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地黄低聚糖对脂肪间充质干细胞增殖的影响
目的 分离培养人脂肪源性间充质干细胞(human adipose tissue-derived mesenchymal stromal cells,hADMSCs),探讨地黄低聚糖对其体外增殖的影响.方法 腹部外科手术患者术后废弃的脂肪组织用胶原蛋白酶I消化后培养,免疫组织化学方法鉴定其表面分子CD44、CD105、CD45、CD34的表达,鉴定细胞为hADMSCs后,应用不同浓度的地黄低聚糖IMDM(1、10、100、400mg·L-1)体外培养hADMSCs,应用MTT比色法检测RGOs对ADMSCs增殖能力的影响.结果 1、10rag·L-1组与对照组相比无显著性差别,100、400mg·L-1组的地黄低聚糖培养基对hADMSCs的增殖有明显的促进作用,且100rag·L-1RGOs的促hADMSCs增殖作用强(P＜0.01).结论 一定浓度的地黄低聚糖对hADMSCs的增殖能力具有促进作用.
关键词： 脂肪源性间充质干细胞 地黄低聚糖 增殖 -
脂肪源性间充质干细胞和造血干细胞联合移植:治疗1型糖尿病的新方法
1型糖尿病是一类β细胞受破坏而致胰岛素分泌绝对缺乏的自身免疫性疾病,需终生应用外源性胰岛素替代治疗.因此,糖尿病医师一直在竭力探索一种能让患者恢复至非糖尿病状态的方法.
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microRNA-346对脂肪源性间充质干细胞成骨分化的影响
目的:探讨microRNA-346(miR-346)对脂肪源性间充质干细胞(hADSCs)成骨分化的影响.方法:离体培养大鼠脂肪源性间充质干细胞,通过转染过表达或者抑制miR-346,qRT-PCR检测各组成骨相关基因碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OCN)、Runt相关转录因子2(Runx2)、Osterix mRNA的表达.结果:miR-346在hADSCs的表达随着成骨诱导时间延长逐渐升高(P<0.05).转染miR-346 mimics后的hADSCs内成骨相关基因ALP、OCN、Runx2、Osterix mRNA的表达显著升高.相反,细胞转染miR-346 inhibitors后,其成骨相关基因ALP、OCN、Runx2、Osterix mRNA的表达显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05).结论:miR-346通过正向调控hADSCs细胞内成骨相关基因ALP、OCN、Runx2、Osterix表达进而影响hADSCs细胞的成骨分化进程.
关键词： 脂肪源性间充质干细胞 成骨分化 miR-346 -
体外培养兔脂肪源性间充质干细胞的成骨成脂分化
背景：脂肪源性间充质干细胞具有自我更新能力且在体外特定条件下具有多向分化潜能，在临床上具有广泛的应用前景。然而，脂肪源性间充质干细胞的分离培养仍存在诸多困难与不足。目的：体外分离培养获得兔脂肪源性间充质干细胞，对其形态学、生物学特性进行观察，并鉴定其向成骨、成脂分化的潜能。方法：切取兔颈背区皮下脂肪，用胶原酶消化法分离兔脂肪源性间充质干细胞，进行体外培养，流式细胞仪检测细胞表面标志物，CCK-8法检测细胞活性并绘制细胞生长曲线。第4代兔脂肪源性间充质干细胞向成脂、成骨诱导分化后进行油红O染色、茜素红染色、碱性磷酸酶染色，观察其成脂、成骨分化潜能。结果与结论：兔脂肪源性间充质干细胞呈长梭形漩涡样贴壁生长，能稳定传代至第10代，增殖能力强；流式细胞仪检测可高表达CD29、CD90及CD44，而CD34和CD45表达较低；成脂诱导后的兔脂肪源性间充质干细胞油红 O 染色呈阳性；成骨诱导后的兔脂肪源性间充质干细胞碱性磷酸酶和茜素红染色均呈阳性，以上结果显示实验成功分离培养出兔脂肪源性间充质干细胞，获得的细胞生长稳定，增殖活跃，高表达间充质干细胞的表面抗原以及具有向成骨、成脂等多向分化的潜能，有望为骨组织工程提供理想的种子细胞。
