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人参二醇、三醇皂苷对人骨髓造血祖细胞增殖作用的研究
目的:探讨人参二醇皂苷(panaxadiol saponin,PDS)和三醇皂苷(panaxtrol saponin,PTS)对骨髓造血祖细胞增殖的作用.方法:从人参总皂苷进一步分离纯化出PDS和PTS,用体外造血祖细胞集落形成技术,观察PDS、PTS对小鼠骨髓红系祖细胞(CFU-E、BFU-E)、粒-单系祖细胞(CFU-GM)和多向祖细胞(CFU-Mix)的刺激增殖作用.结果:不同浓度的PDS(2.5～200μg/ml)可促进造血祖细胞增殖;CFU-E,BFU-E,CFU-GM和CFU-Mix集落产率均显著高于对照组(P＜0.05),提高率(%)分别达54.9±6.3、 48.8±5.1、27.6±4.2和48.9±3.9.而PTS在同样浓度时,CFU-E、BFU-E产率均显著低于对照组(P＜0.05);终浓度为200μg/ml时,CFU-E、BFU-E集落产率为零.在CFU-GM培养中,12.5μg/ml浓度的PTS使集落产率提高(29.7±2.2)%(P＜0.05);而100μg/ml和200μg/ml的PTS却出现对CFU-GM的抑制作用,抑制率分别为(48.6±3.9)%和100%.结论:PDS是总皂苷内促进造血的有效成分,而PTS对红系祖细胞具有抑制作用,对粒-单系祖细胞的作用呈剂量依赖关系.
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急性髓性白血病细胞体外培养及其生物学特性的研究
目的:研究急性白血病细胞体外培养的方法及其在体外培养过程中生物学特性的变化.方法:分别收集10例急性髓性白血病细胞,用含细胞因子无血清液体培养基进行培养2～4周,并对培养前后细胞进行细胞计数,流式细胞仪检测CD33、CD13、CD34及CD14表面抗原鉴定细胞分化,半固体培养法对培养前后的白血病细胞进行集落形成能力检测.结果: 含细胞因子无血清液体培养基能有效支持AML细胞进行体外短期培养及增殖, 14 d时细胞得到明显增殖,达(25 1±11 7)倍,优于培养前,P<0 05;培养28 d时细胞数较前明显减少,P<0 05.集落形成单位培养14 d后与培养前比较差异无统计学意义,P>0 05;但培养28 d后显著低于培养前,P<0 05.在体外悬浮培养14 d时,CD33、CD13、CD34及CD14的表达率与培养前差异无统计学意义(P>0 05),但至28 d时,CD33、CD13及CD14的表达率高于培养前,而CD34表达率比培养前降低,P<0 05.结论: 含细胞因子无血清液体培养基能有效支持急性髓性白血病细胞短期体外培养并维持其生物学特性.
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急性心肌梗死患者循环内皮祖细胞不同集落成分数目及功能的变化
目的 探讨急性心肌梗死(AMI)患者循环内皮祖细胞(EPCs)不同集落成分数目及功能的变化.方法 入选28例AMI患者、22例稳定型心绞痛(SA)患者和19例健康志愿者.所有受试者取肘静脉血,密度梯度离心法获得单个核细胞(MNCs),用含生长因子的内皮培养基接种于纤连蛋白包被的培养板中.第7天和21天分别计数早期和晚期集落数目,流式细胞技术检测细胞表面抗原表达,直接荧光染色法测定细胞结合荆豆凝集素及摄取乙酰化低密度脂蛋白,ELISA法测定上清液中血管内皮生长因子(VEGF)浓度.结果 早期集落属于单核细胞系列并能分泌VEGF,晚期集落可向内皮细胞分化.AMI患者早期集落数目(7.3±3.4)显著高于SA患者(4.2±2.8,P＜0.05)和健康对照者(3.6±1.9,P＜0.01),但其分泌VEGF水平与后两组相比显著降低(P＜0.05和P＜0.01).EPCs晚期集落数目在AMI组(1.6±2.1)显著低于SA组(2.9±1.5,P＜0.05)和健康对照组(3.2±2.3,P＜0.05).结论 心肌梗死急性期循环内皮祖细胞早期集落数目增加,但其分泌功能严重受损并导致晚期集落数目减少.
