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甘草苷对原代海马神经细胞的保护和营养作用
目的:研究甘草(liquiritin,LQ)对β-淀粉样蛋白(Aβ25-35)所致大鼠原代神经细胞损伤的保护作用和营养作用.方法:采用大鼠原代海马神经元Aβ25-35损伤模型,四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定细胞活力、流式细胞术检测神经细胞凋亡、荧光探针法检测细胞内钙离子浓度,考察LQ神经保护作用;通过考察LQ诱导海马神经元轴突延长的作用和流式细胞术检测其对海马神经干细胞分化为胆碱能神经元作用观察其神经营养作用.结果:10μmol·L-Aβ25-35显著降低细胞的存活率;明显升高细胞内钙离子水平;诱导细胞凋亡发生,凋亡率达28%.预先给预0·1,1,10μmol·L-1浓度的LQ处理细胞6 h,可显著抑制Aβ25-35导致的细胞死亡,能够明显降低Aβ25-35导致的细胞内钙离子浓度升高,流式细胞检测凋亡率分别降低到10%,15%,22%,提示LQ能够拮抗Aβ25-35导致的细胞凋亡.LQ能够显著增加神经生长因子(NGF)介导的海马神经元轴突延长,特异性的促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)抑制剂能够部分阻断该作用.另外,LQ可以诱导神经干细胞体外定向分化为胆碱能神经元.结论:甘草苷对Aβ25-35导致的大鼠原代神经细胞损伤具有神经保护作用,同时甘草苷对原代海马神经元有营养作用.
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中风膏对氧糖剥夺/再复氧损伤大鼠海马神经干细胞增殖的影响
目的:研究中风膏对体外氧糖剥夺/再复氧损伤大鼠神经干细胞增殖的影响.方法:采用悬浮培养法分离纯化新生SD大鼠大脑海马神经干细胞,免疫荧光法鉴定细胞,第3代贴壁培养神经干细胞氧糖剥夺2 h后,复氧培养24 h造模.实验分为正常对照组、模型组、中风膏5％含药血清组、中风膏10％含药血清组、中风膏20％含药血清组,每组6个复孔,分1 d、3 d、5 d、7 d 4个时间点.CCK8法检测细胞活力,流式细胞仪测定细胞凋亡.结果:悬浮培养细胞均高表达巢蛋白(nestin).在增殖试验中,正常组与模型对照组比较,模型对照组的细胞增殖能力明显降低(P<0.01);与模型对照组相比,第3日,中风膏20％治疗组的细胞增殖能力明显增强(P<0.01);实验第5日、7日,中风膏5％、10％、20％组细胞增殖能力明显增强(P<0.01).在凋亡实验中,与正常组比较,模型对照组的细胞凋亡明显升高(P<0.01);与模型对照组相比,中风膏20％组细胞凋亡显著下降(P<0.01).结论:中风膏含药血清对海马神经干细胞OGD/R损伤后的增殖能力有显著的修复作用,20％中风膏含药血清对干细胞损伤有治疗作用,可降低细胞凋亡.
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中医药诱导缺血性脑损伤后海马神经干细胞增殖分化的研究进展
海马神经组织的干细胞具有多分化的潜能, 通过采取干预措施调控相关通路可促使其分化、增殖、迁移形成神经元和神经胶质细胞, 并且新生成的神经元可替代受损的神经细胞, 修复神经损伤.缺血性脑损伤后神经元、胶质细胞、血管内皮细胞等组织结构会遭受损伤与破坏, 因此通过激活海马神经干细胞促进其增殖、分化修复受损的神经组织成为治疗缺血性脑损伤的重要手段和方法.目前在中医药对缺血损伤后神经组织特别是神经元的修复和再生等方面进行了大量的实验研究, 并在中医药诱导海马神经干细胞增殖分化, 修复缺血损伤神经元的研究中取得了一定的成果.