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同种异体脂肪源性间充质干细胞复合β-磷酸三钙支架修复兔桡骨大段骨缺损
目的 探讨以β-磷酸三钙(β-tricalcium phosphate,β-TCP)陶瓷为支架材料复合兔脂肪源性间充质干细胞(rabbit adipose-derived mesenchymal stem cells,rADSCs)构建组织工程骨修复骨缺损的可行性.方法 将体外培养的rADSCs接种于β-TCP支架上,构建rADSCs/β-TCP骨组织工程复合体,并进行体外培养.将24只新西兰大白兔在双侧桡骨中下段造成2 cm长度的节段性骨缺损模型,随机平均分为3组,A组:空白对照组,不植入任何材料;B组:单β-TCP人工骨对照组;C组:rADSCs/β-TCP复合体实验组.在手术后2周、4周、6周和8周时进行X线检查,然后每组各选2只兔处死后取出标本,对标本进行大体观察以及常规HE染色,光镜下观察骨修复情况,并观察是否发生免疫排斥反应.结果 rADSCs在适当的诱导条件下具有成骨细胞分化潜能,复合β-TCP后对其生长分化无影响.X线检查结果发现,A组有稍多的骨组织形成,未见髓腔及正常骨影像学表现;B组虽然骨连接性基本恢复,但骨髓腔尚未完全再通;C组骨连接性完全恢复,骨缺损基本修复,骨髓腔再通.术后4周,C组可观察到骨缺损周围开始形成新生骨,并随着时间的延长新生骨量逐渐增多.术后6周,材料逐渐降解,材料孔隙内有新生骨长入.术后8周,C组材料降解明显,材料孔隙基本消失,髓腔已基本再通;B组部分骨髓腔再通,而A组未发现骨髓腔再通.新生骨组织面积比较,各时间点C组的面积大,且其差异有统计学意义.组织学检测未见免疫排斥现象.结论 rADSCs在适当的诱导条件下具有成骨细胞分化潜能.ADSCs有望成为理想的修复骨缺损、促进骨折愈合的组织工程骨所需要的种子细胞,为大段骨缺损组织工程的修复提供可行的技术方案,为临床治疗大段骨缺损提供新的方法.
关键词： 脂肪源性间充质干细胞 骨组织工程复合体 大段骨缺损 β-磷酸三钙 兔 -
脂肪源性间充质干细胞与肝病
脂肪源性间充质干细胞是近年来发现的一种成体干细胞,具有自我更新和多向分化潜能.由于其广泛存在于脂肪组织中,取材容易,获得率高而有望成为组织工程和基因工程中新的干细胞来源,极具临床应用及基础研究前景.本文对脂肪源性间充质干细胞的生物学特性、多向分化潜能及其在肝脏疾病治疗方面的新研究进展进行了阐述.
关键词： 脂肪源性间充质干细胞 分化 肝脏疾病 -
脐带和脂肪源性间充质干细胞生物学特性比较
目的 比较脐带间充质干细胞(UC-MSCs)与脂肪源性间充质干细胞(AD-MSCs)的体外生物学特性.方法分离培养UC-MSCs与AD-MSCs,CCK-8法检测UC-MSCs与AD-MSCs的增殖能力,流式细胞术检测细胞表面标志物表达.油红O,茜红素及Von Kossa 染色比较UC-MSCs与AD-MSCs成脂成骨诱导分化能力.MSCs与外周血单个核细胞(PBMC)共培养,在植物血凝素(PHA)刺激作用下,流式细胞术分析MSCs对PBMC增殖抑制作用.结果 生长曲线结果显示,UC-MSCs 细胞增殖优于 AD-MSCs,UC-MSCs 与 AD-MSCs 稳定表达 CD13、CD44、CD73及CD90分子,不表达CD34和CD45.AD-MSCs成脂能力优于UC-MSCs,但成骨能力没有明显差异.UC-MSCs抑制PBMC增殖能力优于AD-MSCs.结论 UC-MSCs在免疫调节方面是一种更佳的种子细胞选择.
