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硫酸软骨素酶ABC及Nogo-66受体拮抗剂联合鼠胚神经干细胞移植对大鼠脊髓损伤的影响
目的:研究硫酸软骨素酶ABC (chondroitinase ABC,ChABC)、Nogo-66受体拮抗剂[Nogo-66 (1-40)antagonist peptide,NEP1-40]及鼠胚神经干细胞(neural stem cells,NSCs)联合移植对大鼠损伤脊髓功能恢复的影响.方法:体外应用全反式维甲酸(all-trans-retinoic acid,ATRA)(浓度1.0μmol/L)诱导NSCs(前期实验分离、培养并冻存的鼠胚NSCs),诱导后鉴定NSCs特异性标志物,移植前通过5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxyUridine,Brdu)标记NSCs.将60只SD大鼠随机分为假手术组(A组,n=10)、损伤对照组(B组,n=10)、NSCs治疗组(C组,n=10)、NSCs联合ChABC治疗组(D组,n=10)、NSCs联合NEP1-40治疗组(E组,n=10)、NSCs联合ChABC和NEP1-40治疗组(F组,n=10).移植前分别对B、C、D、E及F组的大鼠制作胸段脊髓全横断损伤模型.术后3d,E和F组经留置的导管注入NEP1-40 20μl/d,连续28d;术后8d,C、D、E及F组经留置导管注入经ATRA干预和BrdU标记的NSCs 10μl;术后8d,D组和F组经留置导管注入ChABC 10μl/d,连续7d;各时间点通过留置导管注入生理盐水保持各组移植液等量.术前及术后不同时间点,用BBB评分和体感诱发电位(somatosensory evoked potentials,SEP)潜伏期对大鼠后肢神经功能进行评价.移植后8周通过HE染色观察损伤脊髓组织情况,免疫荧光染色观察移植NSCs存活、神经元分化及轴突生长情况.结果:体外应用1.0μmol/L的ATRA诱导NSCs培养,可提高NSCs向神经元分化的比例.移植后2周开始各组大鼠BBB评分、SEP潜伏期开始观察到改善,移植治疗各组均优于损伤对照组,组间BBB评分和SEP潜伏期有差异(P＜0.05);移植后2周、5周、8周各时间点,B组与C、D、E及F组比较,BBB评分和SEP潜伏期较差(P＜0.05);在移植治疗各组中,F组神经功能的恢复明显,F组与C、D及E组比较具有较高的BBB评分和较短SEP潜伏期(P＜0.05).移植后8周,HE染色显示:A组细胞结构完整、排列规则;B组组织结构严重破坏,细胞排列紊乱,见大量较大的囊腔及胶质瘢痕形成;C、D、E及F组细胞增生明显,囊腔较少.免疫荧光染色显示:C、D、E及F组内可见橘红色Brdu标记阳性细胞,F组阳性细胞数多于C、D和E组,差异具有统计学意义(P＜0.05).C、D、E、F组微管相关蛋白-2(microtubule-associated protein 2,MAP-2)标记阳性细胞数多于B组,F组多于C、D、E组,差异有统计学意义(P＜0.05);C、D、E、F组MAP-2标记阳性细胞面积大于B组,F组大于C、D、E组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:ATRA诱导后NSCs移植可促进大鼠脊髓损伤功能的恢复,且联合ChABC和NEP1-40移植对损伤脊髓功能的恢复具有协同促进作用.
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硫酸软骨素酶ABC对大鼠急性脊髓损伤后神经中丝和胶质纤维酸性蛋白的影响
目的:探讨硫酸软骨素酶ABC(ChABC)对大鼠急性脊髓损伤后神经中丝200(NF200)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的影响.方法:SD大鼠72只,雌雄不限,随机分为假手术组(A组)、损伤对照组(B组)和ChABC治疗组(C组),每组24只.A组仅打开椎板及置管,不损伤脊髓,不给药;C组和B组均采用Allen's法制作大鼠T10脊髓损伤模型,分别在伤后即刻和随后每天1次连续1周蛛网膜下腔注射ChABC(6μl/次)和等量生理盐水.术后1d、1周、2周和4周每组各处死6只大鼠,B组和C组以损伤区为中心、A组在相应部位切取1cm长的脊髓组织,以HE染色观察脊髓组织形态变化,应用免疫组化方法检测脊髓组织中NF200和GFAP的变化.结果:HE染色示A组脊髓无胶质细胞增生和胶质瘢痕形成;B、C组脊髓损伤区有胶质细胞增生和胶质瘢痕,C组明显少于B组.A组术后1d、1周、2周和4周时NF200阳性细胞数及灰度值和GFAP染色阳性面积无差异,1、2、4周时B、C组脊髓损伤区NF200染色阳性细胞数及灰度值和GFAP染色阳性面积均较A组显著增加(P＜0.05或P＜0.01),1d和1周时C组NF200染色阳性细胞数及灰度值与B组比较无显著性差异,2周和4周时C组明显高于B组(P＜0.05);1d、1周和4周时C组GFAP染色阳性面积与B组无显著性差异,2周时C组显著小于B组(P＜0.05).结论:ChABC能提高大鼠急性脊髓损伤后神经细胞内NF200的表达并抑制GFAP的表达,进而促进神经细胞的修复,抑制胶质细胞的增生和胶质瘢痕的形成,对脊髓损伤具有保护作用.
