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一种新型肠上皮干细胞分离方法的建立
目的 探讨密度梯度离心法作为一种新型肠上皮干细胞分离方法的可行性.方法 通过腹腔注射大剂量5-氟尿嘧啶(5-FU)制备肠黏膜严重损伤小鼠模型,取出损伤的肠黏膜消化成单细胞悬液,利用Percoll密度梯度离心法分离细胞体积大小不同的细胞群.HE染色观察各群细胞形态特征,免疫细胞化学及RT-PCR检测各群细胞musashi-1(msi-1)的表达.结果 分离的大部分细胞位于50%和70%密度梯度的Percoll分离液体层,50%密度梯度分离液体层中的细胞符合干细胞的形态特征,免疫细胞化学检测其msi-1表达阳性率约为93%,RT-PCR显示该群细胞msi-1 mRNA表达较强.结论 建立了一种简便、有效的分离具有活性的肠上皮干细胞的方法.
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一种分离自体肿瘤细胞与TIL细胞新方法的建立
目的:寻求有效地从恶性胸腔积液和腹水中分离出较多的TIL细胞并保持其高度的增殖能力与抗瘤活性的方法.方法:应用非连续密度梯度离心法与贴壁法对恶性胸腹水中的TIL进行分离,而后进行诱导培养,比较2种方法下TIL细胞的得率、增殖速度、杀瘤活性及培养前后的表型变化.结果:贴壁法能够获得更多的TIL细胞,经统计学处理差异显著,P<0.05;培养后2种方法所得TIL细胞的增殖速率、杀瘤活性及表型是一致的,经统计学处理差异无统计学意义,P>0.05.结论 :贴壁法具有操作简便、细胞得率高的优点,值得临床推广应用.
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实验性变态反应性脑脊髓炎的致敏抗原——髓鞘素的制备
目的介绍实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)的致敏抗原--髓鞘素的一种制备方法.方法取牛脊髓白质加入蔗糖溶液制成脊髓匀浆,在4℃通过不连续梯度离心,得到粗制的髓鞘素,进一步去除其中的磷脂、胆固醇和核酸等成分,得到纯化的髓鞘素.计算其含量,检测其主要成分及相对分子质量,并通过对豚鼠进行免疫,检测其诱发EAE的活性.结果所提取的髓鞘素具有与文献报道结果类似的理化特性和强大的EAE诱发活性.结论本方法提纯的髓鞘素有强的免疫活性,易取材,操作简便,便于推广.
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梯度离心在体外处理精子结合抗体中的应用
目的:比较单纯PureSperm方法和PureSperm联合上游法处理精子结合抗体阳性精子的效果.方法:采用单纯梯度PureSperm及PureSperm联合上游法处理精子结合抗体阳性的精子,比较2种处理方法处理后精子结合抗体消退情况.结果:2种方法处理后,精子结合抗体滴度较处理前降低(P＜0.01)；梯度PureSperm联合上游法处理后,精子结合抗体滴度的下降较单纯PureSperm方法更显著(P＜0.05).结论:采用梯度PureSperm离心或梯度PureSperm离心联合上游法处理精液,可以提高精子质量,再行宫腔内人工授精可能提高免疫性不育的治疗效果.
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体外操作对人精子运动参数及细胞内活性氧簇的影响
目的:研究体外物理操作(离心以及微量加样器抽吸)对入精子运动参数以及细胞内活性氧簇(ROS)的影响,旨在优化人精子体外处理方法.方法:7例精液常规参数正常的标本,采用不同离心力(200 g,600 g)及离心时间(5 min,15 min)以及不同微量加样器抽吸次数(2,6,10次)进行处理,测试精子运动参数和细胞内ROS的变化.结果:①活动精子百分比以及活精子细胞内ROS水平主要受到离心时间的影响(P＜0.05);前向运动精子百分比(PR)以及平均运动速率(VAP)均不受离心力及离心时间的影响(P＞0.05).单因素方差分析多重比较结果提示,当离心时间为5 min以上时精子活动力显著下降,而ROS水平显著增加(P＜0.05).②加样器抽吸2次以上可致人精子活动力显著下降(p＜0.05),抽吸6次以上可导致人精子PR及VAP显著降低(P＜0.05);但抽吸操作并未显著影响精子细胞内ROS的水平.结论:在人精子体外操作时应尽量缩短离心时间并控制加样器抽吸次数从而保证正常的精子运动参数,也应尽量缩短离心时间从而减少体外操作所致的细胞内ROS升高.