关键词： 脐带间充质干细胞 脂肪源性间充质干细胞 细胞增殖 细胞分化 免疫抑制 -
脐带、脂肪源性间充质干细胞改善肝硬化大鼠的效果比较
目的 比较脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSCs)和脂肪源性间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)对肝硬化大鼠的治疗效果.方法 四氯化碳(CCl4)诱导大鼠肝硬化模型.成模大鼠随机分为UC-MSCs组、ADSCs组和对照组,每组10只,分别注入UC-MSCs、ADSCs各2 ml(细胞数量5×106)及等量生理盐水.干细胞移植前及移植4周后,检测大鼠肝功能;取肝组织制备切片进行HE、Masson染色;免疫组化法检测肝脏中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达.结果 干细胞移植后,UC-MSCs组和ADSCs组的肝功能较对照组有明显改善(P＜0.05).组织病理提示,细胞移植组较对照组在肝组织炎症活动度和纤维化程度评分等方面均有明显降低,差异均有统计学意义(P ＜0.05);UC-MSCs组与ADSCs组间肝组织评分差异无明显统计学意义(P＞0.05).UC-MSCs组、ADSCs组与对照组相比,α-SMA表达差异有统计学意义(P ＜0.05);UC-MSCs组与ADSCs组α-SMA表达差异无统计学意义(P＞0.05).结论 UC-MSCs、ADSCs移植能改善肝硬化大鼠的肝功能和病理组织学,两者效果相似.
关键词： 脐带间充质干细胞 脂肪源性间充质干细胞 肝硬化 -
长期体外培养对人脂肪源性间充质干细胞生物学特性的影响
目的 通过观察长期体外培养对人脂肪源性间充质干细胞(ADSCs)生物学特性的影响,鉴定ADSCs作为组织工程种子细胞的优越性.方法 通过流式细胞技术观察长期体外培养对人ADSCs表面抗原表达和凋亡的影响.通过碱性磷酸酶染色、Von Kossa染色及RT-PCR检测长期体外培养对人ADSCs成骨分化潜能的影响.结果 原代ADSCs表面高表达间充质干细胞表面标记物,而不表达血源性细胞表面标记物,标记物不随传代次数变化.早期ADSCs凋亡率为1%～2%,随传代次数增多凋亡率逐渐增加,但幅度不大.碱性磷酸酶染色、Von Kossa染色和RT-PCR检测显示ADSCs传至第8代时仍能保持成骨分化潜能.结论 ADSCs生物学特性稳定,是较为理想的组织工程及再生医学研究的种子细胞.
关键词： 脂肪源性间充质干细胞 生物学 体外培养 人 -
整合素α9在人脂肪源性间充质干细胞向淋巴管内皮细胞分化过程中的表达变化
目的:从人体脂肪组织中分离培养出脂肪源性间充质干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs),诱导其向淋巴管内皮细胞(lymphatic endothelial cells,LECs)分化,同时探讨分化过程中整合素α9 (integrin α9)表达的变化,旨在寻找淋巴水肿分子治疗靶点,为ADSCs应用于淋巴水肿的分子治疗奠定实验基础.方法:①从吸脂术后废弃的人体脂肪组织中分离培养出ADSCs,倒置相差显微镜观察原代及传代细胞的形态特征.②流式细胞仪(flow cytometry,FCM)检测第3代ADSCs表面特征性抗原CD90、CD29、CD34及CD45的表达;MTT法绘制生长曲线.③用人血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)C、人VEGF-A、血小板源性生长因子BB(platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB)诱导其向LECs方向分化,同时以人LECs作为阳性对照组.④Western blot检测各组细胞LECs表面特征性抗原淋巴管内皮细胞透明质酸受体-1(lym phatic endothelial hyaluronan receptor-1,LYVE-1)、血管内皮细胞特征性抗原CD34及integrinα9的表达.⑤FCM检测各组细胞周期,使用SPSS17.0对实验数据进行统计分析.结果:①ADSCs贴壁生长,呈长梭形,第1、3、5代ADSCs的生长曲线均呈S形;细胞表面抗原为CD90+、CD29+、CD34-、CD45-.②实验组及阳性对照组LYVE-1表达阳性、CD34表达均阴性,integrin α9的表达趋势与LYVE-1一致,且二者在实验组的表达水平低于阳性对照组;三者在阴性对照组中的表达均为阴性.③各组G0/G1期细胞比例有明显统计学差异(P＜0.01),实验组与阳性对照组G0/G1期细胞比例显著小于阴性对照组(P＜0.01),实验组与阳性对照组之间无明显统计学差异(P=0.083).结论:ADSCs离体培养,具有向LECs分化的潜能.使用VEGF-C、VEGF-A、PDGF-BB可诱导部分人ADSCs向LECs分化.在人ADSCs向LECs分化过程中integrin α9的表达增强,分化前后细胞的周期发生了改变.该分子在LECs的形成过程中可能发挥着极为重要的作用,将有望在淋巴水肿的再生治疗中成为重要的分子靶点之一.
