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日蚀性黄斑部病变一例
患者女,27岁.2008年4月在阳台晾衣约30 min后觉双眼千涩,视物模糊,左眼明显,无明显眼前黑影及视物变形,未诊治.休息后视物模糊无缓解,6 d后厦门眼科中心就诊.眼部检查:视力:有眼0.6,左眼0.6,矫正均不能提高;双眼眼前节无异常.双眼眼底可见视盘边界清楚,色泽正常,视网膜血管形态比例正常,黄斑反光弥散,可见一圈反射轮,中央凹反光消失.
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蓝光诱导人视网膜色素上皮细胞分泌外泌体与核苷酸结合寡聚化结构样受体蛋白炎性体的相关性研究
目的 观察蓝光诱导人视网膜色素上皮(RPE)细胞外泌体对核苷酸结合寡聚化结构样受体蛋白(NLRP3)炎性体相关因子表达的影响.方法 人RPE细胞株贴壁细胞分为实验组和对照组.实验组细胞以蓝光照射6 h建立光损伤模型;对照组细胞常规培养.分级低温超速离心法获得两组细胞外泌体,透射电子显微镜观察其形态;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测两组细胞外泌体表面CD63及白细胞介素(IL)-1β、IL-18、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase-1)蛋白相对表达水平.将两组细胞外泌体作用于正常RPE细胞,据此分为蓝光诱导细胞外泌体+实验组、正常细胞外泌体+对照组.培养24 h后,Western blot检测两组细胞外泌体中IL-1β、IL-18、caspase-1蛋白表达;荧光实时定量聚合酶链反应检测两组细胞中NLRP3 mRNA表达.结果 实验组细胞发生损伤失去原有形态;外泌体均呈双凹托盘状,直径50~200 nm;实验组细胞外泌体中IL-1β(t=18.04)、IL-18(t=12.55)、caspase-1(t=14.70)蛋白表达量明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.001).蓝光诱导细胞外泌体+实验组细胞外泌体中IL-1β(t=18.59)、IL-18(t=23.95)、caspase-1(t=35.27)蛋白表达量明显高于正常细胞外泌体+对照组,差异均有统计学意义(P<0.001);蓝光诱导细胞外泌体+实验组、正常细胞外泌体+对照组细胞内NLRP3 mRNA相对表达量分别为1.000±0.069、0.200±0.010,两者比较,差异有统计学意义(t=12.20,P<0.001).结论 蓝光诱导RPE细胞外泌体可使RPE细胞内NLRP3炎性体相关细胞因子IL-1β、IL-18、caspase-1蛋白和NLRP3 mRNA表达上调.
关键词： 视网膜色素上皮/病理生理学 外泌体 炎性体 光刺激/副作用 -
小干扰RNA介导丝氨酸蛋白酶HtrA1沉默对光损伤人视网膜色素上皮细胞的影响
目的 观察丝氨酸蛋白酶HtrA1沉默对光损伤人视网膜色素上皮(RPE)细胞的影响.方法 体外培养人RPE细胞,取第8～12代生长良好的传代细胞用于实验.将细胞分为正常对照组、光损伤模型组.采用波长400 nm的蓝色节能灯以(2000±500) Lux持续光照RPE细胞6h建立光损伤模型.建模后光损伤模型组再分为针对HtrA1的小干扰RNA(HtrA1 siRNA)组、阴性对照组、空白对照组.应用脂质体RNAimax将HtrA1 siRNA转染至HtrA1 siRNA组细胞;阴性对照组细胞转染非特异的阴性siRNA;空白对照组为单纯光损伤细胞.采用细胞计数试剂盒、transwell小室法及流式细胞仪检测各组细胞增生、迁徙、凋亡以及细胞周期情况;实时聚合酶链反应和蛋白免疫印迹法检测细胞中HtrA1和血管内皮生长因子A(VEGF-A) mRNA、蛋白质表达.结果 光损伤模型组细胞中HtrA1 mRNA、蛋白表达均较正常对照组细胞明显升高,差异有统计学意义(t=17.62、15.09,P＜0.05).与阴性对照组、空白对照组比较,HtrA1 siRNA组细胞增生(t=6.37、4.52)、迁徙能力(t=9.56、12.13)、凋亡率(t=23.37、29.08)明显下降,差异有统计学意义(P＜0.05);细胞停留在G0/G1期数目增多(t=6.24、4.93),差异有统计学意义(P＜0.05);HtrA1、VEGF-A mRNA(t=17.36、11.32、7.29、4.05)和蛋白(t=12.02、15.28、4.98、6.24)表达均明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 特异性沉默HtrA1基因表达可降低蓝光对人RPE细胞增生、迁徙能力的损伤和细胞凋亡率;下调VEGF-A的表达.
