量可以分为HSP100、HSP90、 HSP70、HSP60和分子量为20 000~30 000的小分子量HSPs(small HSPs,sHSPs)、泛肽等几个亚家族.HSP25/27(啮齿动物25 000, 人类27 000)是sHSPs亚家族中的重要一员, 参与调节细胞的增殖、分化和细胞凋亡的信号转导等,具有重要的生物学功能.
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大鼠脑缺血再灌注损伤中星形胶质细胞活化与热休克蛋白70表达上调的关系
业已证实,脑缺血性损伤可诱导热休克蛋白70(HSP 70)的表达上调.HSP70作为分子伴侣参与了细胞修复过程,在脑缺血损伤中具有神经保护作用.清楚,有待进一步研究.
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细胞外热休克蛋白70与重症中暑关系的研究进展
重症中暑(severe heatstroke)是具有高发病率和高病死率的一种重症疾病,常合并多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS).热休克蛋白(heat stroke protein,HSP)是种系类的保守蛋白,HSP70是HSP家族中的一种,属于分子伴侣类蛋白,发挥阻止应激条件下蛋白错折叠和聚集的功能,保护细胞,阻止脏器功能损害,在重症中暑发病过程中起重要的保护作用[1].基于上述功能,HSP70传统上被认为是细胞内蛋白.然而,近年来的研究发现,正常人体的体循环中也存在HSP70,并且在各种应激条件下会反应性增多,引起了人们对于HSP70细胞外功能的关注[2].本文就细胞外热休克蛋白(extracellular heat strock protein,eHSP)70与重症中暑的关系的研究情况综述如下.
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肝脏移植后的免疫损伤与热休克蛋白的表达
目的探讨肝脏移植后的免疫损伤与几种主要分子伴侣(热休克蛋白)表达状况之间的内在规律.方法 34份移植后肝脏穿刺标本和10份正常肝脏标本,分为A(无排斥反应)组、B(轻/中度急性排斥反应)组、C(重度急性排斥反应)组、D(慢性排斥反应/肝纤维化)组、E(对照)组.进行HSP60、HSP70、HSP90、HO-1等四种分子伴侣免疫组织化学分析和图像分析.结果 B和C组各指标间无统计学差异,A、D、E与B、C组间有统计学差异.HSP60在移植肝脏中表达降低,排斥反应发生时高;HSP70和HSP90在移植肝脏中升高.HO-1肝脏移植后升高.结论不同种类的热休克蛋白依据自身表达的特点对移植后的免疫损伤作出反应,体现了细胞的自我保护机制.
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分子伴侣与心肌保护
分子伴侣(molecular chaperone)是近年来新发现的一类辅助蛋白,能够结合和稳定另外一种蛋白质的不稳定构象,并能通过有控制的结合和释放、促进新生多肽链的折叠、多聚体的装配或降解及细胞器蛋白跨膜转运,对蛋白质的功能完整性有着重要意义.现就分子伴侣与心肌保护的研究进展作一综述.
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雌、孕激素对正常子宫内膜细胞热休克蛋白70、90表达的影响
热休克蛋白(heat shock protein, HSP)作为一种分子伴侣,其表达及变化与细胞的生长、分化,病变的发生、发展等演变过程密切相关.子宫内膜增生过长和子宫内膜癌中HSP 70、90的表达,较正常子宫内膜有明显变化,并且其变化与子宫内膜细胞中雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)表达变化有关[1,2].