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HL-60细胞诱导分化过程中STIM1siRNA干扰的电转染研究
目的:以感受器相互作用分子(STIM1)为报告基因优化悬浮培养的二甲基亚砜(DMSO)诱导分化的HL-60细胞的电穿孔转染条件.方法:通过控制电压、电容、电阻、细胞状态等转染条件,采用不同条件组合后用电穿孔法将靶向STIM1的siRNA转入悬浮培养的dHL-60细胞,用荧光显微镜观察转染率,蛋白免疫印记方法检测干扰效率.结果:适当提高电压能提高悬浮培养的dHL-60细胞的转染效率,细胞状态不同干扰效率有所差异,DMSO诱导4d的dHL-60细胞在电压295V、电容1 180μF、电阻500Ω的条件下转入STM1 siRNA系列并得到大干扰效率(约60％).结论:针对dHL-60细胞这种比较特殊的细胞系来说,电穿孔转染法是一种较好的基因转染方法,通过优化其转染条件,可以提高其对dHL-60细胞的SiRNA干扰效率.
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STIM1在KA致痫大鼠大脑皮质内的表达上调
目的 研究基质相互作用分子1 (stromal interaction molecule 1,STIM1)在海人酸(Kainic acid, KA)致痫大鼠大脑皮质中的表达变化,探讨其与癫痫发病的关系及意义.方法 48只成年雄性SD大鼠随机分为正常对照组(NS组)24只和海人酸致痫组(KA组)24只,海人酸致痫组给予侧脑室注射KA 2μg/kg(7μ1左右)制作KA致痫模型,正常对照组给予侧脑室注射等量生理盐水,观察记录各组大鼠癫痫发作的行为学表现,并于癫痫发作后不同时间点(48h、72h)随机取12只大鼠伤侧皮层脑组织,用半定量RT-PCR、Western blot和免疫组织化学技术检测STIM1的mRNA和蛋白的表达.结果 KA致痫组大鼠于造模后5min左右出现典型痫性发作,达Ⅳ～Ⅴ级,持续数小时;海人酸致痫组STIM1 mRNA和蛋白表达水平在各时间点均较对照组显著增高(P＜0.05).结论 STIM1在KA致痫大鼠皮层脑组织中过表达可能参与癫痫的发病机制.
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血小板STIM1蛋白表达水平与急性缺血性脑卒中严重程度及预后的相关性研究
目的 探讨血小板中钙离子感受蛋白基质相互作用因子1(STIM1)蛋白在急性缺血性脑卒中的表达以及其与脑梗死发作严重程度和预后的相关性.方法 回顾性分析本院收治的120例急性缺血性脑梗死患者外周血和相关临床资料,分离外周血中血小板,通过western blotting检测患者血小板内STIM1蛋白含量.使用NIHSS评分标准判断急性缺血性脑卒中患者发病24小时内病情严重程度,并在三个月后对病人进行随访,重新评估病人NIHSS评分以判断患者预后情况.运用统计分析方法分析健康人以及病情严重程度不同的急性脑梗死患者血小板内STIM1蛋白表达含量的差异是否存在统计学意义,并分析其与缺血性中风短期预后的相关性.结果 在患病人群中其平均STIM1蛋白表达量比正常人群表达量有明显升高(P＜0.01).患病严重程度不同的病人之间,其外周血血小板内STIM1蛋白表达量存在差异,并且外周血血小板内STIM1蛋白表达量与病人的患病严重程度存在正相关的关系.结论 血小板STIM1蛋白表达增加提示患者具有更严重的脑卒中,其三个月预后差.这种作用可能是因为血小板内STIM1蛋白含量一定程度反映了体内血小板的活性状态,临床应紧密检测该指标,尽早治疗以防止病情进一步恶化.
