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HGF-cMet拮抗剂NK4增强肝癌细胞Li-7对5-FU的敏感性
目的：探索肝细胞生长因子（Hepatocyte growth factor，HGF）对肝癌细胞Li-7增殖及对化疗药物5-FU耐受的影响；研究利用HGF拮抗剂-NK4增强Li-7细胞在HGF存在的情况下对5-FU的敏感性的影响。方法将前期构建的真核细胞表达质粒pcDNA3.1-NK4、pcDNA3.1分别转染至Li-7细胞中。MTT法检测不同浓度（0、0.2、2、20 ng/mL）HGF对Li-7细胞增殖的影响；确证HGF是否会诱导Li-7对5-FU产生耐受；检测在HGF、5-FU的干预下，未转染组、转染pcDNA3.1组、转染pcDNA3.1-NK4组的Li-7细胞生存率的差异。结果在HGF的刺激下，Li-7的存活率没有明显变化（P＞0.05）。但HGF（20 ng/mL）、5-FU（50μg/mL）共同处理与5-FU单独处理相比，细胞存活率明显提升（P＜0.01）。在HGF（20 ng/mL）与不同浓度的5-FU（0、5、50、500μg/mL）的干预下，转染pcDNA3.1-NK4组与转染pcDNA3.1组的Li-7细胞相比细胞生存率都明显降低（P＜0.05）。结论 HGF可以诱导Li-7产生耐药性，而NK4能够减弱HGF对Li-7细胞的刺激，增强5-FU对Li-7的增殖抑制作用。
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含 pCMV-IL-2-IRES-NK4质粒减毒沙门菌的制备及其稳定性研究
目的：制备含 pCMV-IL-2-IRES-NK4质粒减毒沙门菌 TPIN 并检测其稳定性。方法将 pCMV-IL-2-IRES-NK4质粒转进减毒沙门菌 Ty21a 感受态,制备成重组的减毒沙门菌菌株 TPIN；将 TPIN 在含有氨苄西林(+)和氨苄西林(-)的 LB 培养板传代培养至第10代、20代、30代和40代时用灭菌的牙签分别挑取含有氨苄西林(+)和氨苄西林(-)LB 培养基上的单克隆菌落,质粒提取、PCR 扩增酶切鉴定；TPIN 转染 HepG2细胞后采用 RT-PCR 检测IL-2和 NK4基因表达,ELISA 法检测细胞培养上清 IL-2和 NK4蛋白。结果构建菌株经提取质粒、酶切、PCR 扩增获得目的基因 IL-2、NK4特异条带；在氨苄西林(+)和氨苄西林(-)LB 培养板传代培养40代的 TPIN 菌株均可扩增并双酶切出目的基因 IL-2及 NK4；TPIN 体外转染 HepG2细胞后,IL-2及 NK4表达水平均显著升高。结论重组携带IL-2/ NK4双基因的减毒沙门菌菌株 TPIN 可稳定遗传,不受无选择性压力的影响而丢失质粒,且在体外 IL-2、NK4基因及蛋白可以稳定高效表达。
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不同浓度NK4对多种肿瘤细胞侵袭能力的影响
目的研究不同浓度NK4因子对多种肿瘤细胞侵袭能力的影响.方法采用基底膜侵袭实验观察不同浓度NK4因子对人结肠癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞侵袭能力的影响.结果在浓度为10 μg/ml时,NK4因子对人结肠癌细胞、乳腺癌细胞、小鼠黑色素瘤细胞和人卵巢癌细胞侵袭重组基底膜的抑制率为56.4%,56.3%,56.1%和45.0%.结论NK4因子具有抑制人结肠癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞侵袭的能力.