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免疫相关全血细胞减少患者骨髓造血祖细胞增殖功能及辅助性T淋巴细胞功能观察
目的了解与免疫相关全血细胞减少患者骨髓造血祖细胞增殖分化功能以及辅助性T(Th)淋巴细胞在此类患者发病中的作用.方法采用甲基纤维素法培养25例初诊、15例治疗后血常规恢复的免疫相关全血细胞减少患者和10名正常人的CFU-GM、CFU-E、BFU-E;采用RT-PCR方法,检测25例初诊、15例治疗后血常规恢复的免疫相关全血细胞减少患者、19例其他全血细胞减少症患者和10名正常人未经体外刺激的骨髓单个核细胞(BMMNC)中Th1细胞的代表因子IFN-γ、IL-2和Th2细胞的代表因子IL-4、IL-10的基因表达.结果初诊组、治疗后血常规恢复正常的免疫相关全血细胞减少患者组、正常对照组BMMNC培养CFU-E、CFU-GM、BFU-E产率,三组差异均无显著性(P均＞0.05),Th2型细胞因子IL-4、IL-10mRNA的表达在初诊组明显增高,与正常对照组比较,P均＜0.01;经治疗血常规恢复正常后趋于正常,与正常对照组比较,P均＞0.05.Th1型细胞因子IFN-γ、IL-2 mRNA的表达在所有免疫相关全血细胞减少患者均无增高,与正常对照组比较,P均＞0.05.结论引起免疫相关全血细胞减少患者全血细胞减少的原因可能并非骨髓造血祖细胞本身质的异常,而是造血祖细胞以外的因素;Th细胞亚群功能失衡、Th2细胞功能亢进可能是此类患者B淋巴细胞数量和功能异常,从而不断地产生自身抗体并进一步破坏或抑制骨髓造血的重要原因.
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新的人趋化素样因子对骨髓造血干/祖细胞的体外刺激作用
目的探讨新克隆的人趋化素样因子(chemokine-like factor 1, CKLF1)对人造血干/祖细胞的体外刺激作用.方法分离正常人骨髓单个核细胞,进行液体和半固体集落培养,研究CKLF1对CFU-GM和CFU-Mix的作用.结果加入转染CKLF1质粒上清组的CFU-GM集落数明显增多,平均值为每105细胞234.81±98.71,为对照组的2.42倍(P<0.05);CFU-Mix平均集落数在正常对照、CKLF1、PHA和GM-CSF组分别为每105细胞82.00±20.25, 105.76±36.70, 146.63±27.09和143.33±60.23, CKLF1的集落数多且较大,但统计学上差异无显著性;流式细胞术检测CD34+细胞百分率,正常对照、CKLF1、PHA、GM-CSF组分别为(0.75±0.62)%,(1.32±0.87)%,(0.15±0.02)%,(0.29±0.23)%, 与对照组相比,各组间差异无显著性.结论新发现的具有CC家族结构的人趋化素样因子CKLF1对骨髓CFU-GM集落的形成具有促增殖作用,提示CKLF1对人骨髓造血祖细胞的增殖和集落形成具有促进作用.
