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RGD-重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白原核表达、纯化及鉴定
目的 构建RGD-重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达融合蛋白,纯化并初步鉴定其生物学活性.方法 利用重叠延伸PCR获得目的融合基因片段RGD-rSAK-α1M,插入带有His-GST标签的原核高效可溶性表达载体PEGX-6P-1中.经酶切鉴定后,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21菌株,IPTG诱导目的蛋白表达,经Ni+亲和层析柱纯化后用3C蛋白酶切除重组蛋白的His-GST标签,再利用DEAE离子交换柱和分子筛纯化蛋白.后应用纤维蛋白平板溶圈法和血小板聚集抑制试验分别测定评价重组融合蛋白的溶栓活性和抗血小板聚集作用.结果 1)成功构建了RGD-重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白.2)实现了目的融合蛋白在大肠杆菌上清液中的高效表达,并纯化了融合蛋白.3)体外实验表明纯化后的融合蛋白纤溶活性同尿激酶标准品无明显差异.4)融合蛋白抗血小板聚集作用较单纯重组葡激酶明显提高.结论 经文献检索确认为首次获得了纯化的RGD-重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白,并验证了其纤溶活性和尿激酶标准品无明显差异,而抗血小板聚集作用较单纯重组葡激酶增强,为下一步进行融合蛋白免疫原性鉴定奠定了基础.
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一种灵敏的体外溶栓活性检测方法--薄层聚丙烯酰胺纤维蛋白胶板法的建立
目的建立一种用于体外溶栓活性精确定量分析和高通量溶栓药物筛选鉴定的方法.方法使用聚丙烯酰胺代替琼脂糖作载体,用平板电泳制胶模具代替玻璃或塑料平皿制作可控制厚度的、均匀的薄层聚丙烯酰胺纤维蛋白胶板,用染色剂指示纤维蛋白降解情况.结果适条件为胶板胶含0.5 mg·mL-1纤维蛋白原和10%丙烯酰胺,加样后37℃保湿温育8~12h,用考马斯亮蓝染色,观察纤维蛋白降解后产生的透明圈.本方法低可检测出25ng蚓激酶的活性;蚓激酶浓度在0.01~5mg·mL-1时,浓度对数与其所产生的透明圈两垂直直径算术平均值平方的对数成良好的线性关系(r=0.999 7);重复性试验RSD为3.83%(n=5).结论本方法是一种值得推广的溶栓活性体外检测方法.
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溶栓活性体外检测方法概况
心血管系统疾病是人类为常见的一类疾病,已成为当今世界人口的第一大死因,而由心血管疾病引发的血栓并发症,是造成死亡或病残的主要原因之一.
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中国根霉溶栓活性成分高产菌株的选育
中国根霉虽然能产生溶栓活性组分,但在发酵液中其活性成分浓度过低,影响活性组分的应用和分离纯化.因此,有必要对出发菌进行改造.
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参环毛蚓中溶栓活性蛋白酶的纯化和检测
参环毛蚓Pheretima aspergillum(E.Perrier)为<中华人民共和国药典>2000年版一部中收载的地龙药材来源之一.地龙始载于<神农本草经>,具有通络、利尿、清热、定惊、平喘之功,临床常用于高热神昏、惊厥抽搐、关节痹痛、半身不遂、高血压等.日本学者从赤子爱胜蚓中提取出类似尿激酶的物质,用于治疗血栓性疾病[1].近年来,随着分离技术的飞速发展及其广泛应用,对不同品种蚯蚓溶栓活性蛋白酶进行了一系列的研究,但参环毛蚓(广地龙)作为药典品种及市场上流通广的地龙药材研究相对较少.本实验对其抗栓活性部位进行了考察,采用凝胶柱色谱法在溶栓活性部位中分离得到一种溶栓活性的蛋白酶.
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具溶栓活性的蛹虫草提取物和日本拟青霉提取物的制备
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土鳖虫酶解液DA201-C不同洗脱部位溶栓活性药效学筛选
目的:通过对土鳖虫酶解液不同DA201-C大孔树脂洗脱部位进行溶栓活性的药效学筛选,筛选其强活性部位.方法:以凝血块体外溶解率;角叉菜胶血栓模型24、48 h黑尾长度及黑尾形成率及72 h眼眶取血凝血时间为检测指标,利用角叉菜胶诱发小鼠血栓模型进行筛选.结果:75%乙醇洗脱部位能够显著地增加凝血块体外溶解率、缩短大鼠黑尾长度、延长小鼠凝血时间.结论:土鳖虫酶解液DA201-C型大孔树脂75%乙醇洗脱部位具有明显的溶栓活性.
关键词: 溶栓活性 角叉菜胶 DA201-C型大孔吸附树脂 洗脱部位 土鳖虫 -
水蛭提取方法及生理活性的研究
目的 筛选较优的水蛭提取方法.方法 采用原粉匀浆、水煎煮、水煎醇沉、胃蛋白酶酶解、胰蛋白酶酶解、仿生酶解等不同的方式提取水蛭,考察各提取方法的得膏率、对凝血酶原时间、纤溶活性、大鼠凝血时间及静脉血栓重量的影响.结果 各项指标中以上六种工艺与空白对照组相比较均有显著性差异(P<0.05);各酶解工艺组与空白对照组相比有极显著性差异(P<0.01),其中仿生酶解液组与匀浆液组相比有极显著性差异(P<0.01),仿生酶解组明显优于其他酶解组,同时仿生酶解的得膏率高.结论 仿生酶解方法所得样品液的得膏率及生理活性作用较其他提取方法有极大提高,生物利用度更高,值得推广应用.
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纳豆激酶溶栓活性的测定方法
简介人体纤维蛋白溶解系统的生理学背景,对以此为依据建立的纳豆激酶溶栓活性测定方法进行了概括总结.
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土鳖虫多肽的分离纯化及溶栓活性研究
目的 对土鳖虫多肽进行分离纯化,并对其溶栓活性进行研究.方法 采用仿生酶解工艺制备土鳖虫复合多肽,以溶栓活性为指标,采用Sephadex G-25、SP Sephadex C-25凝胶柱和RP-HPLC C18半制备色谱柱对复合多肽进行分离纯化,并测定目标多肽组分(Peak b)的溶栓活性、肽含量和分子量.结果 目标多肽组分的溶栓活性为814 430 U·mg-1,肽含量为95.7%,分子量分布在3 211 ~3 547.结论 利用仿生酶解制备的土鳖虫多肽,经分离纯化后,得到一具有较强溶栓活性的多肽组分.