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血竭含药血清对雪旺氏细胞NGF,BDNF,CNTF,LNGFR,TrkA,GDNF,GAP-43和NF-H表达的影响
目的:观察血竭含药血清对雪旺氏细胞NGF,BDNF,CNTF,LNGFR,TrkA,GDNF,GAP43和NF-H表达的影响,探讨其促进周围神经再生的可能机制.方法:SD大鼠随机分为血竭给药组(灌服血竭的香油溶液)和空白对照组(等体积香油),制备血竭含药血清和空白对照血清.选取出生3 dSD大鼠双侧坐骨神经制备雪旺氏细胞;将培养的雪旺氏细胞分为血竭组和空白对照组,分别用10％血竭含药血清和空白对照血清干预培养.48 h后应用RT-PCR法检测各组雪旺氏细胞NGF,BDNF等基因mRNA表达水平.结果:镜下观察到大部分雪旺氏细胞呈双极梭形,细胞呈肩对肩或端对端排列,免疫细胞化学鉴定均呈阳性;与空白组比较,血竭组NGF,LNGFR,GDNF和GAP43 mRNA表达上调(P＜0.01),BDNF mRNA表达下调(P＜0.05),CNTF和TrkA的mRNA均下调(P＜0.01),NF-H mRNA无显著差异.结论:中药血竭可能是通过上调NGF,LNGFR,GDNF,GAP-43的mRNA的表达,同时下调BDNF,CNTF,TrkA mRNA来发挥其促进神经修复作用.
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CNTF及其信号转导通路的实验研究现状
神经营养因子及其信号转导通路是从分子水平对疾病的发病机制进行阐释,该领域的研究日益受到人们的重视.查阅文献,对近年来的研究热点CNTF及其信号转导通路,以及在针灸治病机理研究中的应用归纳总结如下,以期为今后的实验研究提供理论依据.
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不同剂量睫状神经营养因子对大鼠坐骨神经损伤后再生的影响
目的:探讨不同剂量睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)对大鼠坐骨神经损伤后桥接再生影响.方法:选用30只大鼠分5组,每组6只,切除左侧坐骨神经6 mm,用硅胶管10mm桥接坐骨神经的两个断端.其中治疗组CNTF一次给药量分别为500,300,100,50ng,对照组给生理盐水5μL.术后1个月活杀动物,观察坐骨神经近、远心端,新生神经纤维,脊髓,运动终板的变化.结果:电镜结果显示300和500ng治疗组,新生雪旺细胞及神经纤维较多.单个雪旺细胞内夹有神经纤维,髓鞘厚度均匀.其他各组有少许髓鞘样结构.新生神经纤维细小.光镜观察发现:300,500 ng治疗组新生神经纤维较成熟,排列整齐.对照组新生的坐骨神经细小,远端有变性改变.结论:CNTF对坐骨神经损伤有促进再生作用,用量好是300～500ng.
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SEC-HPLC法测定CN10冻干品中CN10的蛋白含量
通过高效液相色谱法(HPLC)建立一种测定CN10冻干品中蛋白含量的方法.以0.1 mol/L Tris-HC1、0.1 moL/L NaC1、pH7.2缓冲液作为流动相,色谱柱为TSK2000SWxl(4.6 mm ×250 mm)凝胶过滤色谱柱,体积流量为0.65 mL/min,进样体积50 μL,检测波长选择280 nm,依据HPLC外标法原理建立CN10含量测定方法,并根据《生物制品质量控制分析方法验证技术审评一般原则》对方法进行相关验证.结果:在该条件下,CN10和人血白蛋白之间有良好的分离度,CN10浓度在0.1～0.6 mg/mL的范围内与其峰面积呈良好的线形关系(R2 =0.998 1),低检出限和低定量限分别0.01 mg/mL和0.04 mg/mL,方法的重复性RSD(％)为0.38,平均回收率为(100.40±2.28)％.用该方法检测CN10冻干制剂中的CN10蛋白含量时,不受人血白蛋白的影响,具有较高的准确性和专属性.
