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先天性前极白内障家系致病基因的定位与候选基因突变检测
目的 对中国一常染色体显性遗传先天性前极白内障家系进行致病基因的定位与候选基因突变检测.方法 采集家系成员外周静脉血,提取基因组DNA.选用ABI公司提供的约400个遗传标记物进行基因扫描.基因扫描分初步扫描和精细扫描两步进行.首先对已报道的先天性白内障候选区域进行初步扫描,之后在阳性区域内进行精细扫描.数据经连锁分析,初步确定致病基因所在染色体区域.在阳性区域内选取更高密度的荧光标记物进行精细扫描,并进行单体型分析.候选基因直接测序检测基因突变.结果 两点间连锁分析在微卫星标记D21S1252处获得大对数优势计分(LOD)值Zmax=3.23(θmax=0.00).精细定位和单体型分析将致病基因定位于微卫星标记D21S263和D21S266之间,遗传距离约18.47厘摩(cM),染色体位置为21q22.11-q22.3.候选基因直接测序发现CRYAA基因第3外显子第347碱基一个G→A的点突变.结论 本研究将一中国先天性前极白内障家系的致病基因定位于21号染色体21q22.11-q22.3区域内,并在CRYAA基因发现一个点突变与此家系共分离.
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常染色体显性遗传核性白内障合并小角膜的CRYAA基因突变研究
目的 研究一个4代常染色体显性遗传先天性核性白内障伴小角膜家系的致病基因.方法 实验研究.对12例家系成员(6例患者,6例非患者)进行眼部检查并采集静脉血,提取基因组DNA.在已知的与先天性白内障伴小角膜相关致病基因附近选择微卫星标记,进行聚合酶链反应扩增-变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,并进行基因型分析和连锁分析.对连锁区域内候选基因的外显子、外显子和内含子交界区进行测序.限制性内切酶ApaL Ⅰ法在全部家系成员和正常人群中验证突变.结果 该家系患者表型为先天性核性白内障伴小角膜;在染色体21q22.3区域的D21S1885和D21S1890两个标记,家系患者均有共享基因型,并且两点连锁分析Lod值为2.11,提示该位点与家系致病基因连锁;对此区域内候选基因CRYAA测序发现cDNA序列第34位碱基存在C＞T杂合突变(c.34C＞T),导致其编码肽链第12位精氨酸变为半胱氨酸(p.R12C).ApaL Ⅰ酶切验证家系患者均携带c.34C＞T突变,家系中及对照正常个体均不携带此突变.结论 CRYAA的p.R12C突变可能是该先天性白内障伴小角膜家系发病的遗传基础.
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大鼠后发性白内障发生过程中晶状体纤维分化的初步研究
目的 在组织学和mRNA水平上初步了解大鼠后发性白内障模型形成过程中晶状体纤维的分化.方法 对48只SD大鼠行晶状体囊外摘除术,在术后即刻、1 d、3 d、1周、2周、1个月、2个月、3个月行裂隙灯显微镜观察和HE染色;取不同时间点后发性白内障组织,采用半定量逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)检测晶状体蛋白基因-αA、αB、βB1、βB2、βA2、γD的表达水平.结果 所有大鼠术后均发生晶状体后囊膜混浊(PCO).术后即刻,晶状体前囊膜下残留晶状体上皮细胞(LEC);术后1 d,LEC已增殖迁移至晶状体后囊膜中央区;术后3 d,晶状体后囊膜中央轻度混浊、皱缩,晶状体囊袋内布满增生的LEC,周边部发生晶状体纤维分化.术后7 d,后囊膜中央混浊继续加重,呈放射状皱褶,周边形成Seommering环.术后14 d,瞳孔区囊膜组织纤维机化,Seommering环更为明显;术后1个月,新生晶状体纤维填满晶状体囊袋,形成类似正常晶状体的赤道部.术后2、3个月,晶状体纤维继续增生,体积接近正常晶状体.半定量RT-PCR显示术后αA、αB、βB1、βB2、βA2、γD mRNA的表达逐渐增加.结论 SD大鼠行晶状体囊外摘除术后短期内即会发生明显的后发性白内障,并表达α、β和γ晶状体蛋白.该动物模型可用于后发性白内障的发病机制和晶状体再生的应用基础研究.
