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重组腺相关病毒介导人端粒酶逆转录酶基因转染对人髓核细胞功能的影响
目的:研究重组腺相关病毒介导人端粒酶逆转录酶基因(recombinant adenoassociated virus vector-mediated human telomerase reverse transcriptase,rAAV-hTERT)转染对体外培养人髓核细胞功能的影响.方法:利用机械与酶消化的方法获得均一性的人椎间盘髓核细胞,将构建好的rAAV-hTERT转染P2代体外单层培养的髓核细胞.用重组腺相关病毒-增强型绿色荧光蛋白(recombinant adenoassociated virus vector-mediated enhanced green fluorescent protein,rAAV-EGFP)作为标记基因观察细胞转染效率,按感染复数(multiplicity of infection,MOI) 103、104、105病毒基因组拷贝数/细胞(vector genomes/cell,v.g/cell)设组,流式细胞仪检测,筛选病毒转染的佳MOI;设立rAAV-hTERT转染组、AAV空病毒转染组及空白细胞对照组,用反转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reareaction,RT-PCR)及免疫印迹(Western-blot)方法检测rAAVhTERT转染后hTERT基因在髓核细胞内的表达,实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative PCR)及酶联免疫法(enzyme linked immunosorbent,ELISA)检测髓核细胞合成Ⅱ型胶原及蛋白多糖能力的变化.结果:rAAV-EGFP转染细胞后第7天时,MOI为105 v.g/cell组转染效率可达73.9％,明显高于MOI 103、104 v.g/cell组(P＜0.05)；rAAV-hTERT转染组在转染后的第7、60、90、120天均可检测到hTERT基因的表达,而其他两组则无表达；转染rAAV-hTERT后120d之前,rAAV-hTERT转染组分泌蛋白多糖及Ⅱ型胶原较其他两组均明显增高(P＜0.05),而两对照组之间则始终无明显差异(P＞0.05).结论:rAAV-hTERT能成功转染人椎间盘髓核细胞并正确表达,rAAV-hTERT转染能有效延长髓核细胞分泌Ⅱ型胶原及蛋白多糖功能.
关键词： 髓核细胞 腺相关病毒 人端粒酶逆转录酶基因 基因治疗 -
人端粒酶逆转录酶基因的短发夹状RNA对卵巢上皮性癌细胞端粒酶的抑制作用
人端粒酶由RNA模板(hTR)、相关蛋白(hTP)和人端粒酶逆转录酶亚基(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)组成,其中hTERT是端粒酶激活的关键限速步骤.
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hTERT启动子调控的野生型p53基因对膀胱癌细胞的靶向性抑制作用
目的:探讨人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)启动子调控的野生型p53基因的靶向性表达,观察对人膀胱癌细胞株T24的选择性杀伤效应及细胞凋亡的影响.方法:采用脂质体转染法,将构建的含hTERT启动子调控表达人野生型p53基因和报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的质粒,分别转染膀胱癌细胞株T24和正常人胎肺成纤维细胞,应用荧光显微镜、电镜、台盼蓝拒染法及流式细胞仪等方法,观察基因的靶向性表达及对膀胱癌细胞株T24细胞形态学、生长抑制曲线及细胞周期变化的影响.结果:转染hTERT启动子调控的目的基因可在端粒酶阳性的膀胱肿瘤细胞中靶向性表达发出绿色荧光.靶向转染野生型p53基因能抑制膀胱癌细胞生长,72 h后细胞生长抑制率分别为48.5%、高于常规培养组3.6%和阴性对照组2.5%,差异有显著性意义(P＜0.05).电镜可见典型的凋亡细胞.细胞周期分析G0和G1期细胞比例明显增高,并出现凋亡峰.结论:构建的hTERT启动子调控表达的野生型p53基因能通过诱导肿瘤细胞凋亡而发挥靶向性抑制膀胱癌细胞生长作用.