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低氧环境对脂肪源性间充质干细胞生物学特性的影响
氧是维持机体内环境稳态和能量代谢的基本条件,氧浓度发生变化将引起细胞生理功能出现相应的改变. 目前,大部分研究对于细胞培养通常是在常氧(21%O2)状态下进行,而研究发现,正常机体的平均氧浓度仅5%[1]. 所以,对不同种类细胞,包括干细胞/祖细胞,合适的氧浓度已被当作发挥其特有功能所必不可少的因素[2]. 间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)来源于中胚层,属于非造血干细胞,目前已广泛应用于各个领域的研究,并取得显著成果. 相对而言,脂肪源性MSCs(adipose derived MSCs, ADMSCs)来源丰富,取材简便,创伤小,免疫原性低,易于扩增,同时具有间充质干细胞的特性,是目前组织工程的理想种子细胞. 目前的相关研究显示,低氧对ADMSCs在增殖、迁移、分化及旁分泌等方面均有不同程度的影响. 本文就低氧环境对脂肪来源间充质干细胞生物学特性的影响进行综述.
关键词： 低氧 脂肪源性间充质干细胞 细胞增殖 细胞分化 -
Notch信号通路在脂肪源性间充质干细胞向血管内皮细胞分化中的作用研究进展
脂肪源性间充质干细胞(Adipose derived mesenchymal stem cells,ADMSC)具有干细胞的特性,能在体内及体外分化成血管内皮细胞并参与血管形成,在内皮细胞形成血管的过程中,血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)通过VEGF信号通路起着重要的调控作用,Notch信号通路是VEGF信号通路的下游通路,研究显示Notch信号通路在血管形成过程中发挥着至关重要的调控作用.本文对Notch信号通路在ADMSC向血管内皮细胞分化中的研究做一综述.
关键词： 脂肪源性间充质干细胞 血管内皮细胞 Notch信号通路 血管新生 -
糖尿病对脂肪源性间充质干细胞生物学功能影响的研究进展
脂肪源性间充质干细胞(ADSC)是存在于脂肪组织中的具有自我更新和多向分化潜能的成体间充质干细胞.ADSC在创面治疗方面已经取得了良好的效果,且因其有来源广泛、体内含量多、免疫原性低、获取对机体创伤小等优势,临床应用前景十分广泛.糖尿病创面愈合困难的原因可能与晚期糖基化终末产物增多、长期的慢性炎症反应及外周神经功能障碍密切相关.糖尿病患者异常的体内环境也可影响ADSC的生物学功能,从而影响创面愈合.本文就糖尿病ADSC的一般特性及其分化、增殖、迁移、分泌及促血管生成功能进行综述.
关键词： 糖尿病 伤口愈合 脂肪源性间充质干细胞 -
兔脂肪源性间充质干细胞对兔皮肤深Ⅱ度烫伤创面愈合的影响
目的 探讨创面局部注射兔脂肪源性间充质干细胞(ADSC)对兔皮肤深Ⅱ度烫伤创面愈合的影响. 方法 取1只新西兰大白兔脂肪组织,分离ADSC,并进行传代培养,采用第3代细胞进行以下实验.将24只兔按照随机数字表法分为ADSC组12只和对照组12只,在兔背部近臀部两侧各造成1个直径约5 cm深Ⅱ度烫伤创面.于伤后第2天起ADSC组兔创面皮下注射2 mL经EdU标记的ADSC悬液(浓度为5×105个/mL),对照组兔创面同前注射2 mL无血清DMEM培养液,至创面愈合.每日观察2组兔创面愈合情况,记录其愈合时间.伤后第7、14、21、28天,2组各取3只兔,测量创面面积并计算愈合率;切取创面愈合组织,HE染色观察组织形态,Masson染色观察胶原纤维表达.倒置荧光显微镜下观察EdU标记的ADSC在伤后第28天创面愈合组织中的分布,ELISA法检测伤后第7、14、21天创面愈合组织中血管内皮生长因子(VEGF)及EGF表达.对数据行析因设计方差分析、配对样本t检验. 结果 (1) ADSC组兔创面愈合时间为伤后(19.5 ±1.1)d,明显短于对照组的(23.3±1.5)d,t=4.50,P＜0.05.