关键词： 白内障 晶体蛋白质类 大鼠 Sprague-Dawley -
αA晶状体蛋白磷酸化对人晶状体上皮细胞抗氧化和抗凋亡能力的影响
目的 研究αA晶状体蛋白特定氨基酸位点磷酸化对人晶状体上皮细胞(HLEC)抗氧化及抗凋亡能力的影响.方法 实验研究.利用基因定点突变技术,将αA晶状体蛋白第45位、66位、122位丝氨酸分别突变为天冬氨酸以模拟磷酸化,导入pEGFP-C1质粒并经脂质体转染HLEC作为实验组(即S45D组、S66D组、S122D组),转染空质粒以及过表达野生型(WT)αA晶状体蛋白的HLEC分别为空白对照组和WT组.经H2O2诱导后,分别应用超氧化物阴离子荧光探针和Annexin V-PE/7AAD双染法检测各组细胞的活性氧水平及凋亡率.两组间参数的比较采用两样本均数比较的t检验或Wilcoxon秩和检验,多组间比较采用随机区组设计的方差分析或Kruskal-Wallis检验.结果 转染模拟磷酸化αA晶状体蛋白的3组细胞超氧化物阴离子平均荧光亮度分别为167.53±18.21,143.54±4.78和143.40±30.19,较空白组(274.42±3.71)显著下降(t=9.963,P=0.001;t=34.961,P＜0.01;Z=1.993,P=0.046),与WT组(192.67± 1.47)亦存在差异(Z=1.964,P=0.049;t=17.887,P＜0.01;Z=1.964,P=0.049);H2O2诱导的细胞凋亡后,模拟αA晶状体蛋白磷酸化的细胞组早期凋亡率分别为15.08％±0.90％,16.59％±5.37％和15.36％±2.62％,较空白组(41.28％±2.70％;t=21.632,P＜0.01;t=8.855,P＜0.01;t=15.450,P＜0.01)及WT组(31.40％±1.64％)显著下降(t=15.117,P＜0.01;t=4.524,P=0.006;t=8.988,P=0.001).3组实验组间相比活性氧水平及早期凋亡率均无明显差异(F=1.08,P=0.407;x2=4.345,P=0.114).结论 αA晶状体蛋白第45位、66位、122位丝氨酸位点模拟磷酸化能增强HLEC抗氧化能力及抗凋亡活性.
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应用串联质谱法对成年男性正常晶状体纤维进行蛋白质组分析
目的 建立成年男性正常晶状体纤维蛋白表达谱.方法 晶状体纤维总蛋白质通过聚丙烯酰胺凝胶电泳初步分离、胶内酶切后的多肽利用反相液相色谱串联质谱的方法,对成年男性正常晶状体中的全部纤维蛋白质进行鉴定.根据高丰度离子的匹配率、匹配离子的连续性和随机性评分,通过SEQUEST和AMASS软件筛选结果.同一样品重复进行3次实验,具有可信度＞98%、有2个或2个以上合格谱图、不少于2次实验均鉴定的蛋白质作为阳性结果.结果 实验室共鉴定60个蛋白质,有22个晶状体蛋白质在以前的晶状体蛋白质组研究中有过鉴定.结论 该研究建立了成年男性正常晶状体纤维蛋白质表达谱.聚丙烯酰胺凝胶电泳与液相色谱串联质谱相结合是简单、高灵敏度的蛋白质组学方法,适用于研究晶状体纤维的蛋白质随年龄及白内障形成过程中的变化.