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人外周血与脐血内皮祖细胞生物学特性的比较
背景：内皮祖细胞可从外周血与脐血中获取，是修复各种疾病所致损伤的血管内皮细胞不可或缺的细胞来源。目的：比较人外周血与脐血来源的内皮祖细胞经体外培养后生物学特性的差异。
方法：通过密度梯度离心法和6%羟乙基淀粉结合密度梯度离心法分别分离人外周血与脐血中的单个核细胞，分别设为脐血源组和外周血源组，计数各组单个核细胞数量，按1.0×106/cm2接种于大鼠尾胶包被的培养皿中，用内皮细胞培养基进行诱导，共培养7d。
结果与结论：外周血与脐血体外培养分离出内皮祖细胞具有类似的形态学特征。光学显微镜下观察，随着培养天数的增加，大多数细胞由早期的贴壁圆形转变为梭形。外周血源组内皮祖细胞有细胞集落形成，脐血源组可见梭形细胞自行排列生长为典型的线样结构。锥虫蓝染色及绘制细胞生长曲线后发现，外周血源组单个核细胞及内皮祖细胞数量、内皮祖细胞活率及增殖能力均低于脐血源组(P<0.05)。外周血源组和脐血源组内皮祖细胞在接种后第3天增殖速度达到峰值，在随后的培养中细胞增殖呈衰减态。流式细胞仪及免疫荧光染色检测结果显示，外周血源组和脐血源组内皮祖细胞均可表达具有内皮祖细胞表型的CD133、CD34和血管内皮细胞因子受体2表面标志物，两组既摄取Dil标记乙酰化低密度脂蛋白，也能标记体外内皮祖细胞的标志物荆豆凝集素Ⅰ。结果证实，脐血来源的内皮祖细胞与外周血来源的内皮祖细胞生物学特性相近，脐血来源的内皮祖细胞增殖能力更强。 -
墓头回诱导脐血基质细胞生长促粒-单系和红系造血祖细胞集落形成的研究
目的 研究中药墓头回对脐血基质细胞促粒-单系和红系造血祖细胞集落形成的影响.方法 收集12例脐血单个核细胞(MNC),加入不同浓度的墓头回水提物共培养14天,基质细胞层形成后,消化,计数;收集基质细胞多浓度的上清液(MTH-PSCS),以不同比例与MNC共同加入集落培养基中共培养14天,计数粒-单系和红系造血祖细胞集落数.结果 0.01μg/ml的墓头回与MNC共孵育14天后,基质细胞的数量(14±2.8)×105/ml明显多于对照组(9±2.2)×105/ml.0.01 μg/ml的MTH-PSCS以0、5、10、20比例作用后,脐血粒-单系造血祖细胞集落数分别为17±6、121±24、268±27、114±31、68±11,10%的MTH-PSCS作用为明显;脐血红系造血祖细胞集落数分别为38±12、72±23、81±9、159±45、90±32,其中以20%的MTH-PSCS作用为明显.结论 中药墓头回可诱导脐血基质细胞的生长,可以促进粒-单系和红系造血祖细胞集落的形成.
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人肺癌抗原对脐血有核细胞凋亡、细胞周期及集落形成的作用研究
目的研究人肺癌抗原(Ag自提)对脐血有核细胞(CBNC)凋亡、细胞周期及集落形成的作用.方法用流式细胞计数仪检测并进行分析.结果单纯人肺癌抗原对CBNC凋亡、细胞周期及集落形成均无明显影响.与IL-2联合应用2周可显著降低CBNC的凋亡率,提高合成分裂期细胞百分率,培养21天时形成的集落数明显升高.结论单纯抗原刺激对脐血有核细胞凋亡、细胞周期及集落形成均无任何副作用,而抗原与IL-2联合应用可显著降低CBNC凋亡率,提高合成分裂期细胞百分率及集落形成率,可以临床试用.