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硫酸软骨素酶ABC-PLGA缓释微球处理去细胞同种异体神经移植修复大鼠坐骨神经
目的 探讨硫酸软骨素酶ABC(chondroitinase ABC,ChABC)-聚乳酸-聚乙醇酸共聚物缓释微球处理改良化学法去细胞同种异体神经移植修复大鼠坐骨神经的可行性.方法 用复乳法制备硫酸软骨素酶ABC-聚乳酸-聚乙醇酸共聚物缓释微球.取成年雄性SD大鼠40只,随机分为4组(n=10):硫酸软骨素酶ABC-聚乳酸-聚乙醇酸共聚物缓释微球处理改良化学法去细胞同种异体神经移植组(A组)、自体神经移植组(B组)、改良化学法去细胞同种异体神经浸泡ChABC神经移植对照组(C组)、改良化学法去细胞同种异体神经移植09％氯化钠注射液对照组(D组).取A、C、D3组动物人工切取右侧坐骨神经10 mm,用改良化学法制备移植神经段:A、C两组浸泡在PBS液中,D组浸泡在含2 U/ml ChABC的PBS液(pH7.4)中.A组动物取C组制备神经行同种异体神经移植,外膜无张力缝合,并在移植神经段距近心端缝合处2 mm、4 mm、6 mm、8 mm处分别注入0.2 μl制备好的硫酸软骨素酶ABC-PLGA缓释微球.B组在右侧离断10 mm坐骨神经倒置后行外膜缝合.C组取D组制备神经行神经移植.D组取A组制备神经行神经移植后,按照A组的位置注入等量等渗0.9％氯化钠注射液.术后4、8、12周进行大体标本观察,术后12周行电生理检测、HE染色、镀银染色及电镜组织学检测、图像分析对比.结果 制备所得硫酸软骨素酶ABC微球表面光滑,球体大小各异且均匀,无粘连及成簇等现象,Weibull方程曲线显示硫酸软骨素酶ABC微球体外释药稳定.采用硫酸软骨素酶ABC-聚乳酸-聚乙醇酸共聚物缓释微球处理改良化学法去细胞同种异体神经移植能够促进大鼠神经缺损处的轴突再生,提高神经修复的速度和质量,再生神经直径较粗,粘连较轻,电生理检测和组织学观察显示各项指标均优于两对照组,且较两对照组修复效果更接近于自体神经移植.结论 硫酸软骨素酶ABC-聚乳酸-聚乙醇酸共聚物缓释微球处理改良化学法去细胞同种异体神经移植可以修复大鼠神经损伤.
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硫酸软骨素酶ABC对大鼠脊髓损伤后硫酸软骨素蛋白多糖与生长相关蛋白43表达的影响
目的:探讨硫酸软骨素酶ABC对严重的大鼠脊髓损伤蛋白多糖及生长相关蛋白43(GAP-43)基因表达的影响.方法:制作大鼠脊髓横断伤模型,分为脊髓损伤组和脊髓损伤治疗组,给于治疗组硫酸软骨素酶ABC鞘内注射,用免疫荧光组织化学观察硫酸软骨素蛋白多糖(CSPGs)的表达,半定量RT-PCR、Western印迹法观察GAP-43 mRNA及蛋白的表达.结果:治疗组与损伤组比较,CSPGs的表达减少,差异具有显著性,而GAP-43mRNA及蛋白表达增多.结论:硫酸软骨素酶ABC能够裂解CSPGs,改善脊髓损伤区的微环境,促进GAP-43mRNA及蛋白的表达,是修复脊髓损伤和促进神经再生的机制之一.