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体外操作对小鼠精子参数及内源性ROS的影响
目的:研究体外物理操作对小鼠精子回收率、活动精子百分比、膜完整率以及细胞内活性氧簇(DCFm)的影响,探索佳的小鼠精子体外处理方法.方法:采用不同离心力及离心时间(200,400,600,800×g;5,10,15,20 min),1 mL微量加样器不同抽吸次数(2,4,6,8,10次)以及不同Percoll密度梯度离心条件(600,800,1 000,1 200×g;15,30min)处理小鼠精子,探讨导致各指标变化的原因以及优的处理条件.结果:析因分析结果提示,离心力及离心时间双重因素影响离心操作时精子回收率以及Percoll密度梯度离心活动精子百分比(P＜0.05);离心力单一因素影响离心操作时活动精子百分比以及Percoll密度梯度离心精子膜完整率(P＜0.05);加样抽吸操作可影响精子膜完整率以及活动精子百分比(P＜0.05).离心操作时,当离心力大于600×g时活动精子百分比下降(P＜0.05);加样器抽吸小鼠精子4次以上,小鼠精子膜完整率、活动精子百分比均下降(P＜ 0.05);Percoll密度梯度离心时间30 min,离心力达到800×g以上活动精子百分比与对照组比较升高(P＜0.05),离心力达到1 000×g以上时精子膜完整性与对照组比较降低(P＜0.05).各组存活精子DCFMF-1无变化(P＞0.05).结论:在小鼠精子离心时,离心力应控制在600×g以下;抽吸时次数应控制在4次以下;Pereoll密度梯度离心优条件为800×g 30 min.
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2种纯化流感病毒方法的比较研究
目的比较2种纯化浓缩鸡胚尿囊液中流感病毒方法.方法将流感病毒鸡胚尿囊液分别采用蔗糖密度梯度离心法(sucrose-density-gradient-centrifugation,SDGC)和红细胞吸附释放法(absorption and release-RBC,AR-RBC)进行纯化,收集纯化病毒测定血凝效价,比较2种纯化方法.结果 SDGC法纯化病毒可在 30 % 和 45 % 蔗糖层面交界处的区带中检测到流感病毒,血凝效价为1:2 560;用AR-RBC法纯化病毒过程中用新鲜鸡红细胞出现了溶血现象,而用甲醛处理过的鸡红细胞则无此现象,血凝效价均为1:2 560.结论与SDGC法纯化病毒比较,AR-RBC法是一种经济实用、操作简便并有较高纯化效率的方法,尤以甲醛处理过的鸡红细胞纯化效果好.
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乙型肝炎患者外周血单个核细胞中共价闭合环状DNA的检测及其临床意义
目的 分析HBV感染者PBMC中HBV cccDNA与血清HBV DNA、HBsAg、HBeAg、肝组织学的相关性,并探讨其临床意义.方法 选取108例HBV感染者,密度梯度离心法提取PBMC,实时荧光定量PCR检测PBMC中HBV cccDNA和血清HBV DNA,化学发光定量检测血清中HBsAg和HBeAg,其中59例慢性HBV感染者行肝活组织检查.计数资料比较采用x2检验,计量资料比较采用相关性分析,计量资料不符合正态分布的采用非参数检验.结果 108例HBV感染者PBMC中HBV cccDNA阳性59例,占54.6％,其中15例肝功能衰竭患者HBV cccDNA阳性11例,明显高于8例急性乙型肝炎中2例阳性(x2 =4.960,P＜0.05).根据患者血清HBV DNA载量分为＞5 lg、3～5 lg和＜3 lg拷贝/mL组,其PBMC中HBV cccDNA阳性率分别为76.1％(51/67)、5/18和13.0％(3/23),HBV DNA高载量组与中、低载量组比较,差异有统计学意义(x2值分别为14.751、28.384,均P＜0.05).PBMC中HBVcccDNA与血清HBV DNA载量和HBsAg呈正相关(r值分别为0.554、0.497,均P＜0.05).PBMC中HBV cccDNA在肝组织学≥G2和(或)S2组检出率明显高于＜G2/S2组(x2=9.159,P＜0.05).结论 HBV感染者PBMC中存在HBV cccDNA,且与血清HBV DNA和HBsAg呈正相关,也与肝组织学损伤相关.