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IL-15联合其他细胞因子对MDS患者CD34+细胞体外增殖、分化的影响
为了探讨IL-15与其他细胞因子联合应用对体外培养的MDS患者CD34+细胞增殖和分化的影响.应用单克隆抗体(mAb)免疫磁珠系统分离CD34+细胞,实验分为IL-15加其他细胞因子的实验组和不加其他细胞因子的单独应用IL-15的对照组,用液体培养基和甲基纤维素半固体培养基培养,计数培养后细胞数和CFU-E、BFU-E、CFU-GM、CFU-GEMM的集落形成数.用流式细胞术检测上述培养细胞上各种表型分子CD33、CD13、CD71、CD19、CD3表达的变化和细胞周期的改变.结果显示IL-15与其他细胞因子联合应用的实验组作用于MDS患者CD34+细胞,培养6 d的细胞计数显示,细胞增殖倍数对照组为4.0倍,实验组为7.8倍;各祖细胞集落形成率实验组均明显多于对照组;培养细胞上各表型分子(CD3除外)的表达率实验组均明显高于对照组;IL-15加其他细胞因子联合应用后CD34+细胞的细胞周期G1、S、G2期的比率均有明显变化,与对照组相比较,差异显著.IL-15与其他细胞因子联合应用比单独应用IL-15对MDS患者CD34+细胞有明显地促增殖和诱导分化的效应.
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体外培养的小鼠骨髓基质细胞对血细胞集落形成的支持
为探讨骨髓基质细胞在液体条件下支持造血的能力,对小鼠骨髓有核细胞体外培养,在液体培养基中形成基质细胞贴壁层,更换培养液,再种植骨髓有核细胞.结果在贴壁的基质细胞上形成了细胞集落.按细胞形态特征分为两类:一类为基质细胞集落,仅为偶见.另一类为造血细胞集落,数量较多,并且集落通过一定的结构与贴壁的基质细胞连接.结果提示,造血细胞集落的形成,需要有与骨髓基质细胞接触的微环境,并可对基质细胞的生长发育有一定的反作用.本文提出了造血细胞集落的液体培养法.
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人重组白细胞介素-8对正常小鼠造血细胞的快速动员作用
目的研究rhIL-8对正常小鼠造血细胞的快速动员作用.方法将rhIL-8以不同剂量给BALB/c小鼠腹腔注射,在不同时间内取外周血计数白细胞(WBC)、单核细胞(MNC),作粒-巨噬细胞集落形成单位(CUF-GM)培养,研究rhIL-8对造血细胞的动员作用.结果腹腔注射rhIl-8＜10μg主要动员成熟粒细胞进入外周血,10μg以上可以动员造血干/祖细胞(HSC/HPC)进入外周血,15～30min作用达到高峰,以后逐渐下降,作用持续2h以上;30μg为佳剂量,HSC/HPC数量可增加10～20倍以上.结论 rhIL-8具有快速有效的动员造血干/祖细胞的作用.
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5种造血生长因子对造血祖细胞集落形成的影响
目的探讨IL-3、IL-6、GM-CSF、G2、PIXY321对骨髓造血祖细胞集落形成的影响.方法 5种造血生长因子分别采用100、250、500、750、10 00 u/ml浓度,进行骨髓造血祖细胞集落培养,从中找出峰值浓度,然后在峰值浓度下进行集落培养,计数不同造血生长因子条件下所形成的集落.结果 IL-3、IL-6、GM-CSF、G2、PIXY321对造血祖细胞集落形成的峰值浓度分别为100、100、250、750、25 0 u/ml.峰值浓度下,对CFU-E、BFU-Em、BFU-Eim、CFU-GM形成的作用强度不同,PIXY321 条件下所形成的集落数多.结论这五种造血生长因子对骨髓造血祖细胞的集落形成均有促进作用,PIXY321效果显著.