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硫酸软骨素酶ABC治疗减少大鼠脊髓损伤引起的酪氨酸蛋白激酶A4的表达
本研究旨在探讨大鼠脊髓损伤(spinal cord impairment,SCI)后硫酸软骨素酶ABC (chondroitinase ABC,ChABC)对酪氨酸蛋白激酶A4 (ephrin A4,EphA4)表达变化的影响.选取成年雌性SD大鼠,随机分为假手术组、生理盐水(NS)组和ChABC组.NS组和ChABC组大鼠行脊髓半切损伤术,并通过蛛网膜下腔分别注射NS和ChABC;假手术组仅接受背部切开术,没有半切脊髓.SCI后1、3、7、14、21 d取损伤段脊髓样品,采用免疫荧光染色和免疫印迹检测各组EphA4表达；SCI后3d采用免疫荧光双标法检测损伤段脊髓内生长相关蛋白-43 (growth associated protein 43,GAP-43)和胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)的表达情况.结果显示,术后1、3、7d,NS组EphA4阳性神经元数明显少于假手术组(P＜0.01),而术后14、21 d,ChABC组和NS组EphA4阳性神经元多于假手术组(P＜0.05).值得注意的是,在术后各时间点,ChABC组EphA4阳性神经元数均明显低于NS组(P＜0.01).免疫印迹结果与免疫荧光术所得结果一致.术后3d,各组GFAP标记胶质细胞数之间相比较,假手术组多,NS组次之,ChABC组少；另外,各组均未出现GAP-43阳性神经元.以上结果提示,SCI后,ChABC可以降低神经元EphA4的表达,并减少EphA4阳性神经元周围的胶质细胞数,从而改善脊髓的内环境,有利于神经轴突的生长与延伸.
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围神经元网、硫酸软骨素蛋白多糖受体及其对神经可塑性的调节作用
围神经元网是中枢神经系统中一种包绕在特定类型神经元胞体和近端神经突周围的细胞外基质网络.在1883年,围神经元网早被Camillo Golgi所描述,直到近几十年,研究人员才对其分子组成、发育成熟以及潜在的功能有密集的研究.研究表明,围神经元网主要由透明质酸、硫酸软骨素蛋白多糖、连接蛋白和肌腱蛋白-R组成.围神经元网在神经发育的晚期才渐次出现,它的发育成熟水平和神经可塑性水平的高低呈负相关.功能上,一方面,围神经网络被认为在稳定细胞外微环境、维持被包裹神经元的性能和保护被包裹的神经元免受有害物质的影响等方面起到了重要的作用,围神经元网的异常可以导致诸如癫痫、中风和阿尔茨海默病等中枢神经系统的机能障碍;另一方面,围神经元网作为包裹在细胞外的一道屏障限制了神经可塑性的发生和阻碍了神经损伤后的再生.在成年动物中,用软骨素酶法降解围神经元网可以促进脊髓损伤后的功能修复以及恢复活动依赖的中枢神经系统可塑性调节机制,表明围神经元网在调节神经可塑性方面起到了非常重要的作用.本文就早期发育中活动依赖的围神经网络的形成和围神经网络信号通路中的重要分子——硫酸软骨素蛋白多糖受体的研究进展进行综述,并就它们如何调节神经可塑性展开讨论.
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硫酸软骨素酶ABC促进大鼠脊髓损伤后神经功能恢复的实验研究
目的 探讨硫酸软骨素酶ABC(ChABC)对神经脊髓损伤后运动功能恢复的影响.方法 SD大鼠72只,雌雄不限,随机分为假手术组、生理盐水对照组和ChABC治疗组,采用Allen法打击大鼠胸10脊髓损伤模型,分别在伤后即刻和随后每天一次连续一周蛛网膜下注射生理盐水和ChABC.HE染色和尼氏染色观察各时间点脊髓损伤组织形态和尼氏体及神经元的变化,采用BBB功能评分和运动诱发电位(MEP)观察大鼠的运动功能恢复情况.结果 大鼠脊髓损伤后1周时BBB评分和对照组无显著差别,在2、4周,治疗组评分结果明显优于对照组(P＜0.05;P＜0.01);MEP在1、4周的N1波潜伏期与对照组差异显著(P＜0.05;P＜0.01).HE和Nissl染色显示治疗组的形态和神经元数量要优于对照组.结论 ChABC能促进大鼠脊髓损伤后神经运动功能恢复,并对脊髓组织损伤具有保护作用.