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质粒pBV220-PTD-tCNTF转化BL21菌株感受态细胞的高效制备方法
目的 比较几种常用大肠杆菌感受态制备方法,探讨影响pBV220-PTD-tCNTF转化大肠杆菌感受态细胞的因素并得出优水平组合.方法 采用4种制备感受态细胞的方法即CaCl2法,CaCl2 -甘油法,TSSG法和INOUE法,比较4种方法制备的感受态细胞即时和-80C保存30 d对质粒PBV220-PTD-tCNTF的转化效率；L8(27)正交设计研究Mg2+、INOUE重悬液、PEG、甘油和DMSO对pBV220-PTD-tCNTF转化大肠杆菌感受态的影响；对得出的佳水平组合进行验证并对转化好的细胞进行测序验证.结果 CaC12 法,CaCl2-甘油法,TSSG法,INOUE法4种方法的转化率分别为:(5.43 ±0.72)×106、(7.45±0.65)×106、(9.71±1.81)×106、(8.52±1.22) ×10 7；-80℃保存30 d的转化效率为:(6.20 ±0.31)×104、(6.57±0.97)×106、(9.76±1.31)×106、(1.63±0.019)×106；正交结果Mg2+(A)、INOUE重悬液(B)、PEG(C)、甘油(D)和DMSO(E)各因素的P值分别为0.0357、0.0154、0.0677、0.2503和0.1749；佳水平组合实施的转化率为( 29.63±4.95) ×107并经测序确定转入质粒的正确性.结论 分析出各因素对pBV220-PTD-tCNTF转化感受态细胞转化率的影响程度,得出了其佳水平组合A1B1C1D2E1,并得到了(29.63±4.95) ×10 7的转化效率.
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CNTF对端侧吻合后面神经再生作用的实验研究
目的:研究睫状神经营养因子(CNTF)对周围面神经端侧缝合后促神经再生的作用.方法:24只成年家兔随机分为3组,兔双侧面神经上颊支切断后与同侧外膜开窗的下颊支作端侧吻合.右侧为实验侧,术后局部给予CNTF,左侧生理盐水,作为对照侧.分别于术后3、5、12周取材,进行大体观察和面神经功能评分、神经组织学、电生理、透射电镜等检查. 结果:各组实验侧颊支有髓神经数、运动神经传导速度、面神经功能评分均高于对照侧(P<0.05).实验侧颊支神经成熟程度优于对照侧.结论:CNTF在提高神经端侧吻合后侧支萌出率和减轻失神经肌肉萎缩方面有积极的作用.
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川芎含药血清对雪旺氏细胞促增殖作用及其机理研究
目的:观察川芎含药血清对体外培养的雪旺氏细胞(SCs)增殖及LNGFR、BDNF和CNTF表达的影响,探讨其促进周围神经再生的可能机制.方法:SD大鼠随机分为川芎组和空白组.川芎组分别灌胃不同剂量(1.25、2.5、5.0、10.0 g/kg)川芎水煎液,空白组给予等体积蒸馏水,1 w后经股动脉采血制备血清.选取出生3d的SD乳大鼠双侧坐骨神经制备SCs,将纯化的SCs分为川芎含药血清组和空白血清组,MTT法测定不同时间各组光密度D(λ)值;48 h后应用RT-PCR法检测LNGFR、BDNF和CNTF mRNA表达水平.结果:川芎2.5、5.0、10.0∥kg组血清培养的SCs在培养1d后D(λ)值均大于空白血清组(P＜0.05或P＜0.01);与空白血清组比较,川芎含药血清组LNGFR mRNA表达显著升高(P＜0.01)、BDNF和CNTF mRNA表达显著降低(P＜0.01).结论:2.5～10.0 g/kg川芎含药血清可有效促进新生大鼠SCs增殖,其机制可能与上调LNGFR和下调BDNF、CNTF mRNA的表达有关.
