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氯离子转运体在神经病理性疼痛大鼠背根神经节上表达的研究
目的：为了探讨氯离子转运体的表达及其功能在神经病理性疼痛的产生和维持中的作用。方法：建立大鼠坐骨神经压迫模型(chronic constriction injury, CCI)；检测大鼠热刺激缩足反射潜伏期(thermal withdrawal latency, TWL)；应用免疫组化、Western Blot技术检测钠-钾-氯共转运体1(sodium-potassium-chloride co-transorter 1, NKCC1)和钾-氯共转运体2(potassium-chloride co-transorter 2, KCC2)在CCI模型背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)神经元上表达的改变；应用氯离子荧光探针MQAE（N-Ethoxycarbonylmethyl -6-methoxyquinolinium bromide）检测DRG神经元氯离子浓度的变化。结果：（1）CCI组大鼠TWL较正常对照组明显缩短（P<0.01，n=10），至术后21天测试结束仍较明显（P<0.05，n=10）。假手术组与正常组差异无统计学意义。（2）正常情况下， NKCC1微弱表达于DRG大、中、小型神经元，KCC2未见表达。CCI模型术后第7天、14天、21天，NKCC1表达增加，KCC2未见表达。（3）CCI组大鼠术后第7天DRG、NKCC1阳性细胞计数、中型神经元显著增加（P<0.01，n=1000）；术后第14天，中、小型神经元增加（P<0.01，n=1000）；术后第21天，中型神经元增加（P<0.01，n=1000）。（4）CCI术后14、21天DRG神经元NKCC1蛋白表达显著增加。（5）CCI术后7、14天DRG神经元中氯离子浓度明显升高（P<0.05， n=1000）。结论：神经病理性疼痛发生时，NKCC1在DRG神经元表达异常增加，引起细胞内Cl-浓度升高，继而可能参与了介导初极感觉外周末梢去极化(primary afferent depolarization, PAD)或/和诱发初极感觉中枢末梢端的背根反射(dorsal root reflexes,DRRs)引发痛觉过敏和异常疼痛产生。
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NKCC1和Na-K-ATPase通道蛋白与老年性耳聋的关系及其在老年性耳聋不同阶段中的作用
目的：通过对C57BL/6J小鼠耳蜗中NKCC1和Na-K-ATPase的年龄相关性表达的研究，分析其与老年性耳聋的关系并进一步探讨其在老年性耳聋发生发展不同阶段中的作用。方法通过听性脑干反应（ABR）分别检测C57BL/6J小鼠在4、24和48周年龄段的听力水平。采用实时免疫荧光定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法分别检测NKCC1和Na-K-ATPase mRNA在各年龄段小鼠耳蜗中的表达水平。结果随着C57BL/6J鼠龄的增加，其ABR反应阈值逐渐升高（P<0.05）。RT-PCR显示NKCC1和Na-K-ATPase mRNA在耳蜗的表达水平存在随鼠龄增加逐渐下降的趋势（P＜0.01）。结论 C57BL/6J小鼠的ABR反应阈值随鼠龄增加逐渐增高，具有老年性耳聋的特征；NKCC1和Na-K-ATPase两种通道蛋白随鼠龄的增加逐渐下降，与C57BL/6J小鼠的年龄相关性听力下降密切相关，可能与老年性耳聋后期发展及恶化有关。
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布美他尼可通过下调NKCC1和AQP4表达减轻缺血性脑水肿及神经损伤
目的 探索电中性共同转运体(Na+-K+-2Cl-共同转运体-1,NKCC1)抑制剂布美他尼对大鼠大脑局灶脑缺血再灌注损伤所致脑水肿及神经功能的影响及机制.方法 将SD大鼠按随机数字法分成假手术组、脑缺血组和布美他尼组.观察干预不同时间点患侧大脑半球脑含水量(brain water content,BWC)、梗死灶周围NKCC1和水通道蛋白4(aquaporin-4,AQP4)的表达变化;并于再灌注24 h检测神经行为学评分及梗死灶周围细胞凋亡情况.结果 在脑缺血2h,再灌注6h、12 h和24 h时,NKCC1和AQP4表达进行性增高,患侧大脑半球BWC进行性增高;予布美他尼干预后,两者表达均显著下降(P＜0.05),患侧大脑半球BWC亦下降(P＜0.05).同脑缺血组再灌注24h相比,布美他尼组神经行为学评分改善(P＜0.05),梗死灶周围细胞凋亡显著减少(P＜0.05).结论 布美他尼可通过下调NKCC1和AQP4表达,减轻缺血性脑水肿,并改善神经功能.