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五种抗真菌药物对马尔尼菲青霉菌的体外抗菌活性观察
目的 了解两性霉素B(AMB)、酮康唑(KET)、氟康唑(FCA)、5-氟胞嘧啶(5-Fc)和伊曲康唑(ICA)5种抗真菌药物对马尔尼菲青霉菌体外抗菌活性,为临床用药提供参考依据.方法 采用浓度梯度法(E-test)测试AMB、KET、FCA、5-Fc、ICA 5种抗真菌药物对52株从不同AIDS患者骨髓、血液、皮肤损害标本中分离的马尔尼菲青霉菌酵母相和菌丝相的体外抗菌活性.数据采用U检验.结暴 AMB、KET、FCA、5-Fc、ICA的90%酵母相马尔尼菲青霉菌的低抑制浓度(MIC90)分别为0.250、0.160、24.000、4.000和0.006 mg/L,低抑制浓度(MIC)范围分别为0.004～0.500、00002～0.016、1.000～256.000、0.002～32.000和0.002～0.008 mg/L;对90%菌丝相马尔尼菲青霉菌的MIC90分别为1.500、0.125、256.000、24.000和0.012 mg/L,MIC范围分别为0.064～4.000、0.006～0.940、1.000～256.000、0.125～32.000和0.002～0.064 mg/L.不同抗真菌药对双相马尔尼菲青霉菌的体外抗菌活性不同,以ICA强,其次为KET.酵母相和菌丝相的马尔尼菲青霉菌对同一药物的MIC比较差异有统计学意义(AMB、KET、FCA、5-Fc和ICA的U值分别为4.221 9、1.912、28.798、6.43、7.21,均P＜0.05).结论 进行马尔尼菲青霉菌体外抗真菌药物敏感实验对临床有重要参考意义.
关键词： 获得性免疫缺陷综合征 马尔尼菲青霉菌 抗真菌药 离心法 梯密度 -
密度梯度离心方式对人工授精结局的影响
目的 探讨精液经密度梯度离心时经水平转子和角转子处理后对精液质量及其对人工授精结局的影响.方法 回顾性分析352个人工授精周期,根据梯度离心时转子的不同,分成水平转子组和角转子组两组,精液经密度梯度离心法处理,形态学分析严格按照WHO(World Health Organization)人类精液检验与处理实验手册第五版标准,比较处理后精液质量及两组对妊娠结局的影响.结果 (1)精液质量比较:水平转子组前向运动精子为(89.2±8.5)％、精子浓度为(47.8±14.3)×106/mL、前向运动精子总数为(13.6±6.3)×106;角转子组前向运动精子为(90.1±8.8)％、精子浓度为(43.4±15.1)×106/mL、前向运动精子总数为(12.9±6.1)×106,无统计学差异(P＞0.05).水平转子组和角转子组正常精子比率分别为(18.5±8.2)％和(14.2±5.7)％,两者存在显著性差异(P＜0.05);(2)妊娠结局比较:水平转子组的临床妊娠率为16.5％ (30/182)、流产率为3.3％ (1/30)、活产率为96.7％ (29/30);角转子组生化妊娠率为临床妊娠率为12.4％ (21/170)、流产率为9.5％ (2/21)、活产率为90.5％(19/21),无统计学差异(P＞0.05),生化妊娠率:两组分别为0％ (0/30),19.2％ (5/26),有统计学意义(P＜0.05).结论 密度梯度离心应用水平转子可以降低对处理后精液的精子形态的影响,减少生化妊娠率.
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PureSperm密度梯度法对活动力差精液标本的分离效果
精液的体外处理是人工授精实施中的重要环节,目前常用的精子洗涤方法有精子游动法、玻璃纤维滤过法、血清蛋白滤过法、游动-沉淀法和密度梯度离心法等[1].PureSperm是一种新型、无毒的精子分离剂.PureSperm密度梯度离心法具有操作简便,洗涤效果佳等优越性,已被文献多次报道[2,3],但PureSperm密度梯度离心法对活动力差精子的回收情况报道较少.本中心对采用PureSperm梯度密度离心法处理的少、弱精患者的精液情况进行了详细分析,现报告如下.