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喹硫平对脂多糖损伤后海马神经干细胞的保护作用
目的：探讨喹硫平（QUE）对脂多糖（LPS）损伤后海马神经干细胞（NSCs）活性的作用及增殖情况的影响，并初步研究胞外信号调节激酶（ERK ）信号通路在其中的作用。方法建立体外大鼠海马NSCs的LPS损伤细胞模型，分为对照组（Sham组）、LPS组、LPS＋ QUE组（包括0．5μmol／L、1μmol／L和2μmol／L三个不同剂量组），作用48 h后，采用WST －8试剂检测细胞活性，蛋白质印迹（Western Blot）法检测磷酸化胞外信号调节激酶1／2（pERK1／2）的表达水平，5－溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU ）检测细胞增殖情况。并在培养基中添加ERK磷酸化抑制剂U0126，以进一步明确ERK信号通路在其中的作用。结果（1）细胞活力：与Sham组[吸光度值（0．371±0．027）]相比，LPS组（0．251±0．034）细胞活力显著下降（P ＜0．01），而 LPS＋ QUE 1μmol／L 组（0．311±0．018）和 LPS＋ QUE 2μmol／L组（0．343±0．021）均显著抑制了LPS对其活力的影响（与LPS组相比，P＜0．05）。（2）West‐ern Blot结果显示，LPS组的pERK1／2表达水平（0．313±0．124）明显低于Sham组（1．417±0．141）及LPS＋QUE 1μmol／L组（0．681±0．098）组和LPS＋QUE 2μmol／L组（0．954±0．119）（P＜0．05），而LPS组与LPS＋QUE 0．5μmol／L组（0．368±0．123）的pERK1／2表达水平接近。（3）BrdU 染色结果显示，LPS组的BrdU阳性细胞数百分比（23．098±2．153）％明显低于Sham组（40．388±2．910）％， LPS＋QUE 1μmol／L 组（28．742±1．536）％和 LPS＋ QUE 2μmol／L 组（31．369±2．313）％（P ＜0.05）。（4）U0126可抑制QUE（1μmol／L和2μmol／L）的上述作用。结论 QUE能抑制LPS导致的NSCs损伤，这种作用与调节ERK1／2的磷酸化有关。
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黄芪甲苷和三七总皂苷配伍对脑缺血再灌注损伤大鼠海马NSCs的保护作用
目的 探讨黄芪甲苷(AS)和三七总皂苷(PNS)配伍对脑缺血再灌注损伤大鼠海马神经干细胞(NSCs)的保护作用.方法 无血清法培养新生大鼠海马NSCs,将NSCs分为对照组、缺糖缺氧-再灌注(OGD-R)组、AS和PNS配伍组.对照组常规培养,OGD-R组无糖缺氧处理后常规孵育,AS和PNS配伍组在OGD-R基础上用AS和PNS干预培养.比色法测定NSCs的乳酸脱氢酶(LDH),MTT法测定NSCs存活率,DAPI染色检测NSCs凋亡,Nestin/Br-dU染色检测NSCs增殖.结果 与对照组比较,OGD-R组NSCs的存活率及DAPI核染、Nestin/BrdU阳性反应显著降低,LDH漏出率显著升高(P＜0.01).与OGD-R组比较,AS和PNS组NSCs的存活率、DAPI核染、Nestin/BrdU阳性光密度、面密度及细胞数显著增多,LDH漏出率显著降低(P＜0.01).结论 AS和PNS可提高OGD-R新生大鼠海马NSCs的存活率,抑制NSCs凋亡,促进NSCs增殖.