关键词： 膀胱肿瘤 人端粒酶逆转录酶基因 基因疗法 -
人端粒酶逆转录酶基因启动子区CpG岛甲基化在儿童白血病中的意义
目的 探讨人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transeriptase,hTERT)基因启动子区CpG岛甲基化及甲基化位点与儿童白血病临床特征的相关性.方法 收集儿童白血病患者173例(Leu组),根据白血病亚型不同分为:急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)94例、急性髓细胞白血病(acute myelocytic leukemia,AML)52例、慢性粒细胞白血病(chronic granulocytic leukemia,CML)19例及复发难治的白血病(acute leukemia,AL)8例(ALL 5例,AML 3例),以非恶性血液病(NL组)42例作为对照.分离患者外周血单核细胞,提取基因组DNA,经甲基化修饰试剂盒修饰后,采用甲基化特异性-PCR(methylation specific-PCR,MS-PCR)法分别检测Leu组、NL组患者外周血标本单个核细胞中hTERT基因启动子区两个CpG岛不同位点甲基化情况,并分析其与儿童白血病临床特征的相关性.结果 hTERT基因启动子区CpG岛在NL组呈完全非甲基化,在复发难治的白血病组呈甲基化状态.NL组外周血中hTERT基因启动子区2号CpG岛(-2016 ～-1532和-1415 ～-1151)呈完全非甲基化状态,而Leu组呈甲基化状态,且甲基化更易发生在1号和2号(-2016～-1532)位点,但hTERT基因启动子区l号CpG岛甲基化在NL组和Leu组中差异无统计学意义(P＞0.05).hTERT基因启动子区甲基化与患者年龄、外周血白细胞数、免疫分型、细胞遗传标志及危险分级相关(P＜0.05),与患者性别、融合基因无关(P＞0.05).结论 儿童白血病患者hTERT基因启动子区CpG岛易发生甲基化,与甲基化位点分布相关,对儿童白血病的诊断具有重要意义.
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电穿孔法提高hTERT转染原代培养乳鼠心肌细胞效率的研究
目的 探讨提高人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)转染原代培养乳鼠心肌细胞效率的有效方法.方法 通过测量悬浮心肌细胞的半径,估计电击穿时临界电压的范围.以钙黄素为报告分子,确定佳可逆性电击穿时电压范围.进而用pAdtrack-GFP-hTERT对乳鼠心肌细胞进行转染,并通过绿色荧光蛋白(GFP)的表达比较电穿孔、Lipofectamine 2000和Top Easy 3种转染方法对hTERT的转染效率.结果 电压170～200 V,波宽2 ms左右,间隔125 ms,脉冲4～6个时,pAdTrack-GFP-hTERT可有效转染乳鼠心肌细胞,转染率高达7.5%,而Lipofectamine 2000法和Top Easy法转染率均为0(P＜0.01).结论 利用电穿孔技术可将hTERT长cDNA片段导入原代培养的乳鼠心肌细胞.
关键词： 电穿孔法 人端粒酶逆转录酶基因 基因转染 心肌细胞 -
RNA干扰人端粒酶逆转录酶基因对膀胱尿路上皮癌BIU-87细胞株端粒酶活性抑制的研究
目的:探讨RNA干扰技术使人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因沉默,对膀胱尿路上皮癌BIU-87细胞株端粒酶活性的抑制作用.方法:针对hTERT基因设计构建多种siRNA表达载体,并转染至膀胱肿瘤BIU-87细胞,通过实时荧光定量、单四唑(MTT)检测端粒酶活性,观察siRNA表达载体对hTERT基因表达的影响.结果:实时荧光定量和MTT检测证明,所构建的载体能导致不同程度的hTERT基因沉默,并成功地抑制BIU-87细胞的生长.结论:RNA干扰膀胱尿路上皮癌细胞(BIU-87)端粒酶hTERT基因,能影响端粒酶基因的表达,为进一步研究端粒酶活性在膀胱尿路上皮癌中的作用奠定了基础.
关键词： RNA干扰 人端粒酶逆转录酶基因 端粒酶 膀胱尿路上皮癌 -
hTERT与胃癌的研究进展
??胃癌在世界范围内是一种常见的严重危害人类健康的恶性肿瘤，其发生被认为是一个长期、渐进的过程。胃癌的发病机制至今仍未阐明，目前为大多数人所接受的胃癌发展演变模式为：正常胃黏膜向浅表性胃炎发展，再进一步发展为萎缩性胃炎以及肠化生和异型增生，后发展成胃癌。在这个过程中，多数学者认为肠化生和异型增生是胃癌的癌前病变［1］。越来越多的学者通过研究表明，在大多数肿瘤中都可观察到人端粒酶逆转录酶基因（hTERT）的表达水平与端粒酶活性成一致性，而这一发现被认为是肿瘤发生所必须的［2］。与大多数肿瘤类似，有报道表明胃癌组织中端粒酶阳性表达率高达80%~90%［3］，由此推测hTERT有可能成为胃癌临床诊断的特异性肿瘤标记物。
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人端粒酶逆转录酶反义寡核苷酸联合顺铂对HL-60细胞增殖及凋亡的影响
目的:研究人端粒酶逆转录酶基因反义寡核苷酸(ASODN)联合顺铂(CDDP)对HL-60细胞的增殖抑制及凋亡诱导作用.方法:选用20 μmol/L ASODN和正义寡核苷酸(SODN)封闭HL-60细胞hTERT基因的表达,作用48 h后加用2.5 μmol/L,5 μmol/L CDDP,继续作用于HL-60细胞48 h;台盼蓝拒染法检测各组细胞的增殖抑制情况,姬姆萨染色后倒置显微镜观察凋亡细胞形态;分别采用流式细胞仪、TUNEL法检测细胞凋亡.结果:hTERT ASODN联合CDDP组HL-60细胞的增殖明显抑制,与hTERT SODN联合CDDP组、单用CDDP组比较差异有统计学意义(P<0.05);hTERT ASODN联合5 μmol/L CDDP与hTERT ASODN联合2.5 μmol/L CDDP比较差异有统计学意义(P<0.05);而SODN联合CDDP与单用CDDP比较,差异无统计学意义(P>0.05).姬姆萨染色后,hTERT ASODN联合CDDP组可见大量凋亡小体,而单用CDDP组仅见少量凋亡小体.流式结果与TUNEL结果一致:hTERT ASODN联合CDDP组对HL-60细胞具有明显诱导凋亡作用,同其余各组比较差异有统计学意义(P<0.05);而SODN联合CDDP组与单用CDDP组比较,差异无统计学意义(P>0.05).结论: hTERT ASODN联合低浓度CDDP能明显抑制HL-60细胞的增殖,并提高细胞凋亡率.
