卵透明带避孕疫苗研究进展

哺乳动物卵透明带(zona pellucida, ZP)是由卵母细胞及颗粒细胞分泌并覆盖于卵母细胞及着床前受精卵外的一层基质，人和许多动物包括猪、鼠、兔等在内的ZP都是由3～5种糖蛋白组成，称为ZP1、ZP2、ZP3等。ZP蛋白在精卵结合及精子穿透卵透明带中起着非常重要的作用，影响受精过程的成败。ZP蛋白具有很强的抗原性，主动免疫动物可诱发产生抗体，其相应抗ZP抗体与ZP结合能干扰卵子和卵泡细胞间信息交流，使卵子失去与同种精子结合的能力。ZP是一个不影响激素水平的特异性的抗生育阻断位点，国内外已对ZP避孕疫苗进行多层次的研究。随着研究的不断深入，无疑将为人类生殖避孕、鼠类等有害动物不孕控制提供新思路和新途径。本文就ZP疫苗近年来的研究进展进行综述。

CRISP1在性腺中的定位和表达及其生殖调节功能的研究进展

富含半胱氨酸分泌蛋白1 (CRISP1)已被证实参与了受精过程中的多个步骤,其在性腺中的定位及表达因物种不同而异.CRISP1有两种不同的形式,分别以不同的机制与精子结合进而参与了精子获能、精子-透明带结合及精卵融合的调控,还有研究发现CRISP1可能成为无精症诊断的标志物.目前CRISP1已成为避孕干预领域中具有前景的靶点.现就CRISP1在人及不同动物性腺中的定位、表达及其生殖调节功能的相关研究进展进行综述.

嵌合的βhCG-CTP免疫原性的研究

目的 通过分子改进提高βhCG-CTP避孕疫苗的免疫原性.方法 根据分子设计及免疫识别原理,利用蛋白质固相合成技术人工合成一小分子表位嵌合多肽,内含βhCG-CTP上的两个B细胞表位(β8、β9)以及一个源自麻疹病毒融合蛋白的T细胞表位,以此多肽免疫家兔,以WHO的βhCG-CTP疫苗标准品为对照,用ELISA测定所产生的抗体滴度,比较两者的免疫原性.结果 该嵌合多肽免疫家兔后产生的抗体滴度显著高于WHO βhCG-CTP疫苗标准品,且能与天然hCG结合.结论 人工合成的表位嵌合多肽免疫原性较βhCG-CTP明显提高,而多肽分子的抗原性未受影响,免疫家兔后诱生的抗体与天然hCG结合力强,引入T细胞表位能提高小分子多肽的免疫原性,表明通过分子改进可提高避孕疫苗的免疫原性.

C3d3-hCGβ融合蛋白免疫BALB/c小鼠增强抗hCG-β TH2型体液免疫效应

目的通过分子佐剂C3d3增强hCGβ避孕疫苗的免疫原性并实现免疫效应向TH2型体液免疫偏倚.方法在CHO细胞中表达、纯化hCGβ、C3d3和hCGβ-C3d3融合蛋白.分别用hCGβ-C3d3融合蛋白、单用hCGβ、hCGβ联合C3d3和hCGβ加用弗氏完全佐剂免疫BALB/c小鼠,共免疫2次,间隔4周.ELISA测定血清中抗hCGβ抗体滴度.末次免疫后3周处死小鼠制备单个脾细胞悬液,体外用hCG刺激培养48 h,ELISA检测上清中TH1型(IFN-γ、IL-2)和TH2型(IL-4、IL-10)细胞因子分泌水平.结果 C3d3使hCGβ的免疫原性增强了1995倍,C3d3的佐剂能力是弗氏完全佐剂的10倍(初次免疫)～32倍(再次免疫).借助C3d3分子佐剂,hCGβ-C3d3融合蛋白可产生很明显的TH2型体液免疫优势效应.结论分子佐剂C3d3可以大幅增强hCGβ避孕疫苗的免疫原性,使免疫效应向TH2型体液免疫偏倚.

21世纪性医学的展望(一、二)

人们生活水平不断提高,生命科学技术的不断发展和完善,展望21世纪,男科学领域将不断地取得突破.一、男性生育调节1.男性计划生育:以生殖健康为宗旨,更加简便可靠,可逆及副作用少的男性节育装置,长效激素避孕药和避孕疫苗的研制将会取得突破.