关键词： 急性缺血性脑卒中 血小板 钙库操纵的钙内流通道(SOCC) STIM1 -
钙释放激活钙通道研究进展
库操纵的钙(Store Operated Calcium,SOC)进入参与许多重要Ca2+信号生理过程,如细胞分化和凋亡虽然SOC的许多生物物理特性被表述,但研究清楚的是钙释放激活的钙(Ca2+ release-activated Ca2+,CRAC)通道.近通过RNA干扰技术在果蝇和哺乳动物细胞上鉴定出CRAC通道的两个组成蛋白STIM1和Orail细胞静息时,STIM1均匀分布在内质网膜(ER)上.一当钙库耗竭,ER上STIM1会聚集迁移到细胞膜下,相比而言,Orail是一个形成CRAC通道孔的四次跨膜蛋白.有报道说STIM1作为ER上一个Ca2+感受器向细胞膜传导钙库耗竭信号.虽然钙库耗竭激活CRAC通道的过程在近的研究中被定量描述为四个步骤,但还有很多细节仍然不清楚.如STIM1是如何感受钙库耗竭而导致其发生聚集的不清楚,又如STIM1是如何定位到细胞膜下又如何传导信息的不清楚,STIM1和Orai1直接到底是如何相互作用的等都有待进一步的研究.本文对CRAC通道的研究历史和新进展进行了讨论.
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益气活血方联合PI3K抑制剂Wortmannin对血小板聚集率的影响
目的:观察益气活血方联合PI3K抑制剂Wortmannin对大鼠体外血小板聚集率的影响.方法:高剂量、中剂量、低剂量益气活血方(0.2 g·L-1、0.1g·L-1、0.05g·L.1)体外干预血小板,用比浊法检测二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)诱导的血小板聚集水平,用钙离子探针fura-2/AM观察血小板胞内Ca2+变化,用qPCR和Western blot法分别检测钙池调控Ca2+流入通道(store-operated calcium channel,SOCC)成分Orai1和基质交感分子1(stromal interaction moleculel,STIM1) mRNA及蛋白表达水平.结果:与对照组比较,益气活血方中剂量组(0.1 g· L-1)和高剂量组(0.2g·L-1)血小板聚集率显著降低(P＜0.05),益气活血方高剂量组(0.2 g·L-1)血小板胞质内Ca2+浓度显著降低(P＜0.05).益气活血方高剂量组(0.2 g·L-) SOCC通路上STIM1、Orai1的mRNA及蛋白表达水平显著降低(P＜0.01);联合应用PI3K抑制剂Wortmannin能显著抑制血小板聚集率(P＜0.01),抑制作用明显好于单独应用中药或西药.结论:益气活血方联合应用PI3K抑制剂Wortmannin能显著抑制血小板聚集率,其作用与抑制STIM1/Orai1活性有关.
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STIM1、ORAI1在外伤性癫痫大鼠中的表达
目的 研究基质相互作用分子1(stromal interaction molecule 1,STIM1)和钙释放激活钙通道调节分子1(calcium release-activated calcium channel modulator 1,ORAI1/CRACM1)在外伤性癫痫大鼠脑组织皮层中的表达变化,探讨其与外伤性癫痫的关系及其意义.方法 84只成年SD大鼠随机分为对照组(42只)和实验组(42只),制作FeCl3外伤性癫痫模型,实验组予皮层注射100mmol/L FeCl35μL,对照组皮层注射等量生理盐水,观察记录大鼠伤后癫痫发作的行为学表现,伤后不同时间点(6h、24h、72h、7d、14d、21d、28d)随机取6只大鼠伤侧皮层脑组织,用荧光定量PCR、Western blot和免疫组化技术检测STIM1和ORAI1的mRNA和蛋白的表达.结果 实验组伤后出现典型的癫痫发作,制模成功率达84.0％,对照组未见癫痫发作；实验组STIM1、ORAI1的mRNA表达均较对照组显著增高(P＜0.05),72h为表达高峰(P＜0.05)；实验组STIM1、ORAI1在伤后6h的蛋白表达与对照组比较无统计学差异(P＞0.05),此后6个时间点的表达与对照组比较均显著增高(P＜0.05),72h为表达高峰(P＜0.05).结论 STIM1、ORAI1在外伤性癫痫大鼠皮层脑组织中表达显著上调,钙释放激活的钙(calcium release-activated calcium,CRAC)通道可能与外伤后癫痫的形成有关.