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NK4基因转染对裸鼠卵巢癌腹水瘤生长影响及其机制的探讨
目的 在人卵巢癌细胞SKOV-3中转染NK4cDNA片段,研究NK4在裸鼠体内对人卵巢癌的治疗作用.方法 NK4和荧光霉素(luciferase)表达质粒分别转染人卵巢癌细胞SKOV-3,稳定转染后,得到SKOV-3/NK4细胞和对照(SKOV-3/LUC)细胞.检测NK4在细胞培养基中的表达情况以及经不同培养基(SKOV-3、SKOV-3/LUC和SKOV-3/NK4培养基上清)培养后SKOV-3细胞中c-Met和磷酸化-c-Met的表达,检测三组肿瘤细胞(SKOV-3/LUC和SKOV-3/NK4)体外生长速度,建立裸鼠卵巢癌腹水瘤模型,用Kaplan-Meier方法比较SKOV-3/LUC和SKOV-3/NK4细胞接种形成腹水瘤的裸鼠的累积生存率的差异.结果 在SKOV-3/NK4培养基中有NK4蛋白表达,对照(SKOV-3和SKOV-3/LUC)细胞中无表达.磷酸化-c-Met在SKOV-3/NK4培养基培养的SKOV-3细胞中被抑制,而在对照(SKOV-3和SKOV-3/LUC)细胞培养基培养的SKOV-3细胞中正常表达.c-Met表达在各组差异无统计学意义.三种细胞体外生长曲线比较差异无统计学意义(P＞0.05).腹腔内接种SKOV-3/LUC细胞的裸鼠,均产生腹腔内种植肿瘤伴腹水形成,于50 d内相继死亡,而接种SKOV-3/NK4细胞的裸鼠生存期均大于70 d,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 SKOV-3/NK4细胞在培养基中大量分泌NK4蛋白,NK4能抑制人卵巢癌细胞c-Met受体磷酸化.在裸鼠体内NK4通过抗血管生成作用抑制卵巢癌细胞腹腔内种植瘤的生长和腹水形成,提高累积生存率,改善预后.NK4可作为卵巢癌基因治疗的新方法.
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NK4基因转染对人卵巢癌细胞SKOV-3生物学特性的影响
目的 通过在人卵巢癌细胞SKOV-3中转染NK4基因表达片段,研究NK4对人卵巢癌的治疗作用,从而验证NK4可作为卵巢癌潜在的基因治疗新策略.方法 用NK4和荧光霉素表达质粒分别稳定转染人卵巢癌细胞SKOV-3.用West-ern blot检测细胞培养基中NK4蛋白表达,以及经不同培养基(SKOV-3、SKOV-3/LUC和SKOV-3/NK4培养上清)培养后SKOV-3细胞中c-Met和磷酸化-c-Met的表达.用MTT试剂盒绘制细胞生长曲线.用细胞划痕试验检测NK4对细胞转移的作用.结果 在SKOV-3/NK4培养基中有NK4蛋白表达,对照(SKOV-3,SKOV-3/LUC)细胞中无表达.磷酸化-c-Met在SKOV-3/NK4培养基培养的SKOV-3细胞中被抑制,而在对照(SKOV-3,SKOV-3/LUC)细胞培养基培养的SKOV-3细胞中正常表达.c-Met表达在各组差异无统计学意义.三种细胞体外生长曲线差异无统计学意义(P＞0.05).细胞划痕试验表明SKOV-3/NK4划痕区域的细胞个数明显少于SKOV-3和SKOV-3/LUC细胞.结论 NK4蛋白在SKOV-3/NK4细胞培养基中大量分泌,NK4能抑制人卵巢癌细胞c-Met受体磷酸化,并能抑制卵巢癌细胞体外活动能力,为应用NK4作为卵巢癌基因治疗方法提供了研究基础.
