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C3d3与hCGβ基因融合质粒对不同品系小鼠DNA免疫增强抗hCGβ体液免疫效应
目的 通过分子佐剂C3d3增强人绒毛膜促性腺激素(hCG)β基因疫苗在不同品系小鼠的体液免疫效应. 方法 分别用pCMV4-hCGβ-C3d3、pCMV4-hCGβ和pCMV4-hCGβ+pCMV4-C3d3联合免疫以辅助性T细胞(Th)2型优势的BALB/c小鼠和Th1型优势的C57BL/6小鼠,免疫剂量分别为5、10、50、100和500 pmol,同一剂量免疫两次、间隔3周.初次及加强免疫后每周采血,间接酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清抗hCGβ抗体水平.硫氰酸钠洗脱法ELISA分析抗hCGβ抗血清亲和力. 结果 两种品系小鼠pCMV4-hCGβ-C3d3免疫产生抗hCGβ抗体的时间和效价均显著早(高)于pCMV4-hCGβ和联合免疫组.在50 pmol免疫剂量时,C3d3在两种品系小鼠呈现出强的佐剂活性,分别使hCGβ的免疫原性增强了400倍(BALB/c)和251倍(C57BL/6). pCMV4-hCGβ-C3d3组两个品系小鼠亲和力成熟较快. 结论 在Th2型及Th1型免疫优势的不同品系小鼠,分子佐剂C3d3均能增强hCGβ基因疫苗体液免疫效应.
关键词： 分子佐剂 C3d3 人绒毛膜促性腺激素β 基因疫苗 体液免疫 -
phCMV1和pcDNA3表达人绒毛膜促性腺激素β-C3d3融合蛋白的表达效率比较
目的比较真核表达载体phCMV1和pcDNA3在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达人绒毛膜促性腺激素β(hCGβ)-C3d3融合蛋白的表达效率,以获得hCGβ-C3d3融合蛋白的高效表达.方法利用高效真核表达载体phCMV1, 构建带有6个组氨酸纯化标签的融合蛋白表达质粒phCMV1-6His-hCGβ-C3d3;脂质体法介导phCMV1-6His-hCGβ-C3d3和pcDNA3-hCGβ-C3d3转染CHO细胞,G418 (800 μg/ml)筛选抗性克隆,G418 (300 μg/ml)维持培养、扩增,待阳性克隆95%汇片时换用无血清培养基培养.放射免疫法检测hCGβ表达量,Western blot鉴定表达产物,Raji细胞免疫化学染色法鉴定hCGβ与C3d分子的成功融合.反复冻存和复苏高效表达hCGβ-C3d3融合蛋白的阳性克隆,比较表达效率的变化.用镍柱和凝胶过滤层析纯化表达产物. 结果酶切鉴定及测序证实phCMV1-6His-hCGβ-C3d3构建正确,并成功地在CHO细胞中获得了6His-hCGβ-C3d3融合蛋白的表达.无血清培液中24、48、72 h融合蛋白的表达量分别为496、527、633 mIU/ml/1×106细胞(以hCGβ含量计算),phCMV1比pcDNA3载体的表达效率高1.4倍.3次冻存和复苏高效表达hCGβ-C3d3融合蛋白的阳性克隆,表达效率无明显变化.表达产物经纯化后获得了所需的hCGβ-C3d3融合蛋白. 结论 phCMV1表达hCGβ-C3d3融合蛋白的效率高于pcDNA3;用6His纯化标签可以成功纯化获得hCGβ-C3d3融合蛋白.