关键词： HL-60细胞 人端粒酶逆转录酶基因 反义寡核苷酸 顺铂 凋亡 -
细胞核增殖抗原启动子调控荷载双基因RNA干扰的条件增殖腺病毒的构建
目的 构建细胞核增殖抗原(Ki-67)启动子调控表达Ki-67基因和人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因小干扰RNA(siRNA)的条件增殖腺病毒.方法 (1)合成hTERT-siRNA插入pSilencer3.1,构建pShTERTsiRNA质粒.(2)分别酶切Ki-67启动子质粒pZKi-67、Ki-67-siRNA质粒pZD55-Ki-67-siRNA,获得Ki-67启动子片段和Ki-67-siRNA片段并连接,构建质粒pZKi-67-ZD-Ki-67-siRNA.(3)以pShTERT-siRNA为模板,PCR获得hTERT-siRNA及H1启动子片段,克隆进pZKi-67-ZD-Ki-67-siRNA,构建质粒pZKi-67-ZD-Ki-67-siRNA-hTERT-siRNA.(4)将其与腺病毒骨架质粒pBHGE3共转染293细胞,9 ～12d后出现病毒空斑.提取重组腺病毒DNA,行聚合酶链反应(PCR)鉴定.结果 病毒ZKi-67-ZD-Ki-67-siRNA-hTERT-siRNA构建成功,其包含Ki-67启动子、Ki-67-siRNA、hTERT-siRNA 片段.结论 成功构建Ki-67启动子调控荷载Ki-67、hTERT双基因RNA干扰的条件增殖腺病毒,为研究靶向肿瘤治疗奠定基础.
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人端粒酶逆转录酶基因沉默对肺腺癌细胞侵袭、增殖、凋亡的影响
目的:探讨靶向人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的小干扰RNA(siRNA)转粢对肺腺癌细胞株A549生物学行为的影响.方法:构建靶向hTERT的siRNA表达质粒转染A549细胞,通过Western blot检测蛋白的表达水平,确定有效后,通过Transwell小室检测细胞体外侵袭能力,MTT法检测细胞增殖活性,流式细胞术测定转染后肿瘤细胞的细胞周期和凋亡率.结果:成功构建靶向hTERT的siRNA表达质粒.实验组siRNA转染后的细胞侵袭能力较对照组减弱(P<0.01),生长抑制率明显高于阴性对照组(P<0.01),且表现出时间依赖性.流式细胞术测定显示,实验组siRNA转染48 h后,肿瘤细胞凋亡率显著增加(P<0.01).结论:靶向hTERT的siRNA转染后可以显著降低A549细胞侵袭能力,抑制增殖,诱导细胞凋亡的发生.