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ChABC联合ADSC促进脱细胞同种异体神经支架移植后轴突再生的作用
[目的]探讨硫酸软骨素酶ABC (ChABC)与脂肪源性干细胞(ADSC)联合应用对大鼠脱细胞同种异体神经支架移植后轴突再生的影响.[方法] 36只成年大鼠随机分为脱细胞神经支架(ARSN)组、ChABC组、ADSC组、ChABC+ ADSC组;坐骨神经功能指数(SFI)、电生理和胫前肌湿重比方法检测神经再生和运动功能的恢复;荧光显微镜观察神经移植体内PKH-26标记的ADSC;电镜检测神经移植体中有髓神经纤维数目、轴突直径和髓鞘厚度;免疫荧光法检测神经移植体中S100和GFAP蛋白表达.[结果]ChABC+ ADSC组神经移植体内PKH-26标记的ADSC高于ADSC组(P＜0.05).与ARSN组比较,ChABC组、ADSC组和ChABC+ ADSC组SFI增高,神经传导速度增高,潜伏时缩短,动作电位波幅增大,胫前肌湿重比率增高,有髓神经纤维数目、髓鞘厚度、轴突直径、S100和GFAP蛋白表达显著增加(P＜0.05).其中ChABC+ ADSC组作用显著优于单独治疗组(P＜0.05).[结论]ChABC联合ADSC移植对大鼠脱细胞异体神经支架修复坐骨神经缺损后轴突再生的作用优于单独治疗组.
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骨髓间充质干细胞与硫酸软骨素酶ABC联合移植对大鼠脊髓损伤的修复作用及其机制
目的 观察骨髓间充质干细胞(BMSCs)与硫酸软骨素酶ABC(ChABC)联合移植对大鼠脊髓损伤的修复作用,并探讨其机制.方法 80只脊髓亚急性损伤大鼠随机分为4组各20只.损伤后第6天,A组先后移植2.0×106/μL的原代BMSCs细胞悬液、1 U/mL的ChABC各20μL,B组予等量BMSCs,C组予等量ChABC,D组予等量PBS.比较各组运动功能评分(BBB评分)、脊髓损伤区面积及后肢体感诱发电位(SEP)、经颅磁刺激运动诱发电位(MEP)潜伏期和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、生长相关蛋白43(GAP43)、脑源性神经生长因子(BDNF)阳性细胞百分比.结果 与D组比较,其余3组制模后第1天BBB评分降低,第14、28天BBB评分升高;与A组比较,B、C组BBB评分降低(P均＜0.05).与同组移植前比较,其余3组SEP、MEP潜伏期短;与A组比较,B组SEP潜伏期长,C、D组SEP潜伏期短;与A组比较,其余3组MEPP潜伏期短;P均＜0.05.与其余3组比较,A组损伤区面积小(P均＜0.05).与D组比较,其余3组GFAP阳性细胞百分比低,GAP-43、BDNF阳性细胞百分比高;与A组比较,GFAP阳性细胞百分比高,GAP43、BDNF阳性细胞百分比低;P均＜0.05.结论 BMSCs与ChABC联合移植对大鼠脊髓损伤有修复作用,机制可能与其降低GFAP、GAP43表达及升高BDNF表达有关.
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硫酸软骨素酶ABC联合超短波治疗对脊髓损伤大鼠的功能恢复及胶质瘢痕形成的影响
目的：：本研究旨在观察超短波联合硫酸软骨素酶 ABC(ChABC)治疗对脊髓损伤术后功能恢复及与损伤后胶质瘢痕形成有关的因子如：胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPGs)的影响。方法：42只8周龄 SD 大鼠随机分成3组,每组14只：对照组(包括8只单纯损伤组和6只损伤后注射 PBS 溶液组)、ChABC 组、ChABC 联合超短波治疗组。大鼠脊髓损伤后1d 及1周、2周、3周、4周做 BBB 神经行为学评分,应用免疫组织化学 SABC 法染色,分别于术后2周、4周检测脊髓组织中 GFAP、CSPGs 表达的平均光密度值差异。结果：BBB 评分比较：术后1周到4周,联合治疗组在各时间点的 BBB 评分均高于对照组(P <0.01,0.05),而 ChABC 组仅在术后第4周明显高于对照组(P <0.01)；2个治疗组间比较差异均无统计学意义。GFAP、CSPGs 免疫组化分析：与对照组相比,术后2周 ChABC 组和联合组的 GFAP、CSPGs 平均光密度度值均明显降低(P <0.01)。术后4周时, ChABC 组和联合组的 GFAP、CSPGs 平均光密度度值与对照组相比差异均无统计学意义(P >0.05)。结论：ChABC 联合超短波治疗能更好的促进脊髓损伤后的神经功能的恢复,并可在2周时抑制胶质瘢痕形成,但作用不持久,具体机制有待进一步研究。
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硫酸软骨素酶ABC和环磷酸腺苷缓释组织工程支架的构建
目的:制备一种可生物降解有效安全的硫酸软骨素酶ABC(ChABC)和环磷酸腺苷(cAMP)缓释组织工程支架,使药物缓慢稳定释放,降低局部应用时对神经的刺激,促进中枢神经系统损伤后神经的修复和轴突的再生.方法:应用电纺丝技术制作的含ChABC及cAMP的聚碳酸亚丙酯及壳聚糖缓释组织工程支架,分析支架直径、载药量、包封率等参数,然后以磷酸盐缓冲液为体外释药介质观察组织工程支架的药物释放速度、药物的失活率及支架的降解速度.结果:ChABC和cAMP缓释组织工程支架在聚碳酸亚内酯质量浓度为8％、电压为10～15 kV、距离为15～20 cm时可以纺出纤维直径约3μm的平滑支架,单纯聚碳酸盐内酯纤维光滑,直径均一,壳聚糖微球光滑,聚碳酸亚内酯与壳聚糖混合后电纺丝形成的支架呈串珠样结构,其能缓慢持续释放有活性ChABC和cAMP,12 d后支架降解失重率约7％.结论:应用电纺丝方法成功制备含ChABC及cAMP的聚碳酸盐内酯及壳聚糖组织工程支架,其药物稳定释放,局部应用无神经刺激,可生物降解.