关键词： phCMV1 pcDNA3 人绒毛膜促性腺激素β C3d3 蛋白表达 -
C3d3-hCGβ融合蛋白免疫BALB/c小鼠增强抗hCG-β TH2型体液免疫效应
目的通过分子佐剂C3d3增强hCGβ避孕疫苗的免疫原性并实现免疫效应向TH2型体液免疫偏倚.方法在CHO细胞中表达、纯化hCGβ、C3d3和hCGβ-C3d3融合蛋白.分别用hCGβ-C3d3融合蛋白、单用hCGβ、hCGβ联合C3d3和hCGβ加用弗氏完全佐剂免疫BALB/c小鼠,共免疫2次,间隔4周.ELISA测定血清中抗hCGβ抗体滴度.末次免疫后3周处死小鼠制备单个脾细胞悬液,体外用hCG刺激培养48 h,ELISA检测上清中TH1型(IFN-γ、IL-2)和TH2型(IL-4、IL-10)细胞因子分泌水平.结果 C3d3使hCGβ的免疫原性增强了1995倍,C3d3的佐剂能力是弗氏完全佐剂的10倍(初次免疫)～32倍(再次免疫).借助C3d3分子佐剂,hCGβ-C3d3融合蛋白可产生很明显的TH2型体液免疫优势效应.结论分子佐剂C3d3可以大幅增强hCGβ避孕疫苗的免疫原性,使免疫效应向TH2型体液免疫偏倚.
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分子佐剂C3d3增强hCGβ蛋白疫苗的体液免疫效应
目的:通过分子佐剂C3d3增强hCGβ避孕疫苗的免疫原性.方法:采用分子生物学技术以phCMV1为载体分别构建分泌型、带有6个组氨酸纯化标签的真核表达载体phCMV1-6His-hCGβ-C3d3和phCMV1-6His-hCGβ,在CHO细胞中获得重组蛋白的稳定、高效表达并用镍柱和凝胶过滤层析对其进行分离、纯化.分别用hCGβ-C3d3融合蛋白、hCGβ联合C3d3和单用hCGβ对BALB/c与C57BL/6小鼠进行免疫,共免疫两次,间隔4周,ELISA测定血清中的抗体滴度,比较各组的免疫效果.结果:无论是BALB/c小鼠还是C57BL/6小鼠,hCGβ-C3d3融合蛋白诱导产生的抗hCGβ抗体的出现时间都明显早于hCGβ与C3d3联合免疫和hCGβ单独免疫组.在BALB/c小鼠,初次和再次免疫结果显示,C3d3使hCGβ的免疫原性增强了1 995倍.C57BL/6小鼠所显示出的体液免疫反应强度虽不如BALB/c小鼠,但C3d3也使hCGβ的免疫原性增强了1 259倍.结论:通过分子佐剂C3d3可以大幅地提高hCGβ避孕疫苗的免疫原性,在个性差异很大的不同品系小鼠,C3d3均能增强机体对hCGβ的体液免疫应答能力.
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重组乳酸杆菌Lb.hCGβ-C3d3经鼻腔免疫BALB/c小鼠的抗生育潜能
目的:探讨表达hCGβ-C3d3融合蛋白的重组乳酸杆菌避孕疫苗经鼻腔黏膜接种BALB/c小鼠及其抗生育潜能.方法:用野生型乳酸杆菌Lb.及重组乳酸杆菌Lb.hCGβ和Lb.hCGβ-C3d3 以两种剂量(109个和1010个)经鼻腔滴注接种6～8周龄雌性BALB/c小鼠.3周后用相同剂量加强免疫一次.于初次免疫后的第6、7、8周收集血清,分别培养MLTC-1、BeWo细胞;化学发光法检测培养上清中孕酮或hCGβ水平;免疫荧光观察抗血清处理后BeWo细胞的融合情况.结果:用1010个Lb.hCGβ-C3d3滴鼻免疫BALB/c小鼠产生的抗血清能显著抑制hCG刺激MLTC-1分泌孕酮,明显抑制BeWo细胞分泌hCGβ及细胞融合.结论:重组乳酸杆菌活疫苗Lb.hCGβ-C3d3经鼻腔接种诱导的hCGβ抗体可拮抗hCGβ生物学功能,并干扰滋养细胞功能,因此具有抗生育潜能.