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睫状神经营养因子研究进展
睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)自70年代发现以来备受重视,早由Helfand等在1976年发现,1984年Barbin等从鸡睫状神经元提取获得,并于1989年获得CNTF cDNA,是一种在体外能促进鸡胚睫状神经元存活的蛋白质,属白细胞介素26(inter-leukin26,IL26)细胞因子家族成员.
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NGF与CNTF对周围神经再生纤维超微结构影响的计量研究
目的探讨神经生长因子(nerve growth factor, NGF)和睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor, CNTF)对大鼠同一坐骨神经再生纤维超微结构的影响.方法用自行研制的梭形双通道桥接管桥接36只大鼠坐骨神经10 mm缺损,根据梭形管的两支内加入的药物不同将动物随机分为A组(两支管内均加入几丁糖)和B组(两支管内加入几丁糖后,再分别加入NGF和CNTF).于术后4、8、16周取再生神经的中段行透射电镜观察,并对8、16周再生神经的有髓和无髓纤维的面积、有髓纤维轴突直径、髓鞘厚度行计量分析.结果 A组两支管内再生神经纤维的种类、数量无显著差异.B组NGF侧再生纤维以有髓纤维为主,且其髓鞘较厚,轴突直径较大,而CNTF侧再生神经有髓和无髓纤维均增加,无髓纤维面积较NGF侧大,两者差异显著(P<0.05).结论 NGF对有髓纤维的再生和髓鞘形成的作用较强,CNTF可同时促进有髓和无髓纤维再生,但其促进有髓纤维再生的作用不及NGF.
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联合应用NGF和CNTF对大鼠坐骨神经损伤后功能恢复的影响
目的探讨联合应用神经营养因子(Nerve growth factor,NGF)和睫状神经营养因子(Ciliary neurotrophic factor,CNTF)对大鼠坐骨神经损伤后再生及功能恢复的影响.方法用硅胶管桥接120只大鼠左侧坐骨神经长6 mm缺损,随机分为4组,分别行NGF+CNTF、CNTF、NGF、生理盐水(NS)靶肌肉注射.术后行坐骨神经功能指数(SFI)、电生理检测、病理学检查.结果联合应用NGF和CNTF组SFI恢复率、各项电生理及轴突图像分析指标明显优于单独用药组.结论联合应用NGF和CNTF可明显促进大鼠坐骨神经损伤后再生与功能恢复.
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睫状神经营养因子对大鼠视神经不全损伤后轴浆运输的影响
目的探讨睫状神经营养因子(CNTF)对大鼠视神经(optic nerve, ON)中度不全损伤后轴浆运输的影响.方法成年雌性Wistar大鼠50只,用无创血管夹于球后1.5 mm钳夹ON 10 s,造成ON中度损伤,于伤后即刻、伤后1、2、4和8周CNTF治疗组玻璃体腔内注射人重组睫状神经营养因子(rhCNTF)2 μg,对照组注射等量双蒸水.分别在不同的时间(1、2、4、8和12周)应用辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)观察ON不全损伤后顺行轴浆运输的变化.结果伤后1～2周在损伤点后HRP顺染纤维度骤然下降,于上丘均未见HRP显色;伤后4周ON及上丘顺染密度逐渐增强至8周达高峰,对照组ON损伤远端顺染纤维度恢复至正常的12.87%,而治疗组至31.86%.两组间于ON损伤远端和上丘HRP顺染密度均有非常显著性差异(P<0.01).结论 CNTF可改善ON不全损伤后轴浆运输状况,促进ON结构的恢复.
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TGF-β1和CNTF在大鼠移植神经干细胞后的损伤脊髓中的表达
目的 研究在受损伤脊髓移植神经干细胞后对其TGF-β1和CNTF表达的影响.方法 将正常成年SD雌性大鼠35只,分为:单纯脊髓全横断组、假手术组、NSCs移植组.NSCs移植组在脊髓全横断后第7天时进行NSCs移植,其它2组不移植NSCs;通过RT-PCR测定脊髓损伤局部头侧在移植术后3,7,14 d TGF-β1和CNTF的表达.结果 移植术后3 d,7 d,单纯全横断组TGF-β的表达大于神经干细胞组.CNTF仅在术后7 d,前者表达大于后者,其余时间段2组间2因子的表达无统计学意义.结论 神经干细胞移植使脊髓损伤局部TGF-β1的表达降低,但对CNTF表达的影响不大.