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丁酸钠对人结肠癌细胞株HCT-116细胞凋亡及基质相互作用分子和Orai1蛋白活性的影响
目的 研究丁酸钠诱导结肠癌细胞株HCT-116细胞凋亡机制.方法 hoechst 33342和AnnexinV+PI检测丁酸钠诱导结肠癌细胞HCT-116的凋亡作用；免疫荧光法检测丁酸钠对基质相互作用分子(STIM1)和钙离子通道Orai1蛋白在细胞内定位的影响；免疫印迹法检测STIM1和Orai1蛋白表达量的变化.结果 丁酸钠可诱导结肠癌细胞HCT-116凋亡、STIM1移位并与Orai1具有共定位现象.结论 丁酸钠可通过调节STIM1和Orai在结肠癌细胞中的定位而促发细胞凋亡.
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高低转移性乳腺癌细胞STIM1表达与钙内流差异比较
目的 探讨基质相互作用分子1(STIM1)在高低转移性的乳腺癌细胞中的表达差异以及对钙库调节钙内流(SOCE)的影响.方法 选取常见的高转移性乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞与低转移性乳腺癌细胞MCF-7作为细胞模型,用划痕试验检测两种细胞的迁移能力,应用实时荧光定量PCR检测两种细胞中STIM1的mRNA表达,用Western blot检测其蛋白水平,用激光共聚焦显微镜检测两种细胞中SOCE的差异.结果划痕实验结果显示,MCF-7细胞在24 h和48 h的迁移细胞数都明显低于MDA-MB-231细胞24 h与48 h的迁移细胞数(P＜0.01).STIM1 mRNA在MCF-7细胞与MDA-MB-231细胞中的相对表达量分别为1.001 9±0.074 4和6.338 8±1.046 7,差异有统计学意义(P＜0.05).STIM1蛋白在MCF-7细胞与MDA-MB-231细胞中的相对表达量分别为0.530 2±0.177 8和1.296 8±0.075 8,差异有统计学意义(P＜0.01).MCF-7与MDA-MB-231细胞中SOCE引起的外钙内流相对比例分别为1.036 3±0.413 5和4.145 8±1.045 0,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 高转移性乳腺癌细胞中存在STIM1高表达和钙内流增高,这可能是其实现高转移性的机制之一.
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钙池操纵钙通道STIM1和ORAI1在ⅢA 期非小细胞肺癌中的表达
目的:研究ⅢA 期非小细胞肺癌(NSCLC)患者手术肿瘤组织中STIM1 或ORAI1 蛋白表达和生存预后的关系.方法:应用S-P 免疫组化方法检测70 例ⅢA 期NSCLC 患者手术肿瘤组织STIM1 和ORAI1蛋白表达,统计学分析其与患者无疾病生存预后的关系.结果:男性NSCLC 患者中,STIM1 低表达者预后有好于高表达者的趋势(21 个月vs 12 个月,P ＝ 0.06).鳞癌NSCLC 患者中,STIM1 低表达者预后有好于高表达者的趋势(33 个月vs 9 个月,P ＝ 0.07).结论:在鳞癌和男性ⅢA 期NSCLC 患者中,STIM1 低表达可能预示着患者有较好的无疾病生存预后.