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四逆酸枣仁汤合方对失眠大鼠海马GABAARα1、γ2及NKCC1的影响
目的:观察四逆酸枣仁汤合方对失眠大鼠海马GABAARα1、γ2及NKCC1的影响.方法:采用SD大鼠腹腔注射对氯苯丙氨酸(PCPA)复制失眠模型,将复制成功的模型大鼠随机分为模型组、西药组、四逆散组、酸枣仁汤组、合方组,并设置空白对照组,各组给予相应药物连续7 d,模型组和正常组生理盐水连续灌胃7 d,并观察各组大鼠的一般活动状态和体质量增量.采用实时荧光定量PCR检测海马中GABAARα1、γ2和NKCC1 mRNA的表达;采用Western Blot的方法检测海马中GABAARα1、γ2和NKCC1蛋白的表达.结果:四逆酸枣仁汤合方可以提高海马中GABAARα1、γ2 mRNA和蛋白的表达,降低海马中NKCC1 mRNA和蛋白的表达.结论:四逆酸枣仁汤合方可以通过调节失眠大鼠海马中GABAARα1、γ2和NKCC1 mRNA和蛋白的表达量来改善大鼠的睡眠节律.
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骨癌痛大鼠脊髓中WNK1激酶表达的变化
目的：研究骨癌痛大鼠脊髓中WNK1表达的变化。方法健康♀ SD大鼠30只,体质量170 g~200 g,随机分为3组,对照组(C 组,n=3)、假手术组(S组,n=3)和骨癌痛组(BCP组,n=24)。对照组不给予任何处理,假手术组、骨癌痛组分别在左胫骨上端注射 PBS液5μL和 WALKER 256乳腺癌细胞5μL(约1×105个细胞)。模型制备前d 1以及制备后d 3、6、9、10、11、12测定大鼠机械痛阈。 C 组与S组于术后d 12、BCP组于模型制备后d 3、6、9、12时处死大鼠并取脊髓(L4~6)。运用qRT-PCR及Western blot方法分别检测不同时间点WNK1 mRNA及蛋白表达。结果与S组比较,BCP组术后d 3机械痛阈开始降低(P<0．05),BCP组脊髓中WNK1 mRNA 在术后d 3起表达上调并随时间推移呈递增趋势(P<0．01),至d 9达到峰值(P<0．05),随后表达下调,至d 12差异无统计学意义( P>0．05)；WNK1蛋白在术后d 6开始表达上调,并随时间推移呈递增趋势至12 d (P<0．01)。结论骨癌痛大鼠脊髓中WNK1表达异常增高,可能参与了大鼠骨癌痛的发生和维持。
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NKCC1在手汗症伴腋窝多汗患者腋窝汗腺中的表达及意义
目的 观察手汗症伴腋窝多汗患者(腋窝多汗组)、手汗症无腋窝多汗患者(单纯型手汗症组)及非手汗症患者(对照组)的腋窝汗腺数目及Na+K+Cl-联合转运子1(NKCC1)的表达,探讨其与手汗症发病的关系.方法 27例腋窝多汗组,11例单纯型手汗症组,8例对照组,取各组患者腋窝皮肤作常规苏木素.伊红(HE)染色,计数汗腺数目,并检测NKCC1在3组患者腋窝皮肤汗腺中的表达和分布.结果 3组汗腺计数差异均无统计学意义(HC=2.528,P>0.05).腋窝多汗组与单纯型手汗症组、对照组NKCC1的吸光度差异有统计学意义(F=5.158,P<0.05;F=5.158,P<0.01),单纯型手汗症组与对照组差异无统计学意义(F=5.158,P>0.05).结论 伴有腋窝多汗的手汗症患者腋汗增多与NKCC1蛋白表达增强有关,而与腋窝汗腺数目无关.
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水杨酸钠对大鼠耳蜗NKCC1 mRNA表达的影响
目的 研究水杨酸钠作用后大鼠耳蜗Na+-K+-2Cl-联合转运体(Na+-K+-2 Cl-co-trans-porter,NKCC1)mRNA的表达变化情况.探讨NKCC1在水杨酸钠肌注后引起大鼠耳蜗主动性改变中的作用和意义.方法 选用24只正常成年SD大鼠,随机分成四组,每组6只:正常对照组(无特殊处理)、急组(一次肌注水杨酸钠400 mg/kg后处死)、慢性组(肌注水杨酸钠175 mg/kg,2次/天,连续用药14天后处死),恢复组(给药方法及时间同慢性组,停药14天后处死),运用荧光定量PCR技术比较四组大鼠耳蜗NKCC1mRNA的表达变化.结果 NKCC1mRNA在正常对照组,急性组、慢性组、恢复组均有表达.慢性组、恢复组的表达量均高于正常组,差异均有统计学意义(P<0.05);急性组NKCC1mRNA的表达低于正常组,差异有统计学意义(P<0.05);恢复组NKCC1mRNA的表达低于慢性组,差异有统计学意义(P<0.05).结论 NKCC1mRNA在正常大鼠中有表达,提示其对维持内淋巴液中Cl-的平衡有一定作用;水杨酸钠肌注可以引起大鼠耳蜗NKCC1>mRNA表达变化,可能通过改变耳蜗内淋巴液Cl浓度平衡,而影响外毛细胞的电能动性.
