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长期培养后小鼠造血基质细胞差异表达基因的筛选
为了进一步研究长期培养体系(long-term culture,LTC)中造血基质细胞调控造血的分子基础及其作用机制,并发现新型造血调控因子,以LTC体系培养后小鼠骨髓造血基质细胞(LTC-St)为被扣除杂交组,以未经培养的小鼠骨髓细胞(BMC)为扣除杂交组,采用抑制性扣除杂交法(SSH)进行杂交,将杂交产物克隆并测序,进行生物信息学分析.结果:获得了131个差异表达EST克隆,这些克隆代表了26种已知或部分已知的不同基因和7条无任何线索的全新基因,5条具有完整开放阅读框架,无功能线索的新基因中3条有信号肽.结论:通过本实验得到了LTC体系中特异性表达的一个消减文库,获得了几条可能与造血调控相关的新型基因或EST,为揭示造血微环境支持造血的分子机制提供了有意义的线索.
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长期体外扩增降低胎盘绒毛膜间充质干细胞的免疫调节功能
本研究主要探讨长期体外培养的胎盘绒毛膜间充质干细胞的各项生物学活性和免疫调节功能的变化.显微镜检观察比较第3代和第9代胎盘绒毛膜的形态,用流式细胞术分析它们的免疫表型.把第3代和第9代CV-MSC与PHA活化的PBMNC共培养,ELISA方法检测其IFN-γ的分泌水平.实时定量PCR的方法检测CV-MSC细胞中COX-2,HGF和HLA-G的表达.结果显示:经过长期传代后,虽然CV-MSC的基本细胞形态和大部分表面标记如CD31,CD34,CD44,CD45,CD62L,CD73,CD90,CD105,CD117,CD151,CD235a,CD271和HLA-DR等都没有明显的变化,但其表面CD49d表达明显上调,长期传代后其免疫调节功能明显下降,免疫调节相关的分子COX-2和HGF的表达也略有下调,而HLA-G表达并未明显的变化.结论:长期体外扩增改变CV-MSC的CD49d的表达,并降低CV-MSC的免疫调节功能.
关键词： 长期培养 胎盘绒毛膜间充质干细胞 免疫调节 -
骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化及其在神经修复中的应用
近几年来,干细胞已成为生物学和医学领域的研究热点.间充质干细胞来源于中胚层,具有很强的自我更新、增殖能力以及多向分化的潜能.而骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenclaymal stem ceIls,BMSCs)因具有易于分离、培养、扩增、长期培养的过程中始终保持多向分化的潜能、免疫原性低、遗传背景稳定等特性,使之成为干细胞研究领域的焦点.近的研究表明BMSCs在体外能被诱导成神经元样细胞,且植入体内能改善神经损伤症状.因此,本文结合新研究进展就体外诱导BMSCs向神经元样细胞的分化及其在神经修复中的应用作一综述.
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体外大鼠肝卵圆细胞的长期培养方法
背景：肝卵圆细胞是目前公认的成体肝干/祖细胞，但其体外长期培养时会不可避免地丢失干细胞的活性。
目的：探索大鼠肝卵圆细胞体外长期培养的方法。
方法：构建2-乙酰胺基芴/部分肝切除肝再生大鼠模型，通过酶消化和Percol 梯度离心分离纯化大鼠异质卵圆细胞并进行免疫染色鉴定，用含表皮生长因子、白血病抑制因子的培养基体外长期培养，后撤去表皮生长因子、白血病抑制因子，通过形态学的观察和分子标志物的检测判断其能否保持干/祖细胞活性。
结果与结论：采用含表皮生长因子、白血病抑制因子的培养基体外培养卵圆细胞4个月后，大鼠异质卵圆细胞仍能表达肝细胞标志物ALB、胆管上皮细胞标志物CK-19，经不含表皮生长因子、白血病抑制因子的培养液继续培养后，卵圆细胞胎肝标志AFP表达量迅速下降。该研究结果表明大鼠肝卵圆细胞在表皮生长因子、白血病抑制因子等培养条件下可长期增殖并保持干细胞活性。 -
SR-1/UM171在beta-地中海贫血来源的造血干细胞长期培养中对于细胞增殖和干性维持的作用研究
目的:探索一次性制备基因修饰自体造血干细胞产品的可能性.方法:将β-地中海贫血患者来源的造血干细胞分为五组, Con组: X-VIVO 20完全培养基;组1: SR-1 + X-VIVO 20完全培养基;组2: UM171 +X-VIVO 20完全培养基;组3: SR-1 +UM171 + X-VIVO 20完全培养基,组4为分选后冻存的CD34+细胞.观察不同的细胞因子或组合对长期培养中CD34+细胞增殖能力、干性维持等的变化.结果:在84小时培养时,组3的CD34+细胞百分比高,达(89.8±4.8) %,细胞数目为(4.13±0.61)×106, CFU检测示其集落形成能力(177.7±5.5)与组4 (178.3±9.5)无统计学差异,小鼠植入试验表明组3和组4在3个月和6个月时,植入能力无统计学差异.超过84小时,无论采用何种方法培养CD34+细胞,其CD34+百分比及集落形成能力均逐渐下降.结论: SR-1、 UM171、 UM171+SR1等细胞因子或组合,均能在造血干细胞增殖的同时,维持干性. 84小时培养, UM171+SR1对于造血干细胞的干性维持效果佳,也能较好地促进增殖,适合用于基因治疗的细胞培养.