透明带避孕疫苗抗原的研究

发展透明带(ZP)避孕疫苗是生育调控的理想策略,但天然ZP来源有限,且ZP免疫容易导致自身免疫反应,这都成为发展ZP避孕疫苗中的严重障碍.基因重组解决了ZP来源的问题,通过ZP糖蛋白的表位研究,正在逐步解决ZP免疫的安全性问题.归纳出ZP避孕疫苗的抗原从天然ZP糖蛋白、基因重组ZP蛋白、ZP表位肽段抗原的发展方向,而探寻以ZP的精子受体相关的B细胞表位为基础的嵌合肽抗原为成发展ZP避孕疫苗的主流.

012抗组合帽猴ZP1和ZP3糖蛋白表位嵌合肽抗体能体外抑制人精-卵结合

透明带(ZP)糖蛋白的组织特异性和在哺乳动物受精期间至关重要的作用,因而一直是研制避孕疫苗潜在的候选抗原.但用ZP蛋白主动免疫实现的避孕效果总是出现卵巢功能障碍问题,因此近年来许多研究开始尝试用ZP合成肽作为免疫原,以克服对卵巢严重的副反应.但是已有研究表明仅含单一表位的ZP3合成肽疫苗,其避孕效果都是不完全的.

抗hCG疫苗在肿瘤免疫治疗中的价值

人绒毛膜促性腺激素(hCG)是妊娠妇女合体滋养细胞合成并分泌的一种由a和β亚基组成的异源二聚体糖蛋白,因其化学结构、物理性质和生物活性基团基本清楚,近20多年来一直是避孕疫苗发展的首选靶标[1,2].

分子佐剂C3d3增强hCGβ蛋白疫苗的体液免疫效应

目的:通过分子佐剂C3d3增强hCGβ避孕疫苗的免疫原性.方法:采用分子生物学技术以phCMV1为载体分别构建分泌型、带有6个组氨酸纯化标签的真核表达载体phCMV1-6His-hCGβ-C3d3和phCMV1-6His-hCGβ,在CHO细胞中获得重组蛋白的稳定、高效表达并用镍柱和凝胶过滤层析对其进行分离、纯化.分别用hCGβ-C3d3融合蛋白、hCGβ联合C3d3和单用hCGβ对BALB/c与C57BL/6小鼠进行免疫,共免疫两次,间隔4周,ELISA测定血清中的抗体滴度,比较各组的免疫效果.结果:无论是BALB/c小鼠还是C57BL/6小鼠,hCGβ-C3d3融合蛋白诱导产生的抗hCGβ抗体的出现时间都明显早于hCGβ与C3d3联合免疫和hCGβ单独免疫组.在BALB/c小鼠,初次和再次免疫结果显示,C3d3使hCGβ的免疫原性增强了1 995倍.C57BL/6小鼠所显示出的体液免疫反应强度虽不如BALB/c小鼠,但C3d3也使hCGβ的免疫原性增强了1 259倍.结论:通过分子佐剂C3d3可以大幅地提高hCGβ避孕疫苗的免疫原性,在个性差异很大的不同品系小鼠,C3d3均能增强机体对hCGβ的体液免疫应答能力.

猪卵透明带3α重组腺病毒的构建及纯化

目的 构建猪卵透明带3α(pZP3α)重组腺病毒,并包装与纯化病毒,为研究猪ZP3α重组腺病毒避孕疫苗奠定基础.方法 将pZP3α基因克隆至穿梭质粒pShuttle,重组穿梭质粒pSshuttle-pZP3α再与腺病毒骨架质粒pAdEasy-5共转化大肠杆菌BJ5183,筛选重组腺病毒质粒pAd-pZP3α,脂质体法转染HEK293A细胞,包装并扩增病毒至第4代.收集重组病毒颗粒,经两轮氯化铯密度梯度离心纯化,紫外吸收法测定总病毒颗粒数(VP),并计算病毒的颗粒性滴度,空斑形成试验测定病毒的感染性滴度.以MOI为10的病毒剂茸感染HeLa细胞,PCR鉴定插入病毒的目的 基因,斑点免疫印迹法鉴定目的 蛋白的表达.结果 DZP3α基因成功插入病毒基因组,pZP3α蛋白能在病毒感染的HeLa细胞中正常表达.病毒的颗粒性滴度约为1.3×1011 VP/ml,感染性滴度约为3×109 PFU/ml.结论 已成功构建猪ZP3α重组腺病毒质粒pAd-pZP3α,包装并纯化了重组pZP3α腺病毒颗粒.