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芬戈莫德对视网膜光损伤大鼠光感受器细胞及小胶质细胞的影响
目的 观察芬戈莫德(FTY720)对视网膜光损伤大鼠光感受器细胞及小胶质细胞的影响.方法 Sprague-Dawley大鼠120只随机分为正常组、模型组、溶媒组和FTY720组,每组30只.正常组大鼠不予处理;模型组、溶媒组和FTY720组大鼠建立光损伤动物模型.模型组大鼠仅接受光照.FTY720组大鼠建模前腹腔注射FTY720,溶媒组大鼠注射50％二甲基亚砜.光照后6h及1、3、7d,采用流式细胞仪检测大鼠小胶质细胞所占比例;酶联免疫吸附试验检测大鼠视网膜中白细胞介素(IL)-1β的含量.光照后1d,采用原位末端标记法检测光感受器细胞凋亡情况.光照后7d,采用苏木精-伊红染色观察大鼠视网膜形态结构.结果 大鼠视网膜中小胶质细胞所占比例及IL-1β含量均于光照后6h开始升高,光照后3d达高峰,光照后7d开始下降.光照后6h及1、3、7d,FTY720组大鼠视网膜中小胶质细胞所占比例及IL-1β含量较正常组升高,较模型组、溶酶组明显降低,差异均有统计学意义(P＜0.05).光照后1d,正常组、模型组、溶酶组及FTY720组大鼠视网膜凋亡细胞比例分别为0、(87.66±2.50)％、(86.00±2.44)％、(49.66±2.80)％.FTY720组大鼠视网膜凋亡细胞比例较正常组升高,较模型组、溶酶组明显降低,差异均有统计学意义(P＜0.05).光照后7d,正常组大鼠视网膜结构清晰,细胞排列整齐;溶酶组、模型组大鼠视网膜结构不清楚,细胞排列紊乱,外核层明显变薄;FTY720组大鼠视网膜结构清晰,外核层厚度较溶酶组、模型组厚,但薄于正常组.结论 FTY720能抑制视网膜光损伤大鼠光感受器细胞的凋亡及小胶质细胞的活化.
关键词： 光刺激/副作用 小神经胶质细胞/生理学 光感受器细胞/生理学 -
持续频闪光刺激对豚鼠视网膜电图及组织病理的影响
[目的]观察持续频闪光刺激对发育敏感期豚鼠视网膜组织及功能的影响.[方法]24只出生日龄14 d的豚鼠随机分为频闪组和对照组,每组均为12只.频闪组使用频闪调光器以0.5 Hz频率等时交替频闪,照度波动0～500 Lux；对照组给予500 Lux照明.2组均使用500 nm波长发光二极管,控制光照时间为昼夜12h轮替.实验第12周所有豚鼠行跟底彩色照相和闪光视网膜电图(F-ERG)检查.检查结束后摘除眼球,测量眼球水平径、垂直径及前后径3条径线,光学显微镜和透射电子显微镜观察眼球后极部结构改变.[结果]与对照组比较,频闪组豚鼠眼底漆裂纹样改变更为明显,ERG a波潜伏期延长;眼球水平径、垂直径及前后径分别较对照组增加(0.89±0.30)、(0.69±0.20)、(0.96±0.30)mm,差异有统计学意义(t=12.7、11.9、15.8,P＜0.05).光学显微镜观察发现,频闪组豚鼠巩膜纤维出现扩张；透射电子镜显微镜观察发现,视网膜感光细胞层外段排列稀疏紊乱并可见大量脱落外节盘膜.[结论]持续频闪光刺激会诱导豚鼠眼球产生过度发育,并会影响视网膜结构与传导功能.