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硫酸软骨素酶ABC治疗脊髓损伤的研究进展
脊髓损伤后在损伤部位周围形成的神经胶质瘢痕是轴突不能有效再生的主要障碍,胶质瘢痕由星形胶质细胞和硫酸软骨素蛋白聚糖组成.硫酸软骨素蛋白聚糖的基本结构是核心蛋白和葡胺聚糖链共价交连,其中抑制轴突生长的作用大部分是通过葡胺聚糖链介导的.硫酸软骨素酶ABC能特异性破坏硫酸软骨素蛋白聚糖的葡胺聚糖链,将硫酸软骨素蛋白聚糖分解成核心蛋白和碳水化合物短链,从而降低胶质瘢痕的阻碍作用使轴突的再生能力加强,神经功能得到改善.实验研究证明鞘内注射硫酸软骨素酶ABC治疗大鼠脊髓损伤取得良好结果,利用行为学评分评价硫酸软骨素酶ABC的治疗效果也证明它能促进脊髓损伤大鼠运动功能的恢复.
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BDNF联合chABC治疗对脊髓损伤大鼠神经传导通路的修复研究
目的 研究脑源性神经营养因子(BDNF)联合硫酸软骨素酶ABC(chABC)治疗对脊髓损伤大鼠神经传导通路的修复作用. 方法 雌性SD大鼠150只按随机数字表法分为假手术组、生理盐水治疗组、BDNF治疗组、chABC治疗组、BDNF联合chABC治疗组,每组30只.后4组大鼠制作脊髓损伤模型,术后3d分别于损伤中心注射10 μL生理盐水、20 μL BDNF、6μL chABC、6μL chABC+20 μL BDNF,连续治疗60 d,假手术组大鼠不做任何治疗.造模后1d、7d、14d、28 d、60 d对5组大鼠进行BBB运动功能评分检测和体感诱发电位(SEP)、运动诱发电位(MEP)监测,观察大鼠脊髓神经传导功能的恢复情况. 结果 伤后28、60 d,生理盐水治疗组、BDNF治疗组和chABC治疗组、BDNF联合chABC治疗组大鼠BBB评分逐渐增高,差异均有统计学意义(P＜0.05);伤后14d,BDNF联合chABC治疗组大鼠SEP N1波潜伏期[(27.16±1.09)s]低于生理盐水治疗组[(31.25±1.54)s],差异有统计学意义(P＜0.05);伤后28 d、60 d,生理盐水治疗组、BDNF治疗组和chABC治疗组、BDNF联合chABC治疗组大鼠SEPN1波潜伏期逐渐降低,差异均有统计学意义(P＜0.05);伤后14 d、28 d、60 d,生理盐水治疗组、BDNF治疗组和chABC治疗组、BDNF联合chABC治疗组大鼠MEP N1波潜伏期逐渐降低,差异均有统计学意义(P＜0.05). 结论 BDNF联合chABC治疗对脊髓损伤具有神经保护和神经营养作用,可加快脊髓损伤大鼠神经传导功能的恢复.
