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氯离子转运体在神经病理性疼痛大鼠背根神经节上表达的研究
目的：为了探讨氯离子转运体的表达及其功能在神经病理性疼痛的产生和维持中的作用。方法：建立大鼠坐骨神经压迫模型(chronic constriction injury, CCI)；检测大鼠热刺激缩足反射潜伏期(thermal withdrawal latency, TWL)；应用免疫组化、Western Blot技术检测钠-钾-氯共转运体1(sodium-potassium-chloride co-transorter 1, NKCC1)和钾-氯共转运体2(potassium-chloride co-transorter 2, KCC2)在CCI模型背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)神经元上表达的改变；应用氯离子荧光探针MQAE（N-Ethoxycarbonylmethyl -6-methoxyquinolinium bromide）检测DRG神经元氯离子浓度的变化。结果：（1）CCI组大鼠TWL较正常对照组明显缩短（P<0.01，n=10），至术后21天测试结束仍较明显（P<0.05，n=10）。假手术组与正常组差异无统计学意义。（2）正常情况下， NKCC1微弱表达于DRG大、中、小型神经元，KCC2未见表达。CCI模型术后第7天、14天、21天，NKCC1表达增加，KCC2未见表达。（3）CCI组大鼠术后第7天DRG、NKCC1阳性细胞计数、中型神经元显著增加（P<0.01，n=1000）；术后第14天，中、小型神经元增加（P<0.01，n=1000）；术后第21天，中型神经元增加（P<0.01，n=1000）。（4）CCI术后14、21天DRG神经元NKCC1蛋白表达显著增加。（5）CCI术后7、14天DRG神经元中氯离子浓度明显升高（P<0.05， n=1000）。结论：神经病理性疼痛发生时，NKCC1在DRG神经元表达异常增加，引起细胞内Cl-浓度升高，继而可能参与了介导初极感觉外周末梢去极化(primary afferent depolarization, PAD)或/和诱发初极感觉中枢末梢端的背根反射(dorsal root reflexes,DRRs)引发痛觉过敏和异常疼痛产生。
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骨癌痛大鼠脊髓中WNK1激酶表达的变化
目的：研究骨癌痛大鼠脊髓中WNK1表达的变化。方法健康♀ SD大鼠30只,体质量170 g~200 g,随机分为3组,对照组(C 组,n=3)、假手术组(S组,n=3)和骨癌痛组(BCP组,n=24)。对照组不给予任何处理,假手术组、骨癌痛组分别在左胫骨上端注射 PBS液5μL和 WALKER 256乳腺癌细胞5μL(约1×105个细胞)。模型制备前d 1以及制备后d 3、6、9、10、11、12测定大鼠机械痛阈。 C 组与S组于术后d 12、BCP组于模型制备后d 3、6、9、12时处死大鼠并取脊髓(L4~6)。运用qRT-PCR及Western blot方法分别检测不同时间点WNK1 mRNA及蛋白表达。结果与S组比较,BCP组术后d 3机械痛阈开始降低(P<0．05),BCP组脊髓中WNK1 mRNA 在术后d 3起表达上调并随时间推移呈递增趋势(P<0．01),至d 9达到峰值(P<0．05),随后表达下调,至d 12差异无统计学意义( P>0．05)；WNK1蛋白在术后d 6开始表达上调,并随时间推移呈递增趋势至12 d (P<0．01)。结论骨癌痛大鼠脊髓中WNK1表达异常增高,可能参与了大鼠骨癌痛的发生和维持。
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氯化物协同转运蛋白KCC2在正常大鼠内耳中的表达及意义
目的 研究氯化物协同转运蛋白KCC2(potassium-chloride cotransporter-2)在内耳中的表达及分布.方法 用免疫荧光素FITC(异硫氰酸荧光素)标记的方法检测KCC2在正常大鼠内耳的分布,荧光素标记阳性部位揭示大鼠耳蜗内KCC2的分布情况.结果 KCC2的阳性表达部位主要分布在耳蜗的盖膜、柯蒂器、螺旋神经节细胞以及前庭壶腹嵴顶部的毛细胞,耳蜗螺旋韧带及血管纹上KCC2为弱阳性表达.结论 在正常大鼠的内耳中,KCC2在耳蜗和前庭中有表达,提示KCC2可能通过对K+、Cl-转运的控制,配合其它的离子通道共同维持淋巴液中K+、Cl-的离子平衡.