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我国汉族常染色体显性遗传性白内障一家系的基因突变分析
目的 寻找一个我国汉族常染色体显性遗传性白内障家系的致病基因.方法 病例对照研究.收集家系的资料,用裂隙灯显微镜检查家系成员的晶状体;提取家系中参与研究的26名成员的基因组DNA,进行白内障致病基因(如晶状体蛋白基因和Cx基因等6个基因)外显子区域的突变扫描,用限制性片段长度多态性分析技术(PCR-RFLP)对检测到的突变进行验证,在42例年龄相关性白内障患者和204名正常人中检测是否存在已筛查到的突变.结果 疾病的表型为粉尘状核性白内障;在Cx50基因(GJA8)的编码核苷酸序列第827位发现一个C到T的新突变,导致在Cx氨基酸序列的276位出现一个丝氨酸到苯丙氨酸的改变,氨基酸由极性中性氨基酸变成疏水性的非极性氨基酸.在42例年龄相关性白内障患者和204名正常人中均未检测到这一突变,同时在晶状体蛋白和Cx基因上发现4个单核苷酸多态性位点.结论 在一个我国汉族显性遗传性白内障家系中发现一个GJA8基因的新突变(P.276 S＞F),可能是该遗传性白内障的致病基因突变.
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钝挫伤性白内障大鼠模型中晶状体可溶性蛋白和不可溶性蛋白分析及意义探讨
目的 研究大鼠慢性眼拍打伤后晶状体可溶性蛋白与不溶性蛋白的改变,并研究大鼠热休克或喂饲HSP70阻滞剂Quercetin后对钝挫伤性晶状体蛋白的影响.方法 实验研究.SpragueDawley (SD) 大鼠24只(24只眼),完全随机设计分成以下4组:A组(对照组):6只眼;B组(拍打组):6只眼,每次以20 g钢球20 cm高度拍打大鼠右眼100回,每周1次,连续5周;C组(热休克组):6只眼,温水浴(45℃)使大鼠体温提高至40.5～41.5℃ 8 min,常温下恢复2～3 h后拍打眼球同上.每周重复1次,连续5周;D组(Quercetin组):6只眼,喂饲大鼠Quercetin 100 mg/kg体重,2～3 h后拍打眼球同上.每周重复1次,连续5周.蛋白定量用Bradford法.对晶状体蛋白测定结果 ,采用完全随机设计的方差分析,并用q检验方法 进行组间两两比较.对透明晶状体和混浊晶状体蛋白测定结果 采用成组设计定量资料t检验进行分析.结果 拍打眼球5周后,热休克组的可溶性晶状体蛋白含量为22.71±1.99,较其他3组明显升高,差异有统计学意义(F=37.82,P＜0.01);拍打组的不可溶性蛋白含量为2.60±0.48,较其他3组高,差异有统计学意义(F=3.86,P＜0.05).可溶性晶状体蛋白的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析发现混浊晶状体眼在66 000处出现明显的高分子量蛋白带,随白内障程度增加更显著.结论 慢性拍打眼球可造成晶状体损伤,不可溶性蛋白含量增加.热休克可增加品状体可溶性蛋白含量,减少不可溶性蛋白.可溶性蛋白SDSPAGE分析结果 可以看出慢性拍打眼球引起晶状体蛋白质的变化向高分子蛋白移动.
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先天性白内障致病基因及其功能研究进展
先天性白内障是儿童主要的致盲性眼病之一,约1/3与遗传有关.迄今为止,与遗传性白内障相关的基因至少有22个:O个晶状体蛋白基因:RYAA、CRYAB、CRYBA1/A3、CRYBA4、CRYBB1、CRYBB2、CRYBB3、CRYGC、CRYGD、CRYGS;4个膜蛋白基因:JA3、GJA8、MIP、LIM2;3个发育及转录因子基因:ITX3、MAF、HSF4;2个细胞骨架蛋白基因:SFP1、BSFP2;1个染色质修饰蛋白-4β基因:HMP4B;1个酪氨酸激酶受体基因:PHA2,1个NHS基因,其中部分基因已经在细胞学水平和(或)动物模型的整体水平对其功能进行研究,这将有助于揭示先天性白内障的发病机制.