伤后第7天,2组兔创面均干燥,无明显渗出物,创周红肿逐渐消退;ADSC组兔创面愈合率为(15.1±2.4)％,与对照组的(13.7±3.1)％相近(t=1.20,P＞0.05).伤后第14天,ADSC组兔创面干燥、结痂明显,创面愈合率为(73.1±5.7)％;对照组兔创面有少量分泌物、少量结痂,创面愈合率为(52.9±5.1)％,明显低于ADSC组(t=8.06,P＜0.01).伤后第21天,ADSC组兔创面基本愈合,创面愈合率为(95.6±3.0)％;对照组兔仍有少量创面存在,创面愈合率为(78.6±3.7)％,明显低于ADSC组(t=9.73,P＜0.01).伤后第28天,2组兔创面均完全愈合,愈合率100％,ADSC组兔创面愈合皮肤组织质地及微血管反应优于对照组.(2)伤后第7天,2组兔创面愈合组织Fb增多,均有少量血管、胶原纤维增生,无明显差别.伤后第14天,ADSC组兔创面愈合组织Fb数量多于对照组,胶原纤维排列密集整齐;对照组兔创面愈合组织胶原纤维排列稀疏不规则.伤后第21天,2组兔创面愈合组织表皮层均有分化,ADSC组兔创面愈合组织胶原纤维仍较对照组密集.伤后第28天,ADSC组兔创面愈合组织新生表皮各个层次分化良好,优于对照组;2组兔创面愈合组织中均有大量粗大胶原纤维排列;ADSC组兔创面愈合组织中可见EdU标记的ADSC.(3)伤后第7天,ADSC组兔创面愈合组织VEGF及EGF表达与对照组相近(t值分别为0.70和0.91,P值均大于0.05).伤后第14、21天,ADSC组兔创面愈合组织VEGF及EGF表达明显多于对照组(t值为2.85～4.81,P值均小于0.01). 结论 ADSC移植对兔皮肤深Ⅱ度烫伤创面愈合有明显促进作用,能缩短创面愈合时间.
关键词： 烧伤 伤口愈合 间质干细胞移植 脂肪源性间充质干细胞 -
人脂肪源性间充质干细胞和富血小板血浆对小鼠全层皮肤缺损创面愈合的影响
目的 探讨人脂肪源性间充质干细胞(ADSC)和富血小板血浆(PRP)对小鼠全层皮肤 缺损创面愈合的影响. 方法 取1名2018年2月在广州军区广州总医院整形外科接受吸脂手术的健康女性自愿捐赠的腰腹部脂肪,分离培养ADSC并进行鉴定,采用第2代细胞进行以下实验.抽取该志愿者静脉血,通过二次离心法得到PRP.将36只C57BL/6小鼠按随机数字表法分为单纯损伤组12只、单纯ADSC治疗组12只、ADSC联合PRP治疗组12只,在每只小鼠背部制备1个1 cm×1 cm全层皮肤缺损创面.伤后即刻,单纯损伤组小鼠创而皮下注射1mL生理盐水,单纯ADSC治疗组小鼠创面皮下注射PBS混匀的ADSC悬液(浓度为5×105个/mL,下同)1mL,ADSC联合PRP治疗组小鼠创面皮下注射PRP 与 ADSC按1∶2体积比混合的液体1mL.伤后3、5、7、14d,每组各取3只小鼠,观察创面大体情况并计算创面愈合率;伤后3、5、7 d,大体观察后切取未愈合创面组织及创缘周围0.5 cm正常皮肤组织,行苏木素-伊红染色观察组织炎症反应、再上皮化、血管新生情况并计算创面再上皮化率,行Masson染色观察组织胶原新生情况,另对伤后3、5 d标本采用免疫组织化学法观测巨噬细胞表达.对数据行析因设计方差分析、LSD检验. 结果 (1)伤后3 d,ADSC联合PRP治疗组小鼠创面可见肉芽组织新生、红肿,其余2组小鼠创而红润、有渗液.伤后5d,ADSC联合PRP治疗组小鼠创面红肿减轻、干燥、结痂明显,其余2组小鼠创面红肿明显.伤后7 d,3组小鼠创面基本结痂.伤后14 d,3组小鼠创面痂皮脱落、基本愈合.伤后3、5、7、14 d,ADSC联合PRP治疗组小鼠创面愈合率明显高于其余2组(P ＜0.05或P＜0.01);伤后5、7d,单纯ADSC治疗组小鼠创面愈合率明显高于单纯损伤组(P＜0.01).(2)伤后3d,ADSC联合PRP治疗组小鼠创面肉芽组织新生较其余2组多.伤后5 d,ADSC联合PRP治疗组小鼠创面炎症反应较轻,其余2组小鼠创面炎症反应重.