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BDNF联合chABC治疗对脊髓损伤大鼠的神经保护作用研究
目的 探讨脑源性神经营养因子(BDNF)联合硫酸软骨素酶ABC(chABC)治疗对脊髓损伤大鼠脊髓损伤局部胶质瘢痕形成的影响及其神经保护作用. 方法 健康雌性SD大鼠80只按随机数字表法分为假手术组、生理盐水治疗组、BDNF治疗组、chABC治疗组、BDNF联合chABC治疗组,每组16只.后4组大鼠制作脊髓损伤模型,术后即刻分别于损伤中心处注射10 μL生理盐水、20 μL BDNF、6 μL chABC、6μL chABC+20 μL BDNF.假手术组大鼠不做任何治疗.伤后1d、7d、14d、28 d,每组取4只大鼠,采用HE染色、Nissl染色观察脊髓损伤处胶质瘢痕形成情况,采用免疫组化染色检测脊髓损伤处胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达. 结果 伤后1d,HE染色、Nissl染色显示后4组大鼠脊髓损伤中心灰质出血明显,炎症细胞少量聚集,尼氏体开始由斑片状分解为细尘粒状;伤后7d,各治疗组的尼氏体分解成细尘状颗粒,神经元死亡较多,星形胶质细胞活化增生,炎症细胞浸润;伤后14、28 d,瘢痕组织及空洞形成,星形胶质细胞继续增生,尼氏体逐渐由细尘状恢复到虎斑状,着色神经元数量逐渐恢复.后3组尼氏体的恢复、神经元数量均多于生理盐水治疗组,其中BDNF联合chABC治疗组恢复优.伤后1d,后4组大鼠脊髓损伤处开始出现GFAP的阳性表达,随着时间的延长逐渐增多,伤后14d达高峰,28 d时稍有下降,任2个时间点间GFAP阳性表达比较差异均有统计学意(P＜0.05).伤后7 d,BDNF联合chABC治疗组GFAP染色阳性面积低于生理盐水治疗组;伤后14、28d,BDNF、chABC单独及联合治疗组GFAP染色阳性面积均低于生理盐水治疗组;伤后28d,BDNF联合chABC治疗组GFAP染色阳性面积低于生理盐水治疗组和BDNF、chABC治疗组,差异均有统计学意义(P＜0.05). 结论 BDNF联合chABC治疗对脊髓损伤具有神经保护和神经营养作用,可以减少星形胶质细胞增生和胶质瘢痕形成,抑制GFAP的表达,联合应用的效果优于单一应用.
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硫酸软骨素酶ABC对脑损伤后胶质瘢痕影响的实验研究
目的 探讨硫酸软骨素酶ABC(chABC)对脑损伤后胶质瘢痕组织的影响.方法 38只Wistar大鼠按随机数字表法分成5组:正常对照组(n=2)、模型组(n=9)、1.0 U/mL chABC治疗组(n=9)、2.5 U/mL chABC治疗组(n=9)、5.0 U/mL chABC治疗组(n=9),后4组采用自由落体撞击法制作大鼠脑损伤模型,造模后即刻在后3组大鼠局部脑皮层下1 mm处注射不同浓度chABC 2μL,正常对照组不做任何处理.造模后1、2、4周取脑组织标本行HE染色,分别应用免疫组化染色和Western blotting检测硫酸软骨素多聚蛋白糖(CSPGs)的表达.结果 HE染色显示损伤后2周模型组大鼠脑皮层大量星形胶质细胞聚集,不同浓度chABC治疗组损伤部位的星形胶质细胞聚集较模型组减少,以5.0U/mL chABC治疗组明显.免疫组化染色显示模型组,1.0、2.5、5.0U/mL chABC 治疗组损伤后2周大鼠脑组织CSPGs分泌均较正常对照组增加,差异有统计学意义(P＜0.05);与模型组比较,5.0 U/mL chABC治疗组大鼠脑组织CSPGs分泌减少,差异有统计学意义(P＜0.05).Western blotting检测显示造模后1、2、4周不同浓度chABC治疗组CSPGs表达均较模型组低,差异有统计学意义(P＜0.05);模型组和2.5、5.0 U/mL chABC治疗组大鼠脑组织中CSPGs的表达在造模后1、2、4周逐渐降低,差异有统计学意义(P<0.05).结论 chABC能降解胶质瘢痕中主要抑制分子CSPGs,改善脑损伤后局部轴突再生的抑制性微环境,且高浓度(5.0U/mL)chABC表现明显.