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GAD67-GFP基因敲入小鼠黑质网状部神经元GABA与氯离子转运体KCC2和NKCCl的共存
为了观察谷氨酸脱羧酶67-绿色荧光蛋白(GAD67-GFP)基因敲入小鼠黑质网状部(SNr)内,表达GFP的GABA能神经元与一对功能相反的CI-共转运体(K+-CI-cotransporter2.KCC2;Na+-K+-CI-cotransporter 1,NKCC1)的共存情况,奉研究分别运用原位分子杂交与免疫组织化学相结合以及GFP与KCC2或NKCC1免疫荧光染色相结合的双重标记方法,在光学显微镜和激光共聚焦显微镜下同时进行观察.结果显示:(1)SNr内95%以上的GFP阳性神经元同时表达KCC2 mRNA,而50%表达KCC2 mRNA的阳性神经元呈GFP阳性;(2)SNr内80%以卜的GFP阳性神经元同时表达NKCC1 mRNA,约35%表达NKCC1 mRNA的阳性神经元呈GFPH阳性;(3)SNr内90%以上的GFP阳性神经元同时表达KCC2,双标神经元约占KCC2阳性神经元的50.5%;(4)SNr内80.5%以上的GFP阳性神经元同时表达NKCC1,双杯神经元约占NKCC1阳性神经元的42.5%.以上结果表明,SNr内表达GFP的GABA能神经元大部分与KCC2和NKCC1共存,提示氯离子共转运体可能对SNr内GABA能神经元起重要的调控作用.
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NKCC1和KCC2在成年大鼠大脑皮质神经元的胞体和树突的不同表达
γ-氨基丁酸(GABA)是成年哺乳动物脑内主要的抑制性神经递质,但电生理的研究表明,GABA在成熟皮质神经元的树突部位可以产生兴奋性作用,但该现象的形态学基础,目前尚不清楚.GABA产生兴奋性作用的关键主要依赖于神经元胞内的氰离子浓度,其中Na+-K-Cl-共转运体1(NKCC1)促进细胞内Cl-堆积,而K+-Cl-共转运体2(KCC2)则外排胞内的Cl-,降低胞内的Cl-浓度.本研究应用免疫荧光组织化学双重标记结合荧光强度分析,检测NKCC1和KCC2在成年大鼠脑皮质和培养的大鼠脑皮质神经元树突和胞体的表达和分布情况.结果显示:成年大鼠皮质神经元的胞浆和细胞膜均有NKCC1的表达,而KCC2主要表达在神经元胞体和树突膜上,其中NKCC1在神经元树突上的表达水平比胞体高.而KCC2的表达水平在树突和胞体膜上没有明显差异.皮质神经元经培养20 d后,NKCC1和KCC2在树突和胞体的表达模式与在体的分布相类似.本研究结果提示,NKCC1在大鼠皮质神经元树突的表达较多,可能是GABA兴奋神经元树突的原因.
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氯离子转运体KCC2/NKCC1参与病理性疼痛的研究进展
阳离子氯离子联合转运蛋白(cation-Cl-cotransporter,CCC)是一组转运Na+、K+、Cl-进出细胞的膜蛋白.其中,钾氯联合转运蛋白2(K+-Cl-cotransporter 2,KCC2)和钠钾氯联合转运蛋白1(Na+-K+-C1-cotransporter 1,NKCC1)是调节神经系统氯离子稳态的主要CCC,NKCC1将CI-转运入胞内,KCC2将C1-转运至胞外,两者共同调节氯离子平衡及神经元的兴奋性[1].近年来越来越多的研究表明,KCC2/NKCC1在伤害性信息的传递过程中发挥重要的调节作用,其表达及功能异常促进了病理性疼痛的发生与发展,本文就KCC2/NKCC1与病理性疼痛关系的新研究进展作一综述,以期深入理解KCC2/NKCC1在病理性疼痛发生与发展中的作用.