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NK4基因转染对人宫颈癌细胞CaSki生物学特性的影响
目的 通过在人宫颈癌细胞CaSki中转染NK4 cDNA片段,研究NK4对人宫颈癌的潜在治疗作用.方法 将NK4和荧光霉素表达质粒分别稳定转染人宫颈癌细胞CaSki.采用Western blot检测细胞培养基中NK4蛋白以及经不同培养基(CaSki,CaSki/LUC及CaSki/NK4培养上清)培养后CaSki细胞中c-Met和磷酸化c-Met的表达.采用MTT法绘制细胞生长曲线.采用细胞划痕实验检测NK4对细胞转移的作用.结果 在CaSki/NK4培养基中有NK4蛋白表达,对照细胞(CaSki,CaSki/LUC)中无表达.磷酸化c-Met的表达在CaSki/NK4培养基培养的CaSki细胞中被抑制,而在对照细胞(CaSki,CaSki/LUC)培养基培养的CaSki细胞中正常表达.各组c-Met表达无差异.3种细胞体外生长曲线差异无统计学意义(P＞0.05).细胞划痕实验结果表明,CaSki/NK4划痕区域的细胞个数明显少于CaSki和CaSki/LUC.结论 NK4能抑制人宫颈癌细胞c-Met受体磷酸化,并能抑制宫颈癌细胞体外活动能力.
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NK4基因重组慢病毒载体的构建及在肝癌细胞中的表达
目的 构建共表达人NK4基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的重组慢病毒载体,转染人高侵袭转移肝癌细胞LM3(HCCLM3),观察其转染效率及表达情况.方法 采用DNA重组技术,将NK4基因克隆至带EGFP的慢病毒表达载体pLenti6.3-内部核糖体进入位点序列(IRES)-EGFP中,并用脂质体介导法将慢病毒包装系统和带NK4基因的质粒pLemi6.3-NK4-IRES-EGFP共转染293T细胞,包装慢病毒并测定滴度.以不同感染复数(MOI)的重组慢病毒感染293T细胞,筛选适MOI,以适MOI重组慢病毒感染HCCLM3细胞,观察转染效率.Western blot法测定细胞中NK4蛋白表达水平.结果 成功构建共表达NK4基因和EGFP基因的慢病毒载体pLenti6.3 -NK4 -IRES-EGFP,并对其包装、纯化及浓缩后测定病毒滴度为1.08×108 TU/mL.重组慢病毒感染HCCLM3细胞筛选其适MOI为7.转染后HCCLM3细胞中可见明显的NK4蛋白表达,而未转染细胞中无NK4蛋白的表达.结论 成功构建了NK4基因的重组慢病毒载体,有效地转染HCCLM3细胞后可高表达NK4蛋白.
关键词： NK4 慢病毒载体 人高侵袭转移肝癌细胞LM3 基因转染 -
NK4基因在重组腺病毒中的表达与初步鉴定
目的构建含有肝细胞生长因子(HGF)NK4基因的重组腺病毒载体,为应用HGF/NK4进行肿瘤基因治疗奠定实验基础.方法应用AdEasy腺病毒载体系统,将PCR扩增所得的NK4基因片段与穿梭质粒pShuttle-CMV进行连接,获得重组质粒pShuttle-CMV-NK4,将该质粒与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183获得重组腺病毒质粒pAdCMV-NK4,用该质粒转染293细胞包装产生出重组腺病毒rvAdCMV-NK4.重组腺病毒分别经电子显微镜技术及RT-PCR、Western Blot等方法进行鉴定.结果得到含有NK4基因的重组腺病毒rvAdCMV-NK4,电子显微镜下可见典型腺病毒颗粒形态,RT-PCR及Western Blot分析显示rvAdCMV-NK4感染293细胞后NK4基因可有效转录并表达.结论成功构建出含有NK4基因的重组腺病毒rvAdCMV-NK4,为下一步开展关于NK4基因的肿瘤治疗提供了基础.