避孕疫苗的研究进展

本文对近年来倍受关注的抗激素、抗卵细胞透明带和抗精子疫苗的安全性、有效性及作用机理的研究进展作一综述.

021 利用多种合成载体配以已准许的佐剂来增强避孕疫苗的免疫原性

重组人卵透明带蛋白及其多克隆抗体对精子-透明带结合的影响

为了探讨毕赤酵母表达的重组人卵透明带ZP3蛋白(recombinant human zona pellucida-3 protein,rhZP3)及其多克隆抗体对小鼠和人精卵结合的影响,采用不同浓度的rhZP3以及空白培养液分别处理小鼠精子,然后再与小鼠卵子进行结合实验,观察经过不同处理的精子对透明带黏附及体外受精率的影响;用rhZP3以及空白培养液分别处理人精子,然后再与人卵子进行结合实验,观察经过不同处理的精子对透明带黏附的影响;用抗rhZP3抗体与阴性血清分别处理小鼠和人卵子,再与精子进行结合实验,观察多克隆抗体对精子粘附以及小鼠体外受精率的影响.实验结果表明,rhZP3和抗rhZP3多克隆抗体既能抑制人的体外精卵结合,也能抑制小鼠体外精卵结合,提示rhZP3具有天然透明带的特性,有发展成避孕疫苗和作为检测透明带抗体检测试剂的可能.

不同人群血清中抗透明带抗体的检测

为了探讨抗透明带抗体的临床意义,本研究用纯化的猪卵透明带ZP3抗原制备抗卵透明带抗体酶联免疫检测试剂盒,采用ELISA方法检测不同人群血中抗透明带抗体,并用阳性血清与人卵巢组织切片进行免疫组化分析.结果显示不同年龄组妇女抗透明带抗体阳性率差异不显著(P＞0.05),不孕组阳性率15%,与其他组相比有显著性差异(P＜0.05).ELISA检测到的透明带抗体阳性血清不与人卵巢组织切片中的透明带产生肉眼可见的沉淀反应.除了早孕组和老龄妇女,任何年龄阶段的女性均可出现抗透明带自身抗体,鉴于这些抗体不引起周期紊乱现象,却可能阻止受精,这为透明带作为避孕疫苗候选抗原的安全提供理论依据.

表达鼠精子Cyritestin蛋白的重组沙门氏菌疫苗株的免疫性避孕效应研究

目的为观察沙门氏菌疫苗株诱导雌鼠免疫性避孕效应.方法应用表达鼠精子抗原cyritestin的两种重组沙门氏菌疫苗株X4632(pCFL)、X4550(pCFL)口服免疫雌鼠,通过ELISA方法检测其激发雌鼠产生抗重组Cyritestin蛋白和抗菌体LPS(脂多糖)的血清IgG抗体和阴道分泌物IgA抗体滴度变化.结果发现:两种重组疫苗株不但可激发雌鼠产生高水平血清抗重组Cyritestin蛋白和抗菌体LPSIgG抗体,而且在阴道分泌物中可出现相应IgA抗体.同时,口服免疫后雌鼠生育能力明显降低,两实验组雌鼠妊娠率降低30%～40%,一胎产仔数量平均降低66.96%～70.48%.结论表达精子Cyritestin蛋白的重组沙门氏菌疫苗株可诱导有效的免疫性避孕效应,值得深入研究.