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异氟醚延迟预处理对兔心肌缺血再灌注时αB-晶状体蛋白表达的影响
目的 探讨异氟醚延迟预处理对兔心肌缺血再灌注时αB-晶状体蛋白表达的影响.方法 健康雄性新西兰大白兔30只,体重2.0～2.5 kg,随机分为3组(n=10):假手术组(S组)吸入纯氧2 h,24 h后仅动脉下穿线不结扎;心肌缺血再灌注组(IR组)吸入纯氧2 h,24 h后行心肌缺血再灌注;异氟醚延迟预处理组(Ⅰ组)吸入2%异氟醚2 h,24 h后行心肌缺血再灌注.采用结扎左冠状动脉前降支40min,再灌注120 min的方法制备心肌缺血再灌注模型.于再灌注120 min时采集动脉血样测定血清超氧化物歧化酶(SOD)活性,取心肌组织测定αB-晶状体蛋白及caspase-3的表达水平,计算心肌缺血面积和梗死面积,观察心肌细胞超微结构.结果 S组心肌细胞完整,排列整齐,线粒体形态正常,糖原丰富;IR组心肌细胞水肿,心肌纤维排列紊乱,线粒体、内质网膜肿胀,空泡化;Ⅰ组心肌细胞水肿程度减轻,心肌纤维排列较完整,线粒体轻度肿胀.与IR组比较,Ⅰ组心肌梗死面积减小,血清SOD活性升高,心肌caspase-3表达下调,αB-晶状体蛋白表达上调(P<0.05).结论 异氟醚延迟预处理减轻兔心肌缺血再灌注损伤的机制可能与上调心肌αB-晶状体蛋白表达有关.
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蓝光照射后视网膜αA-和αB-晶体蛋白表达变化
目的 观察蓝光照射后大鼠视网膜中αA-和αB-晶体蛋白的表达.方法 40只雌性Wistar大鼠随机分为正常对照组,蓝光照射6、12、24 h组共4组,每组10只.正常对照组不给予任何处理,蓝光照射6、12、24 h组分别给予蓝光照射6、12、24 h后给予12 h暗适应,麻醉后摘取眼球.采用免疫组织化学和蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测视网膜中αA-和αB-晶体蛋白表达.结果 免疫组织化学染色检测显示,正常对照组以及蓝光照射6、12、24 h组视网膜αA-晶体蛋白吸光度[A,旧称光密度(OD)]值分别为1.405 73±0.707 48、4.317 51±0.412 97、7.397 08±1.947 90、9.634 32±2.377 61,组间比较差异均有统计学意义(F=24.569,P<0.001).正常对照组以及蓝光照射6、12、24 h组视网膜αB-晶体蛋白A值分别为0.129 36±0.033 93、0.507 17±0.117 55、7.345 43±2.292 97、4.042 26±3.890 23,组间比较差异均有统计学意义(F=40.102,P<0.001).Western blot检测发现,蓝光照射6、12、24 h后视网膜αA-及αB-晶体蛋白表达明显高于正常对照组.结论 蓝光可诱导大鼠视网膜αA-晶体蛋白和αB-晶体蛋白表达上调.
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晶状体皮质诱导视网膜前新生血管膜形成的实验研究
目的 观察自体晶状体皮质与视网膜前新生血管膜形成的关系.方法 选择4～6周健康C57BL/6小鼠24只,随机分为实验组和对照组,每组各12只.实验组,采用微创方法穿破小鼠晶状体后囊膜,让其晶状体皮质缓慢释放入玻璃体腔内;对照组在不损伤晶状体的情况下,采用微创方法玻璃体腔内注射等量磷酸盐缓冲液(PBS).常规眼部检查和裂隙灯照相.在微创穿破晶状体后囊膜手术后第3、7、14、28 d,分别取眼球进行组织病理和免疫组织化学检查.结果 手术后1～3 d,12只实验眼中,11只眼晶状体相继发生不同程度的白色混浊;另1只眼到实验结束时,未发生晶状体混浊.手术后3 d,玻璃体腔内可见到游离的晶状体皮质碎片,向视网膜靠近,部分接触皮质的视网膜内界膜粗糙,连续性中断;7～14 d视网膜内邻近内界膜的毛细血管扩张、迁移呈泡状突破内界膜,形成视网膜前新生血管膜;28 d,视网膜前邻近的玻璃体腔内能见到厚壁的血管样结构.对照组均未见晶状体混浊和上述病理改变.结论 自体晶状体皮质能诱发视网膜前新生血管膜的形成.
关键词： 视网膜新生血管化/化学诱导 新生血管化 病理性/病理学 晶体蛋白质类