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重组腺病毒Ad5-hNK4-EGFP的构建与鉴定
目的 构建携带绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)标签和hNK4基因的重组腺病毒Ad5-hNK4-EGFP,并检测其对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响.方法 以pcDNA3／hNK4质粒为模板,采用高保真DNA聚合酶扩增hNK4基因,克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建重组穿梭质粒pAdTrack-hNK4,穿梭质粒经PmeⅠ酶切线性化,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,获得重组腺病毒质粒pAd5-hNK4-EGFP,经Pac Ⅰ酶切线性化后转染AD-293细胞进行包装,获得重组腺病毒Ad5-hNK4-EGFP,经4轮扩增后,测定病毒滴度;将重组腺病毒感染AD-293细胞,采用RT-PCR及Western blot法检测感染细胞中NK4基因的转录及蛋白的表达;MTT法检测Ad5-hNK4-EGFP对肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)诱导的MDA-MB-231细胞增殖的影响.结果 重组腺病毒质粒pAd5-hNK4-EGFP经Pac Ⅰ酶切鉴定证明构建正确;经包装及4轮扩增后,重组腺病毒Ad5-hNK4-EGFP的滴度可达1.5×1011 PFU／ml;经RT-PCR及Western blot鉴定表明,重组腺病毒携带的NK4基因能够在AD-293细胞中表达;HGF可促进MDA-MB-231细胞增殖,而Ad5-hNK4-EGFP可拮抗HGF诱导的MDA-MB-231细胞增殖.结论 成功构建了表达hNK4基因的重组腺病毒Ad5-hNK4-EGFP,其可拮抗HGF诱导的MDA-MB-231细胞的增殖,为进一步深入研究HGF和NK4的功能、相互作用及作用机制奠定了基础,也为乳腺癌的靶向基因治疗提供了一个新的靶点.
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表达GST-NK4工程菌的发酵工艺研究
目的建立重组GST-NK4融合基因工程菌的发酵工艺.方法采用摇瓶、发酵罐发酵,对影响工程菌生长和表达的条件如pH值、诱导时间及诱导剂浓度等进行优化.结果根据优化的条件,15 L发酵罐发酵11 h,菌体收获量可达到湿重(24.6±0.98) g/L,目的蛋白质的表达量占菌体总蛋白质的50%左右.结论确定了周期短、产率高且稳定可靠的发酵工艺.
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过表达NK4对人肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响
目的:构建含有NK4基因的重组慢病毒载体(LV-NK4),感染人肺腺癌A549细胞后观察NK4基因的表达,并研究NK4对肺癌A549细胞增殖和凋亡的影响.方法:采用DNA重组技术,将NK4基因克隆至带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的慢病毒载体GV358,脂质体介导法将其与慢病毒包装系统共转染293T细胞,包装为慢病毒,感染A549细胞,观察感染效率.采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫印迹法(Western blot)检测NK4基因和蛋白的表达.建立A549(空白对照组)、A549/NK4(实验组)、A549/LV(空病毒对照组)3组细胞;RT-PCR法测定各组细胞c-met基因水平;噻唑蓝(MTT)比色法测定各组细胞第1～7天增殖情况,绘制生长曲线;流式细胞术检测各组细胞凋亡率.结果:经基因测序证实LV-NK4构建成功;感染后A549细胞中可见明显的NK4蛋白表达,Western blot显示50 000处有蛋白条带;RT-PCR结果显示实验组NK4 mRNA水平较空白对照组和空病毒对照组明显升高(P＜ 0.01),c-met mRNA水平较其他两组下降(P＜ 0.05);MTT结果显示实验组细胞从第4天起生长比正常对照组和空病毒对照组均缓慢(P＜0.05);流式细胞术结果显示实验组细胞凋亡率高于正常对照组和空病毒对照组(P＜0.05).结论:成功构建NK4慢病毒载体且有效转染A549细胞;NK4具有抑制A549细胞增殖并促进其凋亡的作用,可能与下调c-met基因水平有关.