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ABR和DPOAE检测研究NKCC1在不同基因型小鼠耳蜗听觉中的作用
目的 应用听性脑干反应(ABR)和畸变产物耳声发射(DPOAE)技术检测不同基因型NKCC1小鼠的听觉功能,研究NKCC1在耳蜗听觉功能中的作用.方法 利用ABR和DPOAE实验检测不同基因型NKCC1小鼠的听觉功能.结果 NKCC1+/+野生型小鼠听力正常,ABR检测的短声(click)阈值为(23.13±3.78) dB SPL;NKCC1+/-杂合子小鼠听力低于NKCC1+/+野生型小鼠,其短声阈值为(38.49±12.29) dB SPL.NKCC1+/+和NKCC1+/-小鼠ABR的阈值均值在各个频率的差异有极显著性意义(均P<0.01);NKCC1-/-突变纯合子鼠的ABR的各个频率在100 dB均无反应,呈现全聋.与NKCC1+/+小鼠比较,NKCC1-/-小鼠没有DPOAE的检出.结论 耳蜗NKCC1在小鼠的听觉生理中有重要作用,NKCC1缺失或是功能受限均可影响耳蜗的听觉功能.
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癫痫持续状态NKCC1、 GABAARα1蛋白在大鼠海马的表达及脑源性神经营养因子对其的影响
目的 观察大鼠癫痫持续状态(SE)后72 h内海马组织中NKCC1及GABAAR α1表达的动态变化,以及使用anti-BDNF干预后其表达的变化,探讨NKCC1与GABAARα1在SE中的可能机制及其之间的关系,以及BDNF在SE发生过程中对NKCC1和GABAARα1表达的影响.方法 健康成年雄性SD大鼠90只,随机分为生理盐水对照组(10只)、SE组(40只)和干预组(40只).制作LiCl-PILO癫痫模型(SE组)和造模前3～4h侧脑室注射anti-BDNF(干预组),选取SE后2、6、24和72h为时间点.观察大鼠在SE诱发过程中的行为学差异、海马NKCC1及GABAARα1蛋白的表达改变、海马各区NKCC1及GABAARα1蛋白的时空分布等特点.结果 干预组SE诱发成功率较SE组低,SE诱发成功后生存状态好、死亡率低.SE组NKCC1蛋白在SE后均高于对照组,干预组NKCC1蛋白表达在2h显著增加,6h达高,24h后开始明显恢复,72 h时接近正常.两组在海马不同亚区,SE后2h开始,NKCC1在CA1及CA3区均显著增高.SE组GABAARα1蛋白在SE后2～6 h表达显著下调,24 h降至低,至72 h突然增高.干预组GABAARα1蛋白表达在SE后2h达低值,6h后上调,72 h达高值,SE组与干预组GABAAR α1在CA1、CA3区的表达呈进行性下调,但干预组变化幅度较小.结论 NKCC1蛋白表达在SE后的上调可能是SE后GABAAR介导的兴奋性作用产生的重要机制之一;A nti-BDNF干预可通过抑制BDNF的表达,延缓癫痫发生并减弱癫痫发作的严重程度.
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局部亚低温对大鼠局灶性脑缺血-再灌注模型NKCC1 mRNA水平的影响
目的:观察局部亚低温对大鼠局灶性脑缺血-再灌注模型NKCC1 mRNA表达水平的影响,探索局部亚低温的脑保护机制.方法:雄性Wistar大鼠50只,随机分成常温组和亚低温组.应用"线栓法"实现大鼠右侧大脑中动脉阻塞,2h后拔出线栓进行再灌注,于再灌注3h、12h、24h和72h处死大鼠.应用RT-PCR方法观察NKCC1 mRNA水平的变化.结果:与假手术亚组相比,缺血-再灌注亚组大鼠缺血区皮质NKCC1 mRNA水平明显升高,开始于再灌注3h,12h～24h达到高峰,72h开始下降,亚低温组各再灌注时间点NKCC1 mRNA水平均低于常温组中相应亚组的水平.结论:局部亚低温通过抑制缺血-再灌注过程中NKCC1 mRNA水平的上调发挥脑保护作用.