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大鼠椭圆囊感觉上皮细胞长期培养体系的建立及毛细胞标记物表达的意义
目的:建立椭圆囊感觉上皮细胞(USEC)长期培养体系,为內耳毛细胞再生研究提供稳定的活性细胞.方法:取1 d龄wistar大鼠,在显微镜下取出椭圆囊上皮,嗜热菌蛋白酶处理,获得具活性的纯椭圆囊感觉上皮,胰蛋白酶+胶原酶消化,培养传代,传25代.取第25代USEC在倒置显微镜、透射电镜下对USEC的生长特征、形态结构进行观察;免疫细胞化学检测细胞角蛋白18、波形蛋白、Brn3.a 及Calretinin的表达.RT-PCR检测毛细胞的特征性标记物AchRa9、Myosin Ⅶa mRNA的表达.结果:USEC细胞培养达6个月传25代,第25代USEC均呈扁平、多角形、核大而圆的上皮细胞形态,细胞之间连接紧密,形成单层时均呈"铺路石样"外观,可见dome结构.该细胞表达角蛋白18和不表达波形蛋白,微绒毛丰富,细胞间连接紧密,提示其上皮起源.第25代USEC表达毛细胞的特征性标志物Brn3.a 、Calretinin及AchRa9、Myosin Ⅶa mRNA,表明长期培养USEC仍具有毛细胞的前体细胞的特性.结论:本实验成功建立了USEC长期培养体系.长期培养的USEC性状未发生明显改变,表达上皮细胞及毛细胞的特征性标志物,具有毛细胞前体细胞的特征.这为毛细胞再生的机制及内耳分子、基因研究提供了稳定的细胞来源.
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MIP-1β，TGF-β抗体对人基质细胞支持的脐血CD34+细胞扩增的作用
目的 研究MIP-1β，TGF-β抗体对人基质细胞支持的脐血CD34+细胞扩增的作用。方法 免疫磁珠法分选脐血中CD34+细胞，接种到预先照射的基质层上。分为4组：MIP-1β（300 ng/ml）组，TGF-β抗体(20 μg/ml)组，MIP-1β+TGF-β抗体(5 μg/ml)组和对照组（不加细胞因子）。第5天半换液并加入MIP-1β，TGF-β抗体(20μg/ml)和MIP-1β+TGF-β抗体(5 μg/ml)。第10天结束培养。第5、10天收获细胞分别做细胞计数，集落培养法检测造血祖细胞数量，流式细胞术检测CD34+细胞数。结果 MIP-1β组第5、10天有核细胞数，造血祖细胞数，CD34+细胞数与对照组相比差异无显著性(P>0.05)。TGF-β抗体组(20 μg/ml)及MIP-1β+TGF-β抗体(5 μg/ml)组第5天有核细胞数与对照组相比差异无显著性(P>0.05)，第10天有核细胞数与对照组相比差异显著(P<0.05)。第5、10天造血祖细胞数，CD34+细胞数与对照组相比有显著性差异(P<0.05)。结论 与对照组相比，MIP-1β对人基质细胞支持的脐血CD34+细胞无明显的体外扩增作用。在TGF-β抗体(20 μg/ml)或MIP-1β+TGF-β抗体(5 μg/ml)作用下，人基质细胞支持的脐血CD34+细胞可在10 d内扩增1～3倍。MIP-1β和TGF-β抗体间存在协同或相加作用。
关键词： 脐血 体外扩增 长期培养 巨噬细胞炎症蛋白-1β CD34+细胞 转化生长因子-β抗体 -
大鼠真皮间充质干细胞的体外长期培养及胶原海绵对其生长的影响
从新生大鼠真皮组织中分离多能干细胞,体外长期传代培养,观察细胞形态和超微结构的变化,检测细胞增殖和分化能力的改变及胶原基质对细胞生长的影响,揭示体外长期传代培养对大鼠真皮间充质干细胞生物学性状的影响.结果表明:大鼠真皮组织中的间充质干细胞体外培养至180 d,传至25代的细胞仍具有干细胞的特征:形态均一,细胞核结构原始,细胞器不发达;体外增殖迅速,保持了向成骨细胞和软骨细胞分化的潜能;胶原基质成分可促进细胞的生长,而胶原海绵支架更利于细胞的三维生长.结论是体外长期传代培养后大鼠真皮间充质干细胞仍保持良好的干细胞特性,为真皮间充质干细胞的深入研究与应用提供了实验依据.
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长期培养的CIK细胞hTERT基因表达水平的动态变化
目的:初步探讨长期培养的CIK细胞hTERT基因表达水平的变化,进一步评价CIK细胞治疗的安全性.方法:抽取3名健康人外周静脉血进行CIK细胞培养,每周台盼蓝染色计数细胞,实时荧光定量PCR法检测培养第0、2、7、21及42天的CIK细胞hTERT基因的表达水平,流式细胞仪分析培养第0、7、14、28、49及56天的CIK细胞周期的改变并检测凋亡,MTT法测定培养第14、30天的CIK细胞对肺癌LTE细胞系的细胞毒活性.结果:CIK细胞在体外培养第28天至第35天细胞增殖达高峰,与第0天相比扩增约6.7至15.95倍,此后存活细胞逐渐减少,终约60天左右细胞全部死亡,与流式细胞仪检测细胞凋亡结果一致.hTERT表达水平在培养48小时高,较第0天增加约(2.84±1.27)倍,随后随培养时间延长表达水平下降,在培养1周时降至培养初始水平,并在此后的培养过程中维持低水平表达.在CIK培养1周时处于S期细胞比例高,约(41.27±4.57)％,随培养时间延长Go/G1期细胞比例占绝大部分,在培养第49天Go/G1期细胞比例在90％以上[(97.56±1.17)％]；CIK细胞在第14天杀瘤活性约(58.58±8.52)％,在30天时杀瘤活性明显下降,约(32.47±7.51)％.结论:长期培养的CIK细胞随培养时间延长hTERT表达水平下降,未见细胞永生化倾向.