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NK4基因对非霍奇金淋巴瘤细胞增殖能力的影响
目的：观察NK4基因对非霍奇金淋巴瘤细胞Raji增殖能力的影响。方法通过质粒转染的方法在Raji细胞中过表达NK4基因，采用MTT实验、细胞周期分析检测Raji细胞生物学行为的变化。结果过表达NK4的Raji细胞的生长速度明显下降，细胞G0／G1期比例、S期比例下降，G2／M期比例升高，细胞阻滞于G2／M期，差异均有统计学意义（ P＜0．05）。结论 NK4基因可能在非霍奇金淋巴瘤的发生发展中起重要作用，可能成为非霍奇金淋巴瘤临床治疗的靶点。
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NK4基因转染对裸鼠人淋巴瘤移植瘤的抑制作用
目的 探讨NK4基因转染对裸鼠人淋巴瘤移植瘤的抑制作用及其机制.方法 采用NK4基因重组质粒pVITRO2-NK4转染的Raji细胞建立裸鼠皮下人淋巴瘤移植瘤模型,动态监测裸鼠体重和肿瘤大小.8周后获取瘤组织,分别采用免疫组化和脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TdT-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)检测移植瘤组织的细胞凋亡和微血管密度(microvessel density,MVD),并进行相关分析.结果 NK4基因转染组裸鼠移植瘤体积明显小于对照组(P<0.01),而对照组间差异无显著性(P>0.05);各组间裸鼠体重降低,差异无显著性(P<0.01).NK4基因转染组的淋巴瘤细胞AI值达237±10.94,而质粒pVITRO2转染组和未转染Raji组的AI值分别为79.7±30.8和81.7±22.2,NK4基因转染组明显高于对照组(P<0.001),而对照组间差异无显著性(P>0.05);NK4基因转染组MVD为4.7±1.52,而质粒pVITRO2转染组和未转染Raji组MVD分别为12.0±1.00和10.66±1.53,NK4基因转染组明显低于对照组(P<0.001),而对照组间差异无显著性(P>0.05).结论 NK4基因转染可明显抑制裸鼠人淋巴瘤移植瘤的生长,其可能通过抑制肿瘤血管新生和促肿瘤细胞凋亡而发挥其效应.
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肝细胞生长因子拮抗剂NK4对裸鼠体内人宫颈癌种植瘤生长的影响
目的 通过建立裸鼠皮下肿瘤生长模型,研究肝细胞生长因子(HGF)拮抗剂NK4在裸鼠体内对人宫颈癌细胞的生长抑制作用.方法 NK4和荧光霉素表达质粒分别稳定转染至人宫颈癌细胞CaSki；应用Western blot检测NK4在细胞培养基中的分泌表达情况；检测3组肿瘤细胞(CaSki、CaSki/LUC和CaSki/NK4)体外生长速度；种植3组肿瘤细胞至裸鼠皮下,比较其在裸鼠体内的生长速度.结果 在CaSki/NK4培养基中有NK4蛋白表达,对照(CaSki和CaSki/LUC)细胞中无表达.3组肿瘤细胞体外生长曲线无统计学差异(P＞0.05).1周后CaSki/NK4细胞接种的肿瘤生长缓慢,CaSki和CaSki/LUC细胞接种的肿瘤生长迅速,两组比较P＜0.05.结论 本研究观察到在裸鼠体内NK4能抑制宫颈癌种植瘤的生长,因此NK4是一个潜在的治疗宫颈癌的新策略.
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NK4修饰骨髓间充质干细胞靶向治疗裸鼠肝癌
目的 探讨肝细胞生长因子拮抗剂NK4基因修饰骨髓间充质于细胞(MSCs)对裸鼠肝癌的治疗作用.方法 体外构建NK4慢病毒载体并感染MSCs,获得稳定表达NK4的MSCs(LV-NK4-MSCs),Western blot与酶联免疫吸附试验(ELISA)分析其NK4的表达.将LV-NK4-MSCs上清液作用于3组肝癌细胞SMMC-7721、MHCC-97H、HepG2,观察其对肝癌细胞增殖和凋亡的影响.建立裸鼠肝癌皮下移植瘤模型,尾静脉注射LV-NK4-MSCs进行治疗,观察MSCs在体内迁移情况,测量荷瘤裸鼠的肿瘤体积、生存时间,ELISA检测瘤内及血浆中NK4浓度、免疫组织化学检测CD34、血管内皮生长因子(VEGF)、细胞核增殖抗原(Ki-67)表达情况.结果 成功获得稳定表达NK4的LV-NK4-MSCs,能够表达和分泌NK4.NK4能够明显抑制3组肝癌细胞的增殖,促进凋亡形成.在裸鼠肝癌模型中,MSCs能靶向迁移至肝癌组织中,而几乎不出现在正常组织中.与对照组比较,LV-NK4-MSCs治疗组的瘤体内NK4水平明显高表达[(379.80±16.83) pg/ml比(29.68±5.59) pg/ml,P=0.021],肿瘤体积显著缩小[(211.40±14.13) mm3比(457.70±93.74) mm3,P=0.009],CD34、VEGF及Ki-67表达显著降低,生存时间明显延长.结论 NK4修饰MSCs能够抑制肝癌细胞的增殖,能在体内靶向迁移至裸鼠肝癌组织中,抑制裸鼠肝癌的生长,延长生存期.