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hCGβ-C3d融合蛋白在CHO细胞中的表达
为了提高hCGβ的免疫原性,构建含新型分子佐剂C3d的hCGβ真核细胞表达质粒pcDNA3-hCGβ-C3d3,使其转染稳定表达系统中国仓鼠卵细胞(CHO)后,检测融合蛋白分泌情况.CHO细胞转染了pcDNA3-hCGβ-C3d3质粒后,经48 h培养,1.0×106个CHO细胞可分泌660 ng的重组融合hCGβ-C3d3蛋白.细胞免疫化学技术分析显示,表达产物既有hCGβ的组分也有C3d的成分.经SDS-PAGE及免疫印迹试验发现CHO细胞培养上清液中含有三组蛋白成分,其相对分子质量分别为120 000、90000和65 000.利用新型分子佐剂C3d与hCGβ的连接,构建了pcDNA3-hCGβ-C3d3真核细胞表达质粒,为提高hCGβDNA免疫避孕疫苗的免疫原性及抗生育作用奠定了基础.
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HPV16 E6E7与C3d3 融合基因真核表达质粒的构建及表达
目的 构建可作为DNA疫苗的包含人乳头瘤病毒16型(HPV16)E6E7与C3d3 融合基因真核表达质粒,并在体外进行表达和鉴定.方法 采用PCR 技术扩增HPV16 E6E7片段,将该片段插入到pMDT-18载体中后,亚克隆至真核表达载体pSG.SS.C3d3.YL和pSG.SS.YL,构建E6E7与C3d3 融合基因及E6E7表达质粒pSG.SS.E6E7.C3d3.YL和pSG.SS.E6E7.YL.经限制性酶切鉴定和DNA 序列测定后,将重组质粒pSG.SS.E6E7.C3d3.YL、pSG.SS.E6E7.YL转染COS-7细胞,用Western blot及免疫细胞化学技术检测其表达.结果 经酶切、DNA测序及转染真核细胞后表达产物的鉴定结果显示,重组质粒构建成功.结论 构建的质粒可在真核细胞内正确表达,为其作为DNA疫苗诱导免疫效应的动物实验打下了基础.
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FLK1265-2493与C3d3融合基因真核表达质粒的构建及表达
目的构建FLK1265-2493与C3d3融合基因真核表达质粒,并在体外进行表达和鉴定.方法采用PCR技术扩增FLK1265-2493片段,将该片段插入到pMDT-18载体中后,亚克隆至真核表达载体pSG.SS.C3d3.YL,构建FLK1265-2493与C3d3融合基因表达质粒.经限制性酶切鉴定和DNA序列测定结果证实后,将重组质粒pSG.SS.FLK1265-2493.C3d3.YL转染Hela细胞,检测其体外表达.结果免疫印迹和免疫细胞化学分析结果分别表明转染细胞上清液和胞浆内均有目的分子的存在.结论构建的DNA疫苗可在真核细胞内正确表达,这为进一步的动物实验打下了基础.
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真核表达质粒pSG ．SS ．C3d3．YL ．Bin1b雄鼠免疫避孕效应研究
目的：研究小鼠Bin1b真核表达重组质粒pSG ．SS ．C3d3．YL ．Bin1b的DNA疫苗雄鼠免疫避孕效应。方法应用pSG ． SS ．C3d3．YL ．Bin1b（C3d3‐Bin1b组）肌注免疫雄鼠，观察其精子活力及避孕效应，ELISA法检测雄鼠血清抗Bin1b蛋白IgG抗体大稀释度、IL‐2、INF‐γ、IL‐4、IL‐10水平。PBS组、空载体pSG ．SS ．YL组（空载体组）和pSG ．SS ．YL ．Bin1b组（Bin1b组）为对照组。结果 C3d3‐Bin1b组雄鼠精子活力、雌鼠受孕率、平均产仔数量显著降低，免疫避孕效果显著好于Bin1b组。C3d3‐Bin1b组雄鼠血清抗Bin1b蛋白IgG抗体滴度显著升高，血清IL‐2、INF‐γ浓度显著降低，血清IL‐4、IL‐10浓度显著增加。结论真核表达重组质粒pSG ．SS ．C3d3．YL ．Bin1b可有效诱导雄鼠产生免疫性避孕效应，效果优于pSG ．SS ．YL ．Bin1b。