伤后7 d,ADSC联合PRP治疗组小鼠创面几乎完成再上皮化过程,新生血管数多于其余2组;其余2组小鼠创缘再生上皮迁移距离较近.伤后3、5、7 d,ADSC联合PRP治疗组小鼠创而再上皮化率分别为(37.6±4.5)％、(59.1±1.3)％、(89.2±4.3)％,显著高于单纯损伤组的(25.7±1.5)％、(34.5±4.4)％、(50.8±2.7)％和单纯ADSC治疗组的(29.1±0.8)％、(42.6±2.9)％、(72.9±3.0)％(P＜0.01);伤后5、7d,单纯ADSC治疗组小鼠创面再上皮化率显著高于单纯损伤组(P＜0.05或P＜0.01).(3)伤后3、5d,ADSC联合PRP治疗组小鼠创面肉芽组织中有较多新生胶原纤维,其余2组小鼠创面组织中胶原纤维较少.伤后7 d,ADSC联合PRP治疗组小鼠创面肉芽组织减少,出现大量新生胶原纤维;单纯ADSC治疗组小鼠创面组织中胶原纤维增多;单纯损伤组创面组织中胶原纤维沉积仍较少.(4)伤后3、5 d,单纯ADSC治疗组小鼠创面组织中巨噬细胞数分别为(4.7±0.6)、(5.3±0.6)个,明显少于单纯损伤组的(6.3±0.6)、(7.7±0.6)个(P ＜0.05或P＜0.01);ADSC联合PRP治疗组小鼠创面组织中巨噬细胞数分别为(3.0±1.1)、(2.7±0.5)个,明显少于其余2组(P ＜0.05或P＜0.01). 结论 人PRP和ADSC参与小鼠全层皮肤缺损创面早期炎症和中期组织增殖以及后期再上皮化与塑形过程,ADSC和PRP联合治疗可能是提高创面愈合速度与质量的较佳组合方案.
关键词： 创伤和损伤 富血小板血浆 间质干细胞移植 伤口愈合 脂肪源性间充质干细胞 -
异体小鼠脂肪源性间充质干细胞-微孔化羊脱细胞真皮基质对小鼠全层皮肤缺损创面愈合的影响及相关机制
目的 探讨异体小鼠脂肪源性间充质干细胞(ADSC)-微孔化羊脱细胞真皮基质(ADM)对小鼠全层皮肤缺损创面愈合的影响及相关机制. 方法 取1只昆明小鼠,断颈处死后取腹股沟处脂肪组织,体外分离培养小鼠ADSC,取第3代细胞行细胞成脂、成骨诱导分化鉴定,采用流式细胞仪检测CD34、CD73、CD90、CD105的表达.取1只绵羊,宰杀后取背部皮肤,脱细胞处理和冻融法制备微孔化羊ADM.取36只昆明小鼠,均在背部制备1个直径为12 mm的圆形全层皮肤缺损创面,以微孔化羊ADM覆盖创面.术后将小鼠按随机数字表法分为ADSC组和对照组,每组18只.将0.2 mL的悬浮有1×106个ADSC的DMEM/F12培养液注入ADSC组小鼠微孔化羊ADM与创面之间,将0.2 mL的DMEM/F12培养液注入对照组小鼠微孔化羊ADM与创面之间.术后12、17 d,计算2组小鼠创面愈合率;术后7、12、17d,背光反向照射下观察2组小鼠创面血管生长情况;术后7、12、17d,行苏木素-伊红染色观察ADSC组小鼠创面肉芽组织,并于术后7d测量2组小鼠创面肉芽组织厚度;术后12、17d,采用免疫组织化学法检测2组小鼠创面血管内皮生长因子(VEGF)表达.以上实验中各组各时间点样本数均为6.对数据行t检验、析因设计方差分析. 结果 (1)成脂诱导7d,经油红O染色细胞质可见红色小油滴;成骨诱导21 d,硝酸银染色培养基内可见黑色的钙盐沉积.细胞CD73、CD90、CD105、CD34表达率分别为97.82％、99.32％、97.35％、5.88％.细胞鉴定为ADSC.(2)术后12、17 d,ADSC组创面愈合率[(78±6)％、(98±3)％]均高于对照组[(60±9)％、(90±4)％,t=4.26、4.46,P＜0.01].(3)术后7d,2组小鼠都无明显的向创面中心生长的血管,但ADSC组的创面肉芽组织已全部覆盖创面;术后12d,ADSC组小鼠创面比对照组血管更加丰富;术后17d,ADSC组小鼠创面可见粗大的血管且贯穿整个创面,对照组也可见粗大的血管生成,但未贯穿创面.(4) ADSC组小鼠术后7d创面已经覆盖肉芽组织但较薄,术后12d肉芽组织明显增厚,术后17d肉芽组织已被表皮覆盖.