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不同波长光照射对rd12和C57BL/6J小鼠视网膜光损伤的对比研究
目的 探讨不同波长光照射对rd12和C57BL/6J小鼠视网膜光损伤的影响.方法 取rd12和C57BL/6J小鼠各32只,随机分成对照组、白光组、中波长光(505 nm)组和短波长光(405 nm)组,各组光照强度为(800±130) Lux,每天照射12h,持续7d.于光照前1d和光照后1、4、7d进行视网膜电流图(ERG)检测,光照7d后通过活体组织氧化应激活性氧(ROS)高质荧光检测ROS水平,免疫荧光法和蛋白质免疫印迹法检测抗过氧化物酶6(PRDX6)的表达,测定半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)活性.结果 C57BL/6J小鼠ERG反应随光照时间延长振幅逐渐降低,短波长光组下降明显,光照后1、4、7d各组明视反应b波振幅率比较,差异均有统计学意义(F=4.412,5.082,9.980；P＜0.01).7d时对照组、白光组、中波长光组和短波长光组b波振幅率分别下降至(85±10)％、(70±19)％、(57±22)％、(46±19)％比较,其中,短波长光组与白光组比较,差异有统计学意义(t=3.19,P＜0.01).ROS含量测定显示,rd12小鼠各组ROS相对量比较,差异有统计学意义(F=16.08,P＜0.01),短波长光较其它组明显升高.PPDX表达比较,差异有统计学意义(F=7.214,P＜0.05).短波长光组较其它Caspase-3相对活性检测结果比较,差异有统计学意义(F=7.530,P＜0.05).C57BL/6J小鼠各组ROS含量、PRDX6蛋白及Caspase-3活性测定结果比较,差异均无统计学意义(F=3.625,1.993,1.133;P＞0.05).rd12与C57BL/6J小鼠各组比较,仅短波长光组Caspase-3相对活性检测结果差异有统计学意义(t=5.474,P＜0.05).结论 短波长光照射对小鼠视网膜具有损伤作用,其对rd12小鼠的影响较C57BL/6J小鼠显著.损伤机制可能与氧化损伤有关.
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光损伤后人视网膜色素上皮细胞血管内皮生长因子A及其受体的表达
目的 观察光损伤后人视网膜色素上皮(RPE)细胞血管内皮生长因子A(VEGF-A)及其受体可溶性fm样酪氨酸激酶受体(sFlt-1)和包含激酶植入区域受体(KDR)的表达.方法 体外培养人RPE细胞,取第8～12代生长良好的传代细胞用于实验.将同代细胞随机分为对照组和光损伤组.以18 W冷白色荧光灯作为光源,自制光照器.采用双层高压消毒锡纸包裹对照组细胞,与光损伤组细胞一同置于自制光照器下,控制光照强度在(2200±300) Lux,持续光照12 h建立光损伤模型.于光损伤后0、6、12、24 h终止培养,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测VEGF-A、sFlt-1及KDR的mRNA及蛋白表达.结果 光损伤组VEGF-A mRNA及蛋白表达在光损伤后6h时明显增加,12h时达到高峰,明显高于对照组(t=2.74,2.93;P＜0.05),随后降低.sFlt-1的mRNA及蛋白表达在光损伤后12h达到高峰,明显高于对照组(t=4.32,P＜0.01)；24 h时明显低于对照组(t=2.41,P＜0.05).KDR的mRNA及蛋白表达在光损伤后6、12 h时较对照组无明显变化(t=1.84,P＞0.05),24 h时高于对照组(t=2.89,P＜0.05).结论 光损伤后6、12h时,RPE细胞VEGF-A及sFlt-1的表达明显增高,KDR的表达相对稳定.光损伤后24 h时,RPE细胞VEGF-A及sFlt-1的表达降低,KDR的表达增高.
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蓝光照射后视网膜αA-和αB-晶体蛋白表达变化
目的 观察蓝光照射后大鼠视网膜中αA-和αB-晶体蛋白的表达.方法 40只雌性Wistar大鼠随机分为正常对照组,蓝光照射6、12、24 h组共4组,每组10只.正常对照组不给予任何处理,蓝光照射6、12、24 h组分别给予蓝光照射6、12、24 h后给予12 h暗适应,麻醉后摘取眼球.采用免疫组织化学和蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测视网膜中αA-和αB-晶体蛋白表达.结果 免疫组织化学染色检测显示,正常对照组以及蓝光照射6、12、24 h组视网膜αA-晶体蛋白吸光度[A,旧称光密度(OD)]值分别为1.405 73±0.707 48、4.317 51±0.412 97、7.397 08±1.947 90、9.634 32±2.377 61,组间比较差异均有统计学意义(F=24.569,P<0.001).正常对照组以及蓝光照射6、12、24 h组视网膜αB-晶体蛋白A值分别为0.129 36±0.033 93、0.507 17±0.117 55、7.345 43±2.292 97、4.042 26±3.890 23,组间比较差异均有统计学意义(F=40.102,P<0.001).Western blot检测发现,蓝光照射6、12、24 h后视网膜αA-及αB-晶体蛋白表达明显高于正常对照组.结论 蓝光可诱导大鼠视网膜αA-晶体蛋白和αB-晶体蛋白表达上调.