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NK4基因转染对裸鼠人卵巢癌种植瘤生长的影响
目的 NK4不仅具有肝细胞生长因子(HGF)拮抗剂的作用,而且具有抗血管生成作用.该实验通过在人卵巢癌细胞SKOV-3中转染NK4cDNA片段,研究NK4在裸鼠体内对人卵巢癌的治疗作用.方法 NK4和荧光霉素( luciferase)表达质粒分别转染人卵巢癌细胞SKOV-3,稳定转染后,得到SKOV-3/NK4细胞和对照(SKOV-3/LUC)细胞.检测NK4在细胞培养基中的表达情况以及经不同培养基(SKOV-3、SKOV-3/LUC和SKOV-3/NK4培养基上清)培养后SKOV-3细胞中c-Met和磷酸化-c-Met的表达,检测三组肿瘤细胞(SKOV-3、SKOV-3/LUC和SKOV-3/NK4)体外生长速度,建立裸鼠皮下肿瘤生长模型,比较三组肿瘤细胞在裸鼠体内的生长速度.结果 在SKOV-3/NK4培养基中有NK4蛋白表达,对照(SKOV-3和SKOV-3/LUC)细胞中无表达.磷酸化-c-Met在SKOV-3/NK4培养基培养的SKOV-3细胞中被抑制,而在对照(SKOV-3和SKOV-3/LUC)细胞培养基培养的SKOV-3细胞中正常表达.c-Met表达在各组无差别.三种细胞体外生长曲线差异无显著性(P＞0.05).一周后SKOV-3/NK4细胞接种的肿瘤生长缓慢,SKOV-3和SKOV-3/LUC细胞接种的肿瘤生长迅速,与SKOV-3/NK4组相比有统计学意义(P＜0.05).结论 NK4蛋白在SKOV-3/NK4细胞培养基中大量分泌,NK4能抑制人卵巢癌细胞c-Met受体磷酸化.在裸鼠体内NK4能抑制卵巢癌细胞生长,NK4可作为卵巢癌基因治疗的新方法.
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共表达人PUMA和HGF/NK4基因的重组腺病毒的制备及在胰腺癌细胞中的表达
目的 制备同步表达HGF/NK4基因和PUMA基因的重组腺病毒,感染胰腺癌细胞后检测基因的有效表达.方法 将PUMA基因和HGF/NK4基因以串联方式依次克隆至腺病毒穿梭载体,构建重组穿梭载体pAdTrack-PUMA-NK4,转化大肠杆菌BJ5183并在细菌内与腺病毒载体同源重组制备重组腺病毒载体pAd-PUMA-NK4.PacⅠ酶切后转染至HEK293细胞包装得到重组腺病毒.一定滴度的腺病毒感染人胰腺癌细胞株,荧光定量RT-PCR检测细胞中NK4和PUMA基因mRNA表达水平.结果 双酶切重组pAd-PUMA-NK4穿梭载体鉴定证实目的基因PUMA和HGF/NK4正确克隆；重组腺病毒载体经PacⅠ酶切得到特异的酶切产物转染HEK293细胞后成功包装出重组腺病毒；病毒感染胰腺癌细胞后3～9d内PUMA和NK4基因的表达水平较高,整体持续表达可维持2w.结论 成功构建了同时表达NK4和PUMA基因的重组腺病毒载体并包装出相应的重组腺病毒颗粒,该腺病毒能有效感染胰腺癌细胞并高表达NK4和PUMA基因,这为进一步确定NK4和PUMA基因的功能及指导双基因联合治疗胰腺癌提供了理论依据和必要的材料.