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GAD67-GFP基因敲入小鼠黑质网状部神经元GABA与氯离子转运体KCC2和NKCCl的共存
为了观察谷氨酸脱羧酶67-绿色荧光蛋白(GAD67-GFP)基因敲入小鼠黑质网状部(SNr)内,表达GFP的GABA能神经元与一对功能相反的CI-共转运体(K+-CI-cotransporter2.KCC2;Na+-K+-CI-cotransporter 1,NKCC1)的共存情况,奉研究分别运用原位分子杂交与免疫组织化学相结合以及GFP与KCC2或NKCC1免疫荧光染色相结合的双重标记方法,在光学显微镜和激光共聚焦显微镜下同时进行观察.结果显示:(1)SNr内95%以上的GFP阳性神经元同时表达KCC2 mRNA,而50%表达KCC2 mRNA的阳性神经元呈GFP阳性;(2)SNr内80%以卜的GFP阳性神经元同时表达NKCC1 mRNA,约35%表达NKCC1 mRNA的阳性神经元呈GFPH阳性;(3)SNr内90%以上的GFP阳性神经元同时表达KCC2,双标神经元约占KCC2阳性神经元的50.5%;(4)SNr内80.5%以上的GFP阳性神经元同时表达NKCC1,双杯神经元约占NKCC1阳性神经元的42.5%.以上结果表明,SNr内表达GFP的GABA能神经元大部分与KCC2和NKCC1共存,提示氯离子共转运体可能对SNr内GABA能神经元起重要的调控作用.
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NKCC1和KCC2在成年大鼠大脑皮质神经元的胞体和树突的不同表达
γ-氨基丁酸(GABA)是成年哺乳动物脑内主要的抑制性神经递质,但电生理的研究表明,GABA在成熟皮质神经元的树突部位可以产生兴奋性作用,但该现象的形态学基础,目前尚不清楚.GABA产生兴奋性作用的关键主要依赖于神经元胞内的氰离子浓度,其中Na+-K-Cl-共转运体1(NKCC1)促进细胞内Cl-堆积,而K+-Cl-共转运体2(KCC2)则外排胞内的Cl-,降低胞内的Cl-浓度.本研究应用免疫荧光组织化学双重标记结合荧光强度分析,检测NKCC1和KCC2在成年大鼠脑皮质和培养的大鼠脑皮质神经元树突和胞体的表达和分布情况.结果显示:成年大鼠皮质神经元的胞浆和细胞膜均有NKCC1的表达,而KCC2主要表达在神经元胞体和树突膜上,其中NKCC1在神经元树突上的表达水平比胞体高.而KCC2的表达水平在树突和胞体膜上没有明显差异.皮质神经元经培养20 d后,NKCC1和KCC2在树突和胞体的表达模式与在体的分布相类似.本研究结果提示,NKCC1在大鼠皮质神经元树突的表达较多,可能是GABA兴奋神经元树突的原因.
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氯离子转运体KCC2/NKCC1参与病理性疼痛的研究进展
阳离子氯离子联合转运蛋白(cation-Cl-cotransporter,CCC)是一组转运Na+、K+、Cl-进出细胞的膜蛋白.其中,钾氯联合转运蛋白2(K+-Cl-cotransporter 2,KCC2)和钠钾氯联合转运蛋白1(Na+-K+-C1-cotransporter 1,NKCC1)是调节神经系统氯离子稳态的主要CCC,NKCC1将CI-转运入胞内,KCC2将C1-转运至胞外,两者共同调节氯离子平衡及神经元的兴奋性[1].近年来越来越多的研究表明,KCC2/NKCC1在伤害性信息的传递过程中发挥重要的调节作用,其表达及功能异常促进了病理性疼痛的发生与发展,本文就KCC2/NKCC1与病理性疼痛关系的新研究进展作一综述,以期深入理解KCC2/NKCC1在病理性疼痛发生与发展中的作用.
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钠钾氯离子共转运体1在新生儿缺氧缺血性脑损伤中的表达研究
目的 分析新生儿缺氧缺血患儿血中NKCC1的表达及其活性变化,探讨其在新生儿缺氧缺血治疗中的临床意义.方法 选取本院50例新生儿缺氧缺血纳入缺氧缺血组(HIBD组),将本院同期40例健康体检新生儿纳入正常对照组,采用荧光定量PCR检测两组研究对象血中NKCC1基因表达,酶标法检测两组血清中神经元特异性烯醇化酶(NSE)及S100β蛋白表达水平.结果 HIBD组中NKCC1、NSE、S100β表达水平均明显高于正常对照组(P＜0.001).结论 NKCC1、NSE、S100β变化可能参与新生儿缺氧缺血的发病,抑制NKCC1基因表达可能成为治疗新生儿缺氧缺血的重要方法.