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蓝光诱导大鼠视网膜色素上皮细胞复制衰老
目的 探讨蓝光光照强度、时间与大鼠视网膜色素上皮(RPE)细胞复制衰老的关系.方法 将36只鼠龄12～14周的Wistar大鼠置于悬有波长为(450±10)nm的医用蓝光灯管的自制光照架中.随机分为4组,每组9只大鼠,1组:无光照对照组;2组:自然光照组;3组:500 lx光照组;4组:1000 lx光照组.每组按照照射时间再分为1、2、3个月组3个亚组,分别在1、2、3个月时行10%水合氯醛腹腔注射麻醉后取出眼球,将右眼球行石蜡切片,苏木精伊红(HE)染色;左眼球行冰冻切片,采用衰老相关β半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色方法观察RPE细胞染色阳性情况.采用SPSS 11.5统计软件对结果数据进行统计学分析.结果 不同光照强度组、不同光照时间组大鼠RPE细胞SA-β-Gal染色阳性细胞个数差异有统计学意义(F=510.309,55.016;P=0.000);组间两两比较,除1组与2组之间差异无统计学意义外(P=0.154),其它各组之间差异均有统计学意义(P=0.000).在单一光照强度条件下,除1组大鼠RPE细胞SA-β-Gal染色阳性细胞个数差异无统计学意义外(P=0.897),其余各组差异均有统计学意义(P＜0.01);在单一时间条件下,各组差异均有统计学意义(P=0.000).结论 同一蓝光光照强度下,随着时间的增加大鼠视网膜RPE细胞逐渐出现复制衰老改变;同一时间条件下,随光照强度增加大鼠视网膜RPE细胞也逐渐出现复制衰老改变.
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老龄多巴色素异构酶敲除小鼠视网膜色素上皮细胞中黑色素在视网膜光损伤过程中的作用
目的 观察视网膜色素上皮(RPE)细胞中黑色素含量与光感受器细胞功能之间的关系,探讨黑色素对视网膜光损伤的作用.方法 老龄多巴色素异构酶敲除小鼠(Dct-/-小鼠)和C57BL/6小鼠(野生型小鼠)各20只,分别为Det-/-/小鼠组和野生型小鼠组.采用临床电生理国际标准分别对各型鼠进行视网膜电图(ERG)检查,记录其大混合反应后各组随机处死2只小鼠,摘除眼球作为阴性对照.余下每组各18只小鼠,将6只小鼠用20 W冷荧光灯行12 h明、12 h暗、12 h明的间断光照36 h,连续3个循环.光照强度为(5000±356)lx.光照结束后第6天再次进行ERG检查,记录ERG结果.随机颈椎脱臼法处死每组各2只小鼠,摘除眼球.所有摘除眼球常规组织切片,光学显微镜、电子显微镜观察.结果 ERG检查结果显示,光损伤前后Dct-/-小鼠a、b波振幅明显低于野生型小鼠(t_(a波光照前)=-7.13,P＜0.01;t_(b波光照前)=-4.414,P＜0.01;t_(a波光照后)=-10.162,P＜0.01;t_(b波光照后)=-6.772,P＜0.01);光损伤后Dct-/-小鼠ERGa、b波的振幅下降幅度明显高于野生型小鼠(t_(a波)=4.975,P＜0.01;t_(b波)=2.908,P＜0.01).光损伤后,光学显微镜检查可见Dct-/-小鼠视网膜水肿、变薄,较野生型明显;电子显微镜检查可见RPE细胞中黑色素颗粒融解、断裂或丢失,光感受器细胞外节盘膜肿胀、碎裂及空泡变,Dct-/-小鼠损伤较野生型小鼠严重.结论 光损伤后RPE细胞黑色素含量减少,光感受器细胞功能下降,提示黑色素对光损伤可能有保护作用.