精子表面蛋白受精素β在精卵结合和融合中的作用研究

为探讨精子表面蛋白受精索β(Fβ)在精-卵结合和融合中的作用.本文应用鼠Fβ单抗,通过体外受精试验观察该单抗预孵育不同浓度精子后,对精-卵结合和融合功能的影响;应用免疫细胞化学方法确定Fβ在精子表面的特异性定位.结果在不同精子浓度下,Fβ单抗均可显著降低体外精-卵的结合和融合能力;可使精-卵结合指数降低34.43%～75.46%,平均56.05%;使精-卵融合的受精指数降低47.68%～56.32%,平均52.18%;受精率下降28.06%～54.32%,平均41.56%.在精子顶体反应前后,Fβ在精子表面均特异性定位于精子头部赤道区域和顶体内膜区域.结论:Fβ在精-卵的结合和融合中均具有重要作用,支持将Fβ蛋白作为精子靶抗原之一用于避孕疫苗的开发研究.

男性免疫避孕的研究进展

男性免疫避孕的理想目标是研制出一种安全、有效、可逆、使用方便、易于接受的避孕疫苗.目前的研究主要是从生殖激素和精子功能蛋白中筛选为合适的靶抗原用于免疫避孕疫苗的开发.以生殖激素作为靶抗原的避孕疫苗由于其不同程度的不良反应和操作的繁琐性,并没有得到广泛推广.近年来的研究表明,以精子特异性抗原为靶抗原开发男性免疫避孕疫苗具有现实性和可行性.然而,该免疫避孕疫苗的开发也面临着很多挑战,如何筛选合适的靶抗原、提高疫苗的免疫原性、合适的免疫方式、降低疫苗的不良反应及成本等都是要解决的重要问题.

精子特异性乳酸脱氢酶-C4的研究进展

LDH-C4是避孕疫苗研制中有特征性的精子特异性抗原之一.LDH-C基因在生精细胞激活而在体细胞受抑制,存在LDH-C启动子、多种转录因子、CpG岛甲基化等多种因素在转录水平上发挥基因调节作用.针对LDH-C4的高水平抗体能有效阻断受精,而天然LDH-C4经过化学修饰后显示高度免疫原性,能诱导同种异体免疫性不孕.另外在男性避孕疫苗和合成的抗原肽取代天然同工酶的研制中也取得了进展.

精子膜抗原的研究新进展

精子表面的膜抗原是精子发生成熟过程中的重要标志分子,对其深入研究有助于揭示精子发生成熟及受精过程的生理机制和不育的病理改变.本文回顾了近年来随着分子生物学技术的广泛应用,传统的一些重要的精子膜抗原相继得到了克隆和测序,一些新的表达精子膜抗原的基因也陆续被发现,为从蛋白水平进一步深入研究其功能以及免疫避孕疫苗的筛选奠定了基础.

小鼠口服猪卵透明带DNA避孕疫苗pVAX1-pZP3α的抗生育研究

目的:评价口服卵透明带DNA避孕疫苗pVAX1-pZP3α壳聚糖纳米微粒诱发的黏膜免疫反应、抗生育作用和对卵巢结构的影响,探讨用黏膜免疫避免卵透明带抗原免疫引起卵巢功能紊乱的可行性.方法:制备pVAX1-pZP3α壳聚糖纳米微粒,10只昆明系小鼠口服免疫,第3周和第6周分别加强免疫一次,剂量为0.5 mL/只,含pVAX1-pZP3αDNA 50μg;对照组10只雌小鼠口服相同剂量不含pVAX1-pZP3α的壳聚糖.免疫前和免疫后隔周取小鼠血清、阴道冲洗液,用ELISA法检测抗pZP3 IgA和IgG.首次免疫后第12周雌雄合笼交配,统计雌鼠怀孕情况;解剖取出双侧卵巢,制作石蜡切片,光镜观察卵巢病理学变化.结果:免疫组80%小鼠的血清和50%小鼠的阴道冲洗液可检测到抗pZP3 IgA,反应强度与持续时间有明显的个体差异;免疫组5只小鼠未怀孕,对照组全部怀孕,抗生育效果与合笼时抗pZP3 IgA反应有关;免疫组未怀孕小鼠卵巢组织结构与免疫组怀孕小鼠及对照组小鼠无差别.结论:口服pVAX1-pZP3α壳聚糖纳米微粒免疫小鼠能诱发生殖道黏膜免疫反应,发挥抗生育作用,对卵巢组织结构没有影响.黏膜免疫是克服卵透明带抗原免疫引起卵巢功能紊乱的一种值得深入研究的方法.