术后7d,ADSC组小鼠创面肉芽组织厚度为(0.62±0.05) mm,明显厚于对照组的(0.31 ±0.04) mm,t=12.27,P＜0.01.(5)术后12、17d1,ADSC组小鼠创面VEGF的表达[(80.7±2.2)、(102.8 ±2.6)个/mm2]均高于对照组[(59.5±2.4)、(81.5±2.6)个/mm2,t=15.95、14.14,P＜0.01]. 结论 异体小鼠ADSC-微孔化羊ADM可促进小鼠全层皮肤缺损创面的血管生成和肉芽组织生长,加速创面愈合,其机制可能与增加VEGF表达相关.
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2型糖尿病患者脂肪源性间充质干细胞对小鼠压疮创面愈合的影响
目的 探讨2型糖尿病患者脂肪源性间充质干细胞(AMSC)对小鼠压疮创面愈合的影响. 方法 (1)2016年9月,取1例60岁女性2型糖尿病患者的皮下脂肪组织,采取胶原酶消化法提取AMSC培养,取第3代细胞用于后续实验.观察细胞形态,行成骨、成软骨、成脂诱导分化鉴定,运用流式细胞仪检测细胞表面标志物CD90、CD105、CD73及CD34的表达(样本数为3).(2)取16只6～8周龄雌性C57BL/6野生型小鼠,采用磁铁压迫皮肤的方法在每只小鼠脊柱两侧各制成1个压疮创面,将每只小鼠的2个创面配对分为糖尿病AMSC组和阴性对照组,创面内分别注射100 μL磷酸盐缓冲液(PBS)悬浮的绿色荧光蛋白标记的糖尿病AMSC(1×106个)、100μLPBS.观察注射后21 d内2组创面的愈合情况并计算注射后5、13、17 d的创面愈合率.注射后11、21 d分别处死3只小鼠,每组切取3个创面组织,苏木精-伊红染色观察皮肤结构,Masson染色评估胶原沉积情况,免疫组织化学法计数CD31阳性表达即新生血管数.另取2组前述制备的注射后21 d创面组织标本,免疫组织化学法检测S100阳性细胞率即施万细胞新生情况.另取糖尿病AMSC组前述制备的注射后11d创面组织标本,采用荧光示踪法观察AMSC定植情况.对数据行配对t检验并进行Bonferroni校正. 结果 (1)从2型糖尿病患者皮下脂肪组织中分离培养的第3代细胞贴壁生长,多呈长梭形,呈旋涡状生长;经诱导后具有成骨、成软骨、成脂分化功能,细胞表面CD90、CD105、CD73阳性表达率高于90.00％,CD34表达率为0.46％.细胞鉴定为AMSC.(2)小鼠糖尿病AMSC组创面愈合较快,注射后17 d所有创面均完全愈合;而小鼠阴性对照组创面此时未完全闭合,表面仍有痂皮.注射后5、13、17 d,小鼠糖尿病AMSC组创面愈合率分别为(35.6±6.5)％、(87.1±2.5)％、100.0％,显著高于阴性对照组的(19.8±7.2)％、(66.2±5.2)％、(86.9±5.3)％(t=6.49、14.31、9.73,P＜0.05).与阴性对照组相比,小鼠糖尿病AMSC组创面组织注射后11 d炎性细胞浸润减少,注射后21 d可见较厚的表皮和真皮以及再生的皮肤附属器.注射后11、21d,小鼠糖尿病AMSC组创面组织胶原百分比分别为(48.3±1.3)％、(54.1±1.7)％,明显高于阴性对照组的(41.4±1.7)％、(50.3±1.2)％(t=6.98、3.99,P＜0.01).注射后11、21(d,小鼠糖尿病AMSC组创面组织新生血管数分别为(17.2±1.3)、(1 8.0±2.1)个,明显多于阴性对照组的(8.0±1.4)、(14.0±1.5)个(t =10.69、3.38,P＜0.01).注射后21d,小鼠糖尿病AMSC组创面组织S100阳性细胞率为(1.76±0.12)％,明显高于阴性对照组的(0.55±0.03)％(t=21.68,P＜0.001).注射后11d,小鼠糖尿病AMSC组创面组织仍有AMSC定植. 结论 2型糖尿病患者AMSC移植可通过促进血管再生、胶原沉积及施万细胞再生进而加快小鼠压疮创面愈合.