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670 nm近红外光对大鼠视网膜光损伤的保护作用
目的 观察670 nm近红外光对SD大鼠的视网膜光损伤模型是否具有保护作用. 方法将32只SD大鼠分成8组,1组为正常对照组;2组为红外光对照组;3、5、7组为光损伤组;第4、6、8组为光损伤加近红外光保护组.光损伤剂量为900,1800,2700 lx白光,持续照射3 h;在光损伤前3 h和光损伤后0、24、48 h,保护组先后4次给予50 mW近红外光照射30 min.光损伤后第5天将大鼠置于暗室过夜,第6天作视网膜电图(ERG)检测,并取眼球作病理检查. 结果 1组和2组视网膜细胞结构正常,外核层细胞约11层,ERG b波振幅(1088±55)μV.3组和4组900 lx白光持续照射3 h,未造成大鼠视网膜的损伤.5组1800 lx白光持续照射3 h,外核层细胞的减少至1～2层,内节(IS)与外节(OS)结构完全消失;损伤范围占全视网膜的0.48±0.12,损伤厚度占外核层全厚的L5=0.39±0.07,ERG的b波低伏(431±120) μV.6组在1800 Lux白光照射前后实施近红外光保护,视网膜损伤范围缩小为Ms=0.17±0.12,(P5/6=0.002);损失厚度减少到L6=0.22±0.09(P5/6<0.01);ERG b波振幅升高到(1011±83) μV(P5/6<0.001;).2700 lx白光持续照射3 h,7组和8组病理和ERG检查的差异均无统计学意义[损伤面积:M7=0.83±0.09,Ms=0.70±0.10,P7/8=0.074;损伤厚度L7=0.81±0.08,L8=0.73±0.08,P=0.17;ERG:H7=(234±26) μV,Hs=(253±29)μV,P7/8>0.05]. 结论 在一定的照射强度和时间范围内,670 nm近红外光对大鼠视网膜光损伤有明确的保护作用.
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银杏叶提取物对大鼠视网膜光损伤后感光细胞的保护作用
目的 探讨银杏叶提取物(EGb761)对视网膜光损伤后感光细胞的保护作用. 方法 72只Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为正常对照组、模型组、模型+生理盐水组和模型+EGb 761组,每组各18只大鼠.模型组、模型+生理盐水组和模型+EGb 761组暗适应24 h后持续光照6 h,光照强度为(2740±120)lx,建立光损伤模型.模型+EGb 761组和模型+生理盐水组分别于光照前7 d每日腹腔注射0.35% EGb 761(100 mg/kg)和相应体积的生理盐水,光照后继续给药14 d;于光照后4 d对各组进行视网膜原位凋亡细胞检测,并于光照后7、14 d作组织病理学检查并计数视盘上、下方视网膜外核层(ONI)感光细胞层数. 结果 光照后4 d,除正常对照组外,其余各组ONL均出现凋亡感光细胞,但模型+EGb 761组ONL凋亡感光细胞数明显少于模型组和模型+生理盐水组.光照后7 d,模型组和模型+生理盐水组感光细胞核层数均为3～4层,模型+EGb 761组为7～8层;模型+EGb 761组平均感光细胞核层数(6.92±0.82)少于正常对照组(8.40±0.95)(t=-1.416,P<0.05),但显著多于模型组(5.96±1.36)和模型+生理盐水组(5.90±1.40)(t=1.024,1.084;P<0.05).光照后14 d,模型组和模型+生理盐水组感光细胞核为0～1层,而模型+EGb 761组仍存有3～4层;模型+EGb 761组平均感光细胞核层数(5.52±1.06)仍显著多于模型组(3.44±2.15)和模型+生理盐水组(3.37±1.91)(t=2.082,2.146;P<0.05). 结论EGb 761能部分抑制视网膜光损伤后感光细胞凋亡,对感光细胞具有一定的保护作用.
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辅酶Q10对大鼠视网膜光损伤的防护作用研究
目的 观察辅酶Q10对实验性大鼠视网膜光损伤的防护作用及其机制. 方法 30只Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为正常对照组、阳性对照组、辅酶Q10组等3组,用(2000±120)lx绿色荧光灯对SD大鼠进行24 h持续照射,建立视网膜光损伤模型.于光照前24 h、30 min分别通过阳性对照组和辅酶Q10组大鼠尾静脉注射生理盐水和辅酶Q10.光照后第1天常规摘除眼球,光学和电子显微镜观察视网膜组织病理学改变;流式细胞术检测视网膜细胞凋亡率.结果 组织病理学检查显示,辅酶Q10组外核层排列整齐,仅见少量凋亡细胞,内、外节轻度水肿,与阳性对照组比较,光损伤后的组织病理改变明显减轻;流式细胞术检测显示,正常对照组视网膜细胞凋亡率为(1.65±1.48)%,阳性对照组为(25.83±2.92)%,辅酶Q10组为(12.43±2.25)%.阳性对照组视网膜细胞凋亡率较正常大鼠视网膜明显升高(t=18.28,P＜0.01),辅酶Q10组的视细胞凋亡率较阳性对照组明显降低(t=9.07,P＜0.01).结论 辅酶Q10对光损伤引起的视网膜损害及视细胞凋亡有较好的防护作用.