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神经营养因子、凋亡相关因子和轴突导向因子在大鼠神经管畸形发育中的表达
目的 探讨神经营养因子(NT-3,CNTF,IGF-1,PDGF)、凋亡相关因子(Caspase-3,Bcl-xl)、轴突导向因子(Netrin)的mRNA在大鼠神经管畸形发育中的表达变化.方法 选取孕鼠随机分为正常组(不作任何处理)、对照组(按50 mg/kg橄榄油于E10d时一次性胃饲孕鼠)和(按50 mg/kg溶于橄榄油的维甲酸于E10d时一次性胃饲孕鼠).正常组、对照组和实验组又各自分为E15d、E16d、E17d、E18d、E19d、E20d组,每组5只胎鼠,用于RT-PCR实验.结果 (1)实验组的胎鼠中66％发生了死胎、脊髓脊柱裂、无尾畸形、下肢不发育等； (2)神经营养因子(NT-3,CNTF,IGF-1,PDGF)、凋亡相关因子(Caspase-3,Bcl-xl)、轴突导向因子(Netrin)在E15 d～E20 d正常及畸形大鼠神经管发育过程中,均有表达.其中,IGF-1在E16d与正常组比较表现为表达减少的趋势；实验组内比较IGF-1表达有先增加后减少再增加的趋势.CNTF在E17d时与正常组比较表达有减少.以上变化均具有统计学意义(P＜0.05).凋亡因子(Caspase-3,Bcl-xl)和导向因子(Netrin)均无统计学意义.结论 神经营养因子(NT-3,CNTF,IGF-1,PDGF)、凋亡相关因子(Caspase-3,Bcl-xl)、轴突导向因子(Netrin)在E15 d～E20 d正常及畸形大鼠神经管发育过程中有重要作用.IGF-1、CNTF的mRNA变化均较正常组有不同程度减低,可能是维甲酸通过干扰此三类神经营养因子等大分子物质在发育过程中的形成和分布,在某种程度上改变了大鼠神经胚发育的进程和方式,以此也就干扰了神经元的正常的分化增殖发育过程.
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体外培养神经干细胞CNTF、TGF-β1和IGF-1的表达
目的 研究培养神经干细胞(NSC)中CNTF,TGF-β1,IGF-1基因表达情况.方法 取小鼠胎鼠海马,分离纯化培养NSC,提取总RNA,RT-PCR技术检测CNTF,TGF-β1,IGF mRNA的表达情况.结果 培养NSC中各因子mRNA均有表达;CNTF,TGF-β1表达较强,IGF-1表达较弱.结论 体外培养的NSC表达CNTF,TGF-β1含量较高,可能是应用其治疗神经疾病的理论基础.
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CNTF基因在正常大鼠和猫脊髓组织中的表达
目的 探讨睫状神经营养因子CNTF在正常大鼠和猫脊髓中的表达.方法 从正常成年SD大鼠及成熟猫脊髓组织中抽提总RNA,管家基因NF-M为内参,RT-PCR技术检测CNTF mRNA脊髓组织中的表达.结果 (1)用RT-PCR技术检测到了CNTF mRNA在正常大鼠脊髓中的表达;(2)用相同的RT-PCR条件未能检测到CNTF mRNA在正常猫脊髓中表达.结论 (1)在正常大鼠脊髓中有CNTF mRNA表达,提示CNTF可能与脊髓的生理功能有关;(2)CNTF mRNA可能在猫脊髓中不表达;用于扩增大鼠CNTF的RT-PCR条件可能不适合于猫;或大鼠和猫的CNTF mRNA存在种属差异.