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柱前衍生HPLC法测定大鼠肾组织中羟脯氨酸的含量
目的:建立一种测定大鼠肾组织中羟脯氨酸(Hyp)含量的柱前衍生HPLC法.方法:将大鼠肾组织以6 mol · L-1盐酸于110℃水解24 h,加入9-芴甲氧基羰酰氯(FMOC)衍生后,进行HPLC分析.HPLC分析条件为:Phenomenex C18色谱柱(4.60 mm× 150 mm,5(m)；流动相:醋酸钠缓冲液( pH3.78)-甲醇-乙腈(梯度洗脱)；流速:1.0 ml·min-l；柱温:40C；检测波长:265 nm.结果:羟脯氨酸在浓度范围为15.30～612.00 mg·L-1内线性良好(r =0.9999)；回收率为97.4％～103.9％.结论:该方法简单、准确、灵敏,可用于测定大鼠肾组织中羟脯氨酸的含量.
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成人骨髓间充质干细胞体外培养及其生物学特性鉴定
目的 探讨并优化成人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)体外分离培养方法,鉴定其生物学特性,为BMSCs应用奠定技术基础.方法 将手术弃骨无菌条件下用无血清培养液(α MEM培养基、100 u/ml 青霉素,100 u/ml 链霉素)冲出骨髓,采用密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离纯化hBMSCs,通过传代培养,扩增hBMSCs.倒置光学显微镜下观察细胞形态及生长情况,细胞计数法绘制细胞生长曲线,并分析冻存细胞复苏后的生长特性,免疫荧光染色测定hBMSCs表面标志,成骨诱导试剂盒检测hBMSCs向成骨分化的潜能.结果 倒置显微镜下观察hBMSCs呈梭形、多角形成纤维细胞样形态,大小均一,漩涡状生长.细胞生长曲线分析细胞贴壁2 d基本无增殖,处于潜伏期,对数增殖期为3～6 d,第7 天后进入平台期,细胞出现接触抑制现象.冻存细胞复苏后细胞生长特性无明显改变.免疫荧光染色结果显示,第3代hBMSCs 小鼠IgG、 CD34、CD45表达阴性;CD29、CD90、CD166表达阳性,均为胞浆着色,细胞表型稳定.成骨诱导试剂诱导细胞10d后hBMSCs表现成骨细胞特性,且碱性磷酸酶活性明显增高.结论 密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离纯化的hBMSCs纯度高,增殖活性强,传代培养生长旺盛且生物学特性稳定;可为组织细胞工程和基因治疗提供理想的种子细胞.
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恶性胸水肿瘤细胞的分离、纯化及其临床意义
目的探讨恶性胸水肿瘤细胞的分离、纯化方法学以及临床意义.方法在20份胸水标本中,同一份标本分别按离心沉渣法、密度梯度离心法和不连续密度梯度离心法3种方法分为3组检测:细胞病理学(Ⅰ组)、单个核细胞(Ⅱ组)、肿瘤细胞(Ⅲ组).分别计算各组阳性率,各组间率的比较行配对资料χ2检验.结果Ⅰ组:肿瘤细胞阳性率为45%(9/20);Ⅱ组:肿瘤细胞阳性率为65%(13/20);Ⅲ组:肿瘤细胞阳性率为20%(4/20).Ⅰ组与Ⅱ组、Ⅰ组与Ⅲ组组间比较差异均无显著性(P>0.05),Ⅱ组与Ⅲ组比较差异有显著性(P<0.01).结论采用密度梯度离心法和不连续密度梯度离心法可以从恶性胸水中分离出肿瘤细胞,并有助于鉴别恶性胸水中肿瘤细胞的细胞分化和细胞起源.