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NK4基因联合奥沙利铂对人结肠癌细胞株HCT116凋亡和侵袭的影响
目的 探讨NK4基因联合奥沙利铂(oxaliplatin,L-OHP)在人结肠癌细胞HCT116凋亡和侵袭中的作用.方法 构建NK4质粒表达载体,将NK4基因转染至HCT116细胞,采用流式细胞术分析NK4基因联合奥沙利铂对HCT116细胞凋亡的影响,Transwell小室法检测NK4基因联合奥沙利铂对该细胞侵袭的影响.采用金正均Q值法判断NK4基因联合奥沙利铂是否有协同作用;Western blot法检测不同药物作用下相关机制蛋白p-Akt的变化情况.结果 在HCT116细胞中成功构建NK4质粒表达载体,NK4组mRNA表达水平高于阴性对照组(NC组)和空白组,差异有统计学意义(P＜0.01).与NC组相比,NK4基因联合奥沙利铂促细胞凋亡作用显著(16.55％ vs 46.86％,P＜0.05);抑制细胞侵袭能力强(0.9％ vs 77.4％,P＜0.05);金正均Q值法结果显示NK4基因联合奥沙利铂具有协同相加作用(0.85≤Q＜1.15),且细胞凋亡和侵袭相关蛋白p-Akt的表达在联合用药组中显著下调,亦显示协同作用(P＜0.01).结论 NK4基因协同奥沙利铂可能通过Akt相关信号通路诱导HCT116结肠癌细胞凋亡并抑制该细胞侵袭.
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NK4基因慢病毒载体的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达
本研究构建携带人NK4基因的慢病毒载体,并将其转染人骨髓间充质干细胞(hBMSCs),明确转染后NK4表达情况.通过聚合酶链反应从HGFcDNA文库中克隆NK4基因,限制性内切酶酶切和基因重组构建慢病毒载体质粒pGC-FU-NK4,实时定量PCR检测病毒滴度.所获慢病毒(Lenti-NK4)转染hBMSCs后,荧光显微镜下观察荧光表达.ELISA检测培养上清中NK4表达.结果显示,所获NK4基因测序后与GeneBank报到序列完全一致,收集、浓缩病毒后测定其滴度为2×108 TU/ml.Lenti-NK4转染hBMSCs后胞膜及胞浆有荧光分布,培养上清中NK4含量随感染时间延长而增加.提示携带NK4的慢病毒能安全、有效地转染hBMSCs,持续稳定表达.
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NK4基因转染对裸鼠肝癌移植瘤生长的影响
目的:构建稳定表达NK4的LM3肝癌细胞系,建立裸鼠肝癌模型,观察肿瘤生长情况,并探讨NK4抑制肿瘤可能的机制.方法:构建携带NK4基因的慢病毒载体pLenti6.3-NK4-IRES-EGFP,转染LM3细胞构建稳定表达NK4的细胞系,分组建立裸鼠肝癌皮下移植瘤模型.测量肿瘤瘤体的体积,重量,采用免疫组化等方法观察肿瘤微血管密度,瘤体中MMP-9的表达.结果:接种肝癌细胞28天后,NK4组裸鼠移植瘤体积为(1.28±0.25) cm3,明显小于对照组与空载体组(2.15±0.58)cm3和(2.06±0.51)cm3(P＜0.01).NK4组瘤重为(1.17±0.78)g,显著低于对照组和空载体组(3.69±1.92)g和(3.52±1.68)g(P＜0.01).NK4转染组的肿瘤血管密度为(10.25±3.85),显著低于对照组和空载体组(26.56±7.62)和(24.37±8.34).NK4组瘤体中MMP-9表达明显减少.结论:转染NK4基因可以显著抑制裸鼠肝癌移植瘤的生长,其作用机制可能是通过抑制肿瘤内新生血管的形成和肿瘤细胞的侵袭.