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硫酸软骨素酶ABC联合脊髓康对大鼠脊柱脊髓损伤后的神经功能恢复、TGF-β1、HIF-1α、Nogo-NgR信号通路的影响
目的:探究硫酸软骨素酶ABC(Ch ABC)联合脊髓康对大鼠脊柱脊髓损伤后的神经功能恢复及TGF-β1、HIF-1α 、Nogo-NgR信号通路的影响.方法:60只大鼠随机分为4组,分别为对照组 、模型组 、Ch ABC组和Ch ABC+脊髓康.使用Allen's法建立大鼠脊柱脊髓损伤模型.Basso Beattie Bresnah-an(评分)和体感诱发电位(sEP)检测评估脊髓神经功能.使用RT-qPCR检测mRNA水平,Western blot检测蛋白水平.结果:建模后大鼠BBB评分显著降低(P<0.05),干预后3组的BBB评分均有提高,其中Ch ABC+脊髓康组BBB评分显著高于Ch ABC组(P<0.05).建模后大鼠SEP显著升高(P<0.05),干预后3组的BBB评分均有降低,其中Ch ABC+脊髓康组BBB评分显著低于Ch ABC组(P<0.05).干预后Ch ABC组和Ch ABC+脊髓康组TGF-β1显著高于模型组,HIF-1α 显著低于模型组(P<0.05).且干预后Ch ABC+脊髓康组TGF-β1的水平显著高于Ch ABC组而HIF-1α 显著低于Ch ABC组(P<0.05).干预后Ch ABC组和Ch ABC+脊髓康组Nog-oNgR通路表达水平显著低于模型组(P<0.05),并且干预后Ch ABC+脊髓康组的Nogo-A、NgR、LINGO-1表达水平显著低于Ch ABC组(P<0.05).结论:ChABC联合脊髓康具有更强的促进神经功能恢复的作用,脊髓康的联合使用可进一步抑制HIF-1α 水平而提高TGF-β1水平,提高预后促进脊柱愈合.并且联合用药的作用机制可能与其具有抑制Nogo-NgR信号通路促进神经元生长的作用有关.
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排斥导向分子B对大鼠脊髓损伤后功能恢复的影响
目的:探讨排斥导向分子(repulsive guidance molecule,RGM)B在大鼠脊髓损伤后的表达规律及其与脊髓功能恢复的相关性.方法:成年雄性SD大鼠65只,随机分成3组,A组:不应用硫酸软骨素酶ABC (chondroitinase ABC,ChABC)降解25只;B组:应用硫酸软骨素酶降解20只;C组:假手术组只暴露脊髓20只.A、B、C3组分别在术后相同时间位点观察记录动物肢体运动情况并处死动物进行标本检测.采用BBB (Basso-Beattie-Bresnahan)评分法评价大鼠后肢的感觉、运动功能;HE染色计算损伤区总面积;Real-time PCR检测RGMB mRNA的表达;应用免疫荧光检测胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)及神经丝蛋白-200(neurofilament-200,NF-200)双标表达情况.结果:伤后2～4周同一时间段B组BBB评分显著高于A组(P＜0.05);伤后2周HE染色结果表明,2组损伤区均有空洞形成,B组损伤区面积显著小于A组(P＜0.05);伤后2到4周GFAP/NF-200双重免疫荧光染色示B组GFAP表达逐渐下调,A组荧光强度值显著高于B组(P＜0.05);NF-200免疫组化染色阳性纤维穿过损伤区,B组荧光强度值显著高于A组(P＜0.05);RGMB mRNA表达量B组显著较A组下降(P＜0.05).结论:微环境中的RGMB浓度在大鼠脊髓损伤后与其后期脊髓功能恢复呈负相关,RGMB抑制剂可能对临床治疗脊髓损伤有一定作用.
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硫酸软骨素酶ABC对大鼠脊髓损伤后轴突髓鞘化和胶质瘢痕的影响
目的 探讨硫酸软骨素酶ABC (chondroitinase ABC,ChABC)对大鼠脊髓损伤后轴突再生、髓鞘化和胶质瘢痕形成的影响. 方法 将72只雄性SD大鼠随机分为ChABC治疗组(A组)、生理盐水治疗组(B组)和假手术组(C组),每组24只.A、B组采用改良Allen撞击法制作大鼠T9中度脊髓损伤模型,分别在伤后1h和之后连续7d每天1次经蛛网膜下腔注射6 μL浓度为1 U/mL ChABC和生理盐水；C组仅打开椎管,不损伤脊髓.术后1、7、14、28d,米用BBB评分评定大鼠后肢运动功能恢复情况；取出损伤段脊髓组织,行HE染色和Nissl染色,并采用免疫组织化学染色检测髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)、生长相关蛋白43 (growth associated protein 43,GAP-43)和胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)的变化情况. 结果 术后各时间点C组BBB评分均明显高于A、B组(P＜0.05);术后随时间延长A、B组BBB评分逐渐增加,14、28 d时A组BBB评分明显优于B组(P＜0.05).HE和Nissl染色显示术后各时间点A组脊髓组织形态和神经元数量均优于B组.术后各时间点A、B组MBP和GAP-43的积分吸光度(IA)值及GFAP染色阳性面积均高于C组(P＜0.05),术后7、14、28 d时A组MBP和GAP-43的IA值明显高于B组(P＜ 0.05),GFAP染色阳性面积明显小于B组(P＜0.05). 结论 ChABC能有效改善大鼠脊髓损伤区域微环境,提高MBP和GAP-43表达并抑制GFAP表达,促进轴突再生与髓鞘化,抑制胶质瘢痕形成,促进神经功能恢复.