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STIM1对乳腺癌细胞移动的作用及机制
目的:研究STIM1在乳腺癌细胞移动中的作用及分子机制.方法:Western blot检测STIM1 SiRNA序列干扰效率;Transwell检测沉默STIM1的表达及SOCE钙信号对细胞迁移的影响;钙图分析STIM1与SOCE钙信号的关系;Western blot检测分析沉默STIM1对FAK表达及激活的影响.结果:沉默STIM1表达抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞的迁移;MDA-MB-231细胞中存在STIM1介导的SOCE;阻断SOCE抑制乳腺癌细胞的迁移;沉默STIM1不影响MDA-MB-231细胞的FAK表达及FAK的激活.结论:在乳腺癌细胞中,STIM1通过SOCE调控细胞内钙信号而影响细胞移动,然而,STIM1调控乳腺癌细胞移动与FAK的表达或激活无关.
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STIM1在幼年和成年大鼠外伤性癫痫中的表达
目的 探讨钙释放激活钙离子通道(calcium release-activated calcium,CRAG)关键蛋白STIM1在幼年和成年大鼠外伤性癫痫中的表达差异及意义.方法 取SD雄性幼年、成年大鼠各94只,按照完全随机设计分为成年、幼年假手术组:皮层注射生理盐水,各42只；成年、幼年模型组:铁离子皮层注射外伤性癫痫模型,各52只.建模后观察大鼠癫痫行为学表现；分别于6、24、72 h,7、14、21、28 d7个时相点完全随机选取6只大鼠,处死取伤灶周边皮层脑组织,用实时荧光定量PCR、Western blot和免疫组织化学法分别检测STIM1的mRNA与蛋白的表达.结果 模型组成年、幼年大鼠均出现典型痫性发作,幼鼠模型组建模成功率为91.3％,成鼠模型组建模成功率为84％(定义Racine评分3分及以上为建模成功).幼鼠模型组比成鼠模型组发作次数明显增多(P＜0.05),每次发作持续时间显著延长(P＜0.05),发作程度较重.建模后各组STIM1的mRNA和蛋白表达都有明显增高,72 h达高峰(P＜0.05),但幼鼠与成鼠相比较,STIM1的mRNA和蛋白在各时间点表达增高的趋势更加显著(P＜0.05).结论幼鼠较成鼠更容易发生外伤性癫痫,STIM1在幼鼠中较成鼠的表达也更高,提示STIM1表达增加、CRAC激活可能是幼鼠更易发生外伤性癫痫的机制之一.
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Orai1和STIM1在姜黄素诱导人肺腺癌A549细胞凋亡中的作用
目的 探讨不同浓度姜黄素诱导人肺腺癌A549细胞凋亡中Orai1和STIM1mRNA水平的改变.方法 A549细胞分别暴露于5、10、15、20、25和30 μmol/L姜黄素12、24和48 h后,应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定细胞增殖活力;将不同浓度姜黄素孵育A549细胞24h后,流式细胞仪检测细胞凋亡率;real-time PCR确定25 μmol/L姜黄素处理24h后,Orai1和STIM1mRNA表达水平.结果 姜黄素对A549细胞的抑制作用呈剂量依赖性和时间依赖性,不同浓度姜黄素处理A549细胞24 h细胞存活率分别为96.5％、95.0％、77.4％、63.9％、57％、39.6％,与对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01).姜黄素处理后,流式细胞仪分析结果显示,细胞凋亡率呈明显剂量依赖关系(P＜0.05或P＜0.01).经姜黄素处理后A549细胞Orai1和STIM1mRNA表达量均明显低于对照组(P＜0.01).结论 姜黄素可能引起A549细胞Orai1和STIM1mRNA表达水平发生改变,通过下调Orai1和STIM1mRNA表达量引起细胞凋亡.