关键词： 糖尿病 间质干细胞移植 伤口愈合 脂肪源性间充质干细胞 慢性创面 -
自体脂肪源性间充质干细胞局部移植对兔耳增生性瘢痕形成的影响
目的 探讨兔自体脂肪源性间充质干细胞(ADSC)局部移植对兔耳增生性瘢痕形成的影响.方法 取6只新西兰大耳白兔腹股沟处脂肪组织,分离ADSC并进行传代培养.取每只兔的第3代ADSC进行以下实验.在每只兔每侧耳腹造成6个直径为6 mm的全层皮肤缺损创面,观察创面上皮化情况及局部组织增生情况,记录创面完全上皮化时间和增生性瘢痕形成时间.选择兔左耳创面为ADSC组,右耳创面为对照组,每组36个创面.于创面完全上皮化后(伤后25 d),ADSC组创面注射0.2 mL溴脱氧尿苷(BrdU)标记的自体ADSC悬液(浓度为5×106个/mL),对照组创面注射等量PBS.每5天注射1次,共注射3次(后2次注射于创面愈合后形成的瘢痕内).于第3次注射后5d分别切取2组增生性瘢痕组织,HE染色观察组织形态,VG染色观察增生性瘢痕中胶原排列情况,荧光显微镜下观察增生性瘢痕中BrdU标记的ADSC分布,ELISA法检测增生性瘢痕中Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGF-β1、核心蛋白多糖的蛋白含量,实时荧光定量RT-PCR法检测增生性瘢痕中TGF-β1、核心蛋白多糖的mRNA表达.对数据行配对t检验.结果 (1)兔耳创面完全上皮化时间为伤后(20.0±2.0)d,伤后(35.0±2.2)d增生性瘢痕形成.伤后40 d,对照组增生性瘢痕仍维持较明显的增生状态,ADSC组增生性瘢痕体积缩小、变平、质地变软、色泽稍变浅.(2)与对照组比较,ADSC组增生性瘢痕中上皮细胞层数增多,可见上皮脚样及真皮乳突样结构形成,真皮层有核细胞数量明显增多.对照组增生性瘢痕中胶原紧密,排列较紊乱;ADSC组增生性瘢痕中胶原密度较对照组下降,排列较规整.(3)伤后40 d,ADSC组增生性瘢痕中仍可见BrdU标记的ADSC.(4)ADSC组增生性瘢痕中Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGF-β1、核心蛋白多糖蛋白含量分别为(1.40 ±0.04)、(8.18±0.23) μg/L及(25.1±0.7)ng/L、(4.872±0.101) ng/mL,对照组增生性瘢痕中Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGF-β1、核心蛋白多糖蛋白含量分别为(2.29±0.05)、(12.20 ±0.38) μg/L及(37.2±1.1)ng/L、(4.143 ±0.024) ng/mL.与对照组比较,ADSC组增生性瘢痕中Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGF-β1蛋白含量明显降低(t值为-33.66～-22.84,P值均小于0.001),核心蛋白多糖蛋白含量明显增高(t=10.41,P＜0.001).(5)与对照组比较,ADSC组增生性瘢痕中TGF-β1mRNA表达量明显降低(t=4.45,P＜0.01),核心蛋白多糖的mRNA表达量明显升高(t =5.61,P＜0.01).结论 兔增生性瘢痕形成早期瘢痕内移植自体ADSC可抑制增生性瘢痕的形成,改善创面愈合质量,其机制可能与ADSC下调TGF-β1及Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达,上调核心蛋白多糖的表达有关.
关键词： 伤口愈合 瘢痕 间质干细胞移植 脂肪源性间充质干细胞