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全反式维甲酸干预鼠胚神经干细胞联合胶质细胞源性神经营养因子及硫酸软骨素酶ABC移植修复大鼠脊髓损伤的研究
目的 探讨全反式维甲酸(all-trans-retinoic acid,ATRA)干预培养的鼠胚神经干细胞(neural stemcells,NSCs)联合胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line derived neurotrophic factor,GDNF)、硫酸软骨素酶ABC (chondroitinase ABC,ChABC)移植治疗大鼠脊髓损伤的效果.方法 取健康成年雌性SD大鼠60只,体重200 ～ 250 g,随机分为5组(n=12),分别为假手术组(A组)、损伤对照组(B组)、NSCs+GDNF移植组(C组)、NSCs+ChABC移植组(D组)、NSCs+GDNF+ChABC移植组(E组).B～E组于T1o平面横断脊髓建立脊髓全横断损伤模型,A组仅显露硬脊膜但不损伤脊髓.于术后第8天将BrdU标记的ATRA干预培养的鼠胚NSCs移植至C、D、E组大鼠,第8 ～ 14天C～E组每天对应给予10 μL GDNF、10 μL ChABC,A、B组给予等量生理盐水.术后观察大鼠一般情况;于术前1d、术后7d及移植后1、2、5、8周采用BBB评分评估大鼠双后肢运动功能,采用体感诱发电位(somatosensory evoked potentials,SEP)评估神经传导功能.移植8周处死各组大鼠,取移植节段脊髓行HE染色和免疫荧光染色观察.结果 造模术后共5只大鼠死亡,均补充.造模术后各时间点,B～E组大鼠BBB评分均较A组降低,SEP潜伏期均较A组延长,差异有统计学意义(P＜0.05);造模术后7d、移植后1周时,B～E组组间BBB评分、SEP潜伏期比较,差异无统计学意义(p＞0.05);移植2、5、8周,C～E组大鼠双后肢功能逐步恢复,各时间点BBB评分均高于B组,SEP潜伏期均短于B组,差异有统计学意义(P＜0.05);移植5、8周,E组BBB评分高于C、D组,SEP潜伏期短于C、D组,差异有统计学意义(P＜0.05).HE染色示,A组灰、白质分界清楚,细胞排列规则;B组损伤区血管形态欠完整,细胞排列紊乱,可见囊腔及胶质瘢痕形成;C～E组细胞增生明显,坏死囊腔较B组小.免疫组织荧光染色示,A、B组未见明显BrdU标记阳性细胞;C、D、E组BrdU阳性细胞胞体呈橘红色,E组阳性细胞多于C、D组(P＜0.05).C～E组神经胶质纤维酸性蛋白阳性细胞少于A、B组,E组少于C、D组,差异均有统计学意义(P＜0.05).C～E组抗微管相关蛋白2阳性细胞多于A、B组,E组多于C、D组,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 经ATRA干预培养的NSCs联合GDNF及ChABC移植对大鼠脊髓损伤再修复的促进作用优于NSCs分别联合GDNF、ChABC,提示GDNF、ChABC在治疗脊髓损伤修复过程中具有协同作用.
关键词： 神经干细胞 胶质细胞源性神经营养因子 硫酸软骨素酶ABC 脊髓损伤 大鼠 -
ChABC联合脂肪源性干细胞对大鼠脱细胞异体神经支架移植后功能恢复的影响
目的:探讨硫酸软骨素酶ABC(chondroitinase ABC,ChABC)与脂肪源性干细胞(Adipose-derived stem cell,ADSC)联合应用对脱细胞异体神经支架移植修复坐骨神经缺损后大鼠运动和感觉功能恢复的影响.方法:成年大鼠随机分为脱细胞坐骨神经(acellular rat sciatic nerve,ARSN)组、ChABC组、ADSC组、ChABC+ ADSC组；应用坐骨神经功能指数(SFI)、电生理和胫前肌湿重比检测神经再生和运动功能的恢复；脊神经节HRP逆行标记及患侧足掌皮肤触觉小体HE染色检测感觉功能的恢复.结果:与ARSN组比较,ChABC组、ADSC组和ChABC+ADSC组SFI显著增高,神经传导速度显著增高,动作电位波幅增大,胫前肌湿重比率增高,HRP阳性标记感觉神经元和触觉小体的数量增高(P＜0.05).其中ChABC+ ADSC组作用显著优于单独治疗组(P＜0.05).结论:ChABC联合ADSC移植对大鼠坐骨神经缺损脱细胞异体神经支架修复后运动和感觉功能恢复的作用优于单独治疗组.