关键词： ORAI1 STIM1 人肺腺癌A549细胞 细胞凋亡 姜黄素 -
STIM1在宫颈癌中的表达及与VEGF的相关性
目的:探讨基质相互作用分子1(stromal interaction molecule 1,STIM1)在宫颈癌中的表达及其与VEGF的相关性.方法:收集20例宫颈癌患者的癌变及其正常上皮组织并测量对应肿瘤体积,采用免疫印迹法检测STIM1在各病变组织中的相对表达量,分析STIM1与肿瘤病变程度的相关性;酶联免疫ELISA方法测定过表达STIM1的癌细胞中血管内皮生长因子(VEGF)的分泌量并分析其与STIM1的相关性.结果:70%的宫颈癌组织中STIM1的表达上调,表达量与癌症病变标志物即肿瘤大小相关;STIM1可促进血管内皮因子VEGF的分泌.结论:STIM1在宫颈癌组织中高表达,是宫颈癌病变过程中的一个重要因子.
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钙池操控钙通道在蛛网膜下腔出血后早期脑损伤中的作用
目的 研究钙池操控钙离子通道(SOCC)在蛛网膜下腔出血(SAH)后早期脑损伤中的作用,探讨SOCC与SAH后钙超载致神经元死亡的关系.方法 枕大池单次注血法建立兔SAH模型,使用2-APB干扰SOCC通道活性后建立SAH干预组,Fura-2AM检测胞内钙离子浓度,Western blotting检测SOCC通道蛋白STIM1和ORAI1的表达变化,并与正常对照组、假手术组相比较,TUNEL检测皮层神经元凋亡.结果 SAH后皮层中STIM1和ORAI1蛋白表达均持续升高,在3d时达到高峰,同时皮层神经元胞内钙离子浓度达到峰值.给予SOCC通道阻断剂后,皮层STIM1和ORAI1蛋白表达被抑制,皮层神经元钙内流减低,神经功能评分改善.结论 SAH后神经元的钙超载是造成早期脑损伤的重要原因;抑制SOCC产生的钙内流可缓解神经细胞死亡,改善神经功能.
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SOC可能是防治过敏性紫癜的新靶点
过敏性紫癜(HSP)是一种常见的出血性疾病，近年来发病率逐年升高，部分治疗较困难，尤其是一些顽固性紫癜肾，治疗非常棘手，因此，寻找新的治疗靶点是非常有必要的。细胞内许多生物学过程的实现依赖于Ca2+浓度的改变。 SOC参与机体的多种生理病理过程，并可能对HSP的发生发展起着重要作用。
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STIM1基因在人下咽癌细胞系FaDu中的表达及对细胞凋亡的影响
目的：探索STIM1基因在人下咽癌细胞系FaDu中的表达情况及其表达沉默后对细胞凋亡的影响。方法培养人下咽癌FaDu细胞，根据不同慢病毒感染分2组。 STIM1-siRNA组为经STIM1-siRNA慢病毒感染的下咽癌细胞；对照组为经阴性对照慢病毒感染的下咽癌细胞。 Real-Time PCR法检测STIM1在人下咽癌FaDu细胞中的表达以及siRNA慢病毒感染后STIM1 mRNA水平的表达；Western blot检测siRNA慢病毒感染后STIM1在蛋白水平的表达；流式细胞仪检测STIM1基因沉默后的人下咽癌FaDu细胞的凋亡情况。采用SPSS 17．0软件对数据进行统计学分析。结果以GAPDH为内参（Ct＝12．08±0．05），STIM1在下咽癌细胞系FaDu中表达显著（Ct＝22．21±0．05，P＜0．01）；Real-time PCR结果显示对照组和STIM1-siRNA组人下咽癌FaDu细胞的表达值分别为（1．00±0．08）和（0．12±0．01），2组差异具有统计学意义（P＜0．01）；Western blot 的结果显示，STIM1-siRNA组FaDu细胞中STIM1蛋白明显受抑制，与Real-time PCR结果一致，慢病毒感染成功；流式细胞仪检测结果显示对照组凋亡率为（4．36±1．32）％；实验组凋亡率为（9．81±0．56）％，差异具有统计学意义（P＜0．05）。结论 STIM1基因与人下咽癌FaDu细胞凋亡显著相关，人下咽癌FaDu细胞中，STIM1可能抑制凋亡，可能成为下咽癌诊治的全新切入点。