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人重组白细胞介素-8对正常BALB/c小鼠骨髓细胞的影响
目的研究rhIL-8对正常小鼠骨髓细胞的体内效应。方法通过细胞培养及流式细胞术（FCM）研究rhIL-8对正常小鼠骨髓细胞是否具有集落刺激效应。结果体内实验表明，rhIL-8并不能改变骨髓细胞的CFU-GM计数及细胞周期的分布。结论 rhIL-8对正常小鼠骨髓细胞不具有集落刺激效应。
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氨磷汀与峰龄多糖对外周血造血干细胞的刺激增殖及协同作用
目的研究氨磷汀(WR-2721)和峰龄多糖(FLPS)对人外周血造血干/祖细胞的刺激增殖及协同作用.方法分离单个核细胞(MNC),进行甲基纤维素半固体培养,观察氨磷汀和峰龄多糖对骨髓粒-巨噬细胞集落(CFU-GM)的作用.结果经0.01～5.0 mmol/L氨磷汀37℃作用30分钟的MNC以及峰龄多糖0.5～25μg/ml时CFU-GM集落数均显著高于对照组(P＜0.05),且集落较大.CFU-GM平均集落数在对照组、WR-2721(1 mmol/L)组、FLPS(5μg/ml)组和AMF+FLPS组每105MNC分别为91.4±50.4、119.8±62.9、143.2±76.4和179.2±97.6,各组与对照组相比,差异有显著性(P＜0.05);AMF+FLPS组CFU-GM集落数显著高于AMF和FLPS组(P＜0.01和＜0.05).结论氨磷汀和峰龄多糖对CFU-GM具有明显的刺激增殖及协同作用.
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人参二醇、三醇皂苷对小鼠骨髓造血干/祖细胞体外增殖的影响
人参总皂苷按单体皂苷皂苷元所含羟基量不同分为人参二醇皂苷(Panaxadiol Saponin;PDS)和人参三醇皂苷(Panaxtrol Saponin;PTS)两大类.有关人参总皂甙对造血方面的研究也已有不少报道[1～3],而PDS和PTS对造血祖细胞作用研究还未见报道.本文采用体外造血祖细胞集落形成技术,通过观察PDS和PTS对小鼠骨髓造血干/祖细胞增殖的作用影响,目的在于探讨人参总皂苷中不同的皂苷成分对造血祖细胞的作用,筛选人参中促造血有效成分,为开发利用天然植物资源提供实验依据.
关键词： 人参二醇 (PDS) 人参三醇 (PTS) 造血祖细胞 集落 -
白细胞介素-15对骨髓增生异常综合征骨髓造血干/祖细胞增殖的影响
目的:观察白细胞介素(IL-15)对体外培养的骨髓增生异常综合征(MDS)患者CD34+细胞增殖作用.方法:应用单克隆抗体免疫磁珠分离系统提取MDS患者CD34+细胞,以加IL-15组为实验组,不加IL-15组为对照组,进行液体和甲基纤维素半固体集落培养,计算培养后细胞数和CFU-E、BFU-E、CFU-GM、CFUGEMM等集落数,并用MTT比色法检测IL-15对MDS患者CD34+细胞增殖的抑制作用,流式细胞术检测上述培养细胞周期的变异情况.结果:11例MDS对象平均CD34+细胞比例、回收率、纯度和富集倍数均达要求,MTT比色法检测IL-15对CD34+细胞的增殖作用呈佳浓度效应,佳浓度为20μg/L,细胞增殖抑制低峰值时间为8 d.用0μg/L IL-15(对照组)和20μg/L IL-15(实验组)作用MDS CD34+细胞,计数显示培养细胞大增殖倍数和集落形成比率实验组均较对照组明显增加,IL-15作用后各细胞周期G1、S、G2期比例有明显改变,与对照组比较,差异有统计学意义.结论:IL-15对MDS CD34+细胞有促增殖效应,与其它造血生长因子具有协同作用,对MDS治疗可能有一定的应用前景.