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骨髓基质细胞不同培养方法效果比较
目的:观察全骨髓培养法与密度梯度离心法对培养骨髓基质细胞的效果差异,建立简单、经济、实用分离骨髓间充质干细胞方法.方法:体外提取骨髓基质细胞,分别采用全骨髓培养法与密度梯度离心法培养骨髓基质细胞,观察细胞形态学、细胞活力、细胞周期及细胞表面分子表达差异.结果:两种方法均能有效培养出骨髓间充质干细胞,各细胞周期的细胞检出率无显著差异(P>0.05),细胞形态学无差异,细胞表面分子CD34、SH1、SH2、SH3表达差异不显著(P>0.05).结论:全骨髓培养法在分离培养骨髓基质细胞方面与密度梯度离心法具有类似效果.
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小鼠肝Kupffer细胞分离方法探讨
目的 探讨分离BALB/c小鼠肝Kupffer细胞(KC)的方法.方法采用在体酶灌注和离体酶消化、不连续密度梯度离心、选择性贴壁三步法分离KC,并比较链霉蛋白酶、Ⅳ型胶原酶及联用链霉蛋白酶和Ⅳ型胶原酶等3种不同酶消化分离方法所得KC得率及纯度.结果3种不同酶消化分离方法细胞得率分别为(6.32±0.5)×106 g-1,(3.66±0.4)×106g-1,(10.3±0.7)×106 g-1;细胞纯度分别为(93.2±1.7)％,(90.7±1.5)％,(94.5±1.9)％.结论联合链霉蛋白酶和Ⅳ型胶原酶在体灌注和离体消化是分离小鼠KC的较好方法.
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大鼠肝星形细胞、枯否细胞的同步分离培养与鉴定
目的:建立经济、简便的同步分离培养肝星形细胞及枯否细胞的方法.方法:应用胶原酶和蛋白酶对大鼠肝脏进行原位灌流、消化,获得大鼠肝脏非实质细胞,经18%(W/V)的Nycodenz密度梯度离心,一步分离肝星形细胞及枯否细胞;肝星形细胞处在界面,枯否细胞则处在界面下;台盼蓝染色鉴定细胞活力;Desmin免疫细胞化学染色鉴定肝星形细胞;溶菌酶免疫细胞化学染色鉴定枯否细胞.结果:该方法分离的肝星形细胞和枯否细胞的纯度达95%左右.肝星形细胞得率(3.0±0.5)×107/肝,枯否细胞得率(4.0±0.5)×106/肝.结论:应用Nycodenz一步密度梯度离心法可以很好的同时分离肝星形细胞和枯否细胞.
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自体树突状细胞体外诱导扩增方法的安全性改进
目的:改进从外周血获得自体树突状细胞的方法的临床安全性.方法:密度梯度离心法分离鼻咽癌患儿外周血单个核细胞(PBMC),贴壁法获得单核细胞,以IL-4、GM-CSF、TNF-α和人血浆进行诱导扩增树突细胞(DC)并进行表面分子鉴定,同时检测其对自体外周血T细胞的刺激作用.结果:成功培养并扩增出成熟度较高的DC,平均从每1 mL外周血扩增出的DC数量达到(3.2±1.1)×105,这些DC具备很强的刺激T细胞增殖的能力.结论:本法可从外周血扩增大量自体树突状细胞,有很强的刺激自体T细胞增殖的活性,并增加临床应用的安全性.
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孕妇外周血中胎儿有核红细胞的富集及鉴定
目的:建立富集分离孕妇外周血胎儿有核红细胞的方法,并证实其为胎儿来源.方法:以血型糖蛋白A(GPA)为识别标志,对5例孕12～40周的孕妇外周血进行密度梯度离心富集胎儿有核红细胞,并经流式细胞分析及PCR技术扩增Y特异性序列以鉴定富集效果.结果:5例孕妇外周血富集后流式细胞分析结果,GPA+细胞含量平均为上层2.38%,下层18.18%,富集后下层GPA+细胞含量是上层的7.6倍;PCR扩增结果,2例阳性,3例阴性,所得结果与实际性别吻合.结论:胎儿有核红细胞的富集及鉴定为无损伤性产前诊断的临床应用开辟了诱人前景.
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快速大量分离血浆低密度脂蛋白亚组分的方法
目的:研究快速大量分离低密度脂蛋白亚组分的方法.方法:通过2步超速离心法分离LDL亚组分,并用电泳法及电镜观察鉴定2种亚组分.结果:仅用10 h就将LDL亚组分分开,并证实经分离的2种亚组分为纯品.结论:本方法是1种分离LDL亚组分较好方法.