关键词： 腺癌 基因沉默 人端粒酶逆转录酶基因 生物学 -
人端粒酶逆转录酶基因小片段干扰RNA慢病毒表达载体的构建及其在子宫颈癌caski细胞的表达
目的 构建及鉴定携带沉默人端粒酶逆转录酶基因(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)慢病毒(lentivirus,LV)表达载体,并观察其在子宫颈癌caski细胞的表达情况.方法 以Designer3.0(Genepharma)软件设计靶向hTERT基因特异性的小片段RNA(shRNA)干扰序列,将hTERT-shRNA基因片段插入重组慢病毒pGLV3/H1/GFP+Pum,构建慢病毒表达质粒LV3-shRNA-hTERT,酶切、DNA测序验证hTERT片段准确性.LV3-shRNA-hTERT与包装质粒共转染293T细胞,浓缩上清液并测定病毒滴度获得重组慢病毒后感染caski细胞.将细胞分为空白对照组(未感染病毒的caski细胞)、阴性对照组(感染空载病毒LV3-shNC的caski细胞)和hTERT干扰组(感染携带LV3-shhTERT慢病毒的caski细胞).绿色荧光蛋白(GFP)的表达判断转染结果并估计转染效率,流式细胞术仪检测病毒感染率,实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)检测转染后基因hTERT mRNA的表达情况,CCK-8法检测caski细胞增殖情况.结果 将目的序列成功连接到载体上,并经测序分析证实载体构建成功;成功包装成高滴度的慢病毒,且能有效感染子宫颈癌caski细胞.荧光定量PCR检测结果证实构建的hTERT-小片段干扰RNA慢病毒表达载体可显著抑制hTERT基因的表达.hTERT干扰组细胞增殖受抑制,生长速度较阴性对照组生长缓慢.结论 成功构建了携带hTERT-shRNA慢病毒表达载体LV3-shRNA-hTERT,并稳定转染子宫颈癌caski细胞.该载体能够有效抑制hTERT的表达,使子宫颈癌caski细胞增殖缓慢,为进一步探讨hTERT基因在子宫颈癌的发病机制和体外基因干预治疗奠定基础.
关键词： 子宫颈肿瘤 人端粒酶逆转录酶基因 慢病毒载体 小片段RNA CasKi细胞 -
靶向人端粒酶逆转录酶基因小片段干涉RNA慢病毒表达载体的构建与鉴定
目的 通过构建靶向人端粒酶催化亚基人端粒酶逆转录酶基因(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)RNA干涉(RNA interference,RNAi)慢病毒载体,获得可供转染的滴度,为进一步研究该基因缺陷在真核细胞中的影响提供物质基础.方法 根据hTERT设计的两条互补的单链寡核苷酸退火后形成双链插入到pLVTHM质粒,生成含RNAi盒的载体,然后与pCMV-dR8.74和pMD2G病毒包装所必须的元件经脂质体导入T293细胞,包装成慢病毒,收集上清浓缩病毒并检测其滴度.所得病毒感染U87胶质瘤细胞,逆转录PCR和端粒重复序列扩增法(telomeric repeat amplification protocol,TRAP)检测干扰后细胞内hTERT表达变化及端粒酶表达变化,流式细胞仪检测细胞凋亡.结果 将目的序列成功连接到载体上,并经测序分析证实载体构建成功;成功包装成高滴度的慢病毒.逆转录PCR和TRAP检测结果证实构建的hTERT-小片段干涉RNA(small interference RNA,siRNA)慢病毒表达载体可显著抑制hTERT基因的表达和端粒酶活性并导致细胞凋亡.结论 成功构建了携带靶向hTERT基因的RNAi慢病毒载体.该载体能够有效抑制hTERT的表达和端粒酶活性并导致细胞凋亡,为以hTERT为靶点的胶质瘤基因治疗的后续研究奠定基础.
关键词： 慢病毒 人端粒酶逆转录酶基因 RNA干涉 -
携带hTERT基因的重组慢病毒载体的构建及鉴定
目的 构建携带人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的重组慢病毒载体,并鉴定其在HeLa细胞中的表达.方法 采用Gateway技术使克隆载体pENTR221-hTERT与慢病毒表达载体pLenti6.3/V5-DEST进行重组反应,构建重组慢病毒载体pLenti6.3/V5-hTERT;将重组慢病毒载体与病毒包装质粒混合物pLP1、pLP2和pLP/VSVG共转染人胚肾293FT细胞,制备重组慢病毒颗粒;将重组慢病毒感染HeLa细胞,利用杀稻瘟菌素筛选阳性细胞克隆,PCR法检测外源hTERT基因在阳性细胞中的染色体整合状况,RT-PCR检测重组慢病毒感染对细胞hTERT基因mRNA表达的影响.结果 经鉴定,重组慢病毒载体pLenti6.3/V5-hTERT携带hTERT基因,hTERT基因包装至病毒颗粒.重组慢病毒感染HeLa细胞后,得到具有杀稻瘟菌素抗性的细胞克隆,其染色体DNA整合有外源hTERT基因,细胞内hTERT基因mRNA的表达水平高于未感染慢病毒的对照细胞.结论 成功构建了携带hTERT基因的重组慢病毒载体,能够提高HeLa细胞hTERT基因mRNA的表达量.
关键词： 人端粒酶逆转录酶基因 重组慢病毒 共转染