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脐血单个核细胞体外扩增的实验研究
目的 探讨含有细胞因子的无血清培养基对脐血单个核细胞(MNC)体外培养后的扩增情况和用于移植的安全性.方法 从新鲜脐血中分离出的MNC,在含细胞因子的无血清培养体系中培养.分别将培养前和培养第10天时的造血细胞进行细胞计数、细胞活力分析、集落分析、流式细胞仪检测表面标记、彗星试验分析DNA的损伤情况、无菌性分析及移植至NOD/SCID小鼠体内等项研究.结果 经过体外短期培养,脐血中MNC、CD34+、CD133+、CD34+CXCR4+及CD34+ VLA-4+细胞扩增倍数均比培养前增高(P<0.05);半固体培养基可支持多系集落的生长;培养前和培养第10天时脐血细胞DNA损伤率均低于5%;无菌性分析提示细胞未受污染.将体外扩增后的脐血造血细胞移植入NOD/SCID小鼠体内,与新鲜脐血移植相比,小鼠的存活时间及植入能力的差异均无统计学意义(P>0.05).结论 脐血造血细胞体外扩增是解决脐血造血细胞数量不足的有效方法.脐血造血细胞经短期培养能为造血干细胞移植提供安全而具植入能力的造血细胞.
关键词： 脐带血 集落 彗星试验 移植 NOD/SCID小鼠 -
冠心病患者外周血晚期内皮祖细胞集落数量与功能的变化
目的 探讨冠心病患者外周血晚期内皮祖细胞集落数量和功能的变化.方法 入选研究对象54例,分成冠心痛组(n=27)和对照组(n=27).密度梯度离心法从外周血中获得单个核细胞,体外培养扩增21天后鉴定内皮祖细胞,计数晚期集落数量,分别用MTT比色法、改良的Boyden小室法和HFN培养板测定晚期内皮祖细胞的增殖、迁移和黏附功能.结果 冠心痛组内皮祖细胞晚期集落数量(2.5±1.2)与对照组(3.8 ±1.6)相比,明显减少(P<0.05);增殖、迁移和黏附能力与对照组比较(分别为0.324±0.024比0.433 ±0.064.9.9 ±2.5比13.9±4.1,21.3±5.1比31.0±7.1)显著降低(P<0.05).结论 冠心痛患者晚期内皮祖细胞的数量减少,功能受损.
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冠心病患者外周血内皮祖细胞的数量和活性
目的 研究冠心病患者外周血中内皮祖细胞的数量、形态和活性.方法 选择冠心病患者57例和正常对照者30例,用密度梯度离心法从外周血获取单个核细胞,将其接种在人纤维连接蛋白包被的培养板,用加入血管内皮生长因子165和碱性成纤维细胞生长因子的1640培养基培养细胞,并分析细胞形态和形成集落的数量,7 d后贴壁细胞进行细胞分析和计数.用激光共聚焦显微镜鉴定FITC标记的荆豆凝集素和Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白,双染色阳性细胞为正在分化的内皮祖细胞;用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD34和KDR;采用MTT比色法检测细胞的生长状态.结果 冠心病患者外周血内皮祖细胞数量较对照组明显减少(23.1±1.8个/200倍比56.7±2.4个/200倍,P<0.05),形成细胞集落数(14.7±2.5个/40倍比24.2±1.7个/40倍,P<0.05)、细胞增殖能力和生长曲线也明显降低.结论 冠心病患者外周血内皮祖细胞的数量和活性明显降低.
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药物改善骨髓增生异常综合征细胞无效造血的体外研究
目的:探讨N-乙酰半胱氡酸(NAC)和全反式维甲酸(ATRA)对骨髓增生异常综合征(MDS)患者骨髓细胞粒-单系祖细胞集落数(CFU-GM)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)浓度的体外影响.方法:应用甲基纤维素半固体培养法,观察不同浓度NAC和ATRA联用及单用与患者及正常人骨髓细胞体外培养后CFU-GM的变化,应用ELISA方法,观察不同浓度NAC与患者及正常人体外培养后上清液TNF-α浓度的变化.结果:0.3 mM NAC浓度使MDS患者CFU-GM增高、TNF-α浓度降低(P<0.01),3μM ATRA使MDS患者集落数明显增加(P<0.01),而对正常人无明显影响(P>0.05),NAC与ATRA联用较单用NAC集落数明显增高(P<0.01).结论:NAC、ATRA可改善MDS无效造血,可试用于MDS的治疗.