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肝豆灵药物血清对体外高铜培养小鼠海马神经干细胞增殖的影响
[目的]建立铜负荷的海马神经干细胞培养模型，以海马神经干细胞增殖为切入点，研究化痰祛瘀药物肝豆灵对神经再生的影响。[方法]实验分为3组：正常对照组、铜负荷模型组、铜负荷模型加肝豆灵药物血清组。神经干细胞培养液中添加200μmol·L-1铜离子的方法建立铜负荷模型，5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU)掺入法结合免疫荧光观察新增殖的BrdU阳性细胞数，甲基噻唑基四唑比色（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）实验检测相对细胞总数，并行统计学比较。[结果]高铜负荷可抑制体外培养神经干细胞内BrdU阳性细胞数，降低神经干细胞总数。而肝豆灵药物血清处理则可明显提高铜负荷组BrdU阳性细胞数，增加细胞数目。[结论]铜负荷可抑制海马神经干细胞增殖，化痰祛瘀方肝豆灵可以促进铜负荷培养小鼠海马神经干细胞增殖。
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齐拉西酮对脂多糖损伤海马神经干细胞的保护作用
目的 探讨齐拉西酮对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)损伤后海马神经干细胞(neural stem cells,NSCs)活性的作用及其凋亡的影响.方法 建立体外大鼠海马NSCs的LPS损伤细胞模型,分为对照组(sham组)、LPS组、LPS+齐拉西酮组(包括1μmol/L、5μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L等4个不同剂量组),药物作用48 h或72 h后,采用WST-1试剂检测细胞活性,乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)试剂盒检测乳酸脱氢酶释放情况,并采用流式细胞术检测细胞凋亡情况.结果 (1)细胞活力:作用48 h后,与对照组(吸光度值0.380±0.029)相比,LPS组(吸光度值0.265±0.047)细胞活力显著下降(P＜0.01),而LPS+齐拉西酮5μmol/L组(吸光度值0.316±0.008)组与LPS+齐拉西酮10 μmol/L组(吸光度值0.321±0.006)则显著提升其活力(与LPS相比较,均P＜0.05).作用72 h后的细胞活力结果与48 h相似,LPS组细胞活力显著低于对照组(P＜0.01),而LPS+齐拉西酮5μmol/L组与LPS+齐拉西酮10μmol/L组则缓解了LPS对其活力的抑制.(2)LDH检测结果显示,作用48 h或72 h后,LPS组LDH的释放水平显著高于sham组(均P＜0.01),而LPS+齐拉西酮5μmol/L组与LPS+齐拉西酮10 μmol/L组的LDH释放水平均显著低于LPS组(均P＜0.01).(3)流式细胞术检测凋亡的结果显示,作用48 h后,与对照组[(9.15±1.54)％]相比,LPS组[(22.67±2.15)％]凋亡百分率显著上升(P＜0.01),而LPS+齐拉西酮5μmol/L组[(18.45±3.84)％]组与LPS+齐拉西酮10 μmol/L组[(17.87±2.29)％]则显著抑制其凋亡(与LPS相比较,均P＜0.05).作用72 h后,LPS组的凋亡百分率[(15.70±2.97)％]仍然显著高于对照组[(8.45±1.04)％],而LPS+齐拉西酮10 μmol/L组[(10.52±1.42)％]则显著低于LPS组(P＜0.05).结论 适当浓度的齐拉西酮能抑制LPS导致的海马NSCs损伤,这一作用可能是其发挥神经保护效应的细胞学基础之一.
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大鼠海马神经干细胞的扩增及与三维微小凹图式复合的研究
目的 比较2种培养基下海马神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的生长特性,进而实现海马NSCs扩增的优化及其与聚乳酸(poly-L-lactide, PLLA)三维微小凹图式的复合.方法 分离大鼠胚胎海马细胞并采用Neurobasal为基础的培养基和DMEM/F12为基础的培养基进行扩增.以四甲基氮唑蓝(MTT)比色法及神经球数目统计法评价2种培养基下细胞增殖行为.采用紫外光光刻、硅蚀刻及软光刻技术制备PLLA三维微小凹图式并实现海马NSCs与微小凹图式的复合.结果 原代分离的海马细胞呈神经干细胞标志物阳性并能向神经元系和胶质细胞系分化.在30 d的扩增时间内,海马NSCs在以Neurobasal为基础的培养基中缓慢扩增聚集成神经球,少见细胞贴壁及分化;在以DMEM/F12为基础的培养基中海马NSCs扩增迅速,但易贴壁和分化.培养第25天时后者神经球数量为前者的4.7倍.微加工制备的微小凹图式结构清晰、稳定,具有高纵横结构比(≥1).扩增的海马NSCs能在三维微小凹图式上成功复合生长.结论 以DMEM/F12为基础的培养基有利于大鼠海马NSCs的扩增,以Neurobasal为基础的培养基利于海马NSCs的纯化.序贯应用2种培养基可有效扩增海马NSCs并实现其与三维微小凹图式的复合.
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新生大鼠海马神经干细胞的体外培养及鉴定
目的 探讨新生大鼠海马神经干细胞(NSC)的体外培养和诱导分化的条件和特点.方法 分离出生1d大鼠海马,在表皮生长因子、碱性成纤维生成因子和B27联合作用下使其稳定增殖,用5-溴脱氧尿苷(brdU)标记处于增殖状态的神经干细胞,应用免疫荧光染色方法行巢蛋白(Negtin)、5-溴脱氧尿苷(RrdU)、β-Ⅲ型微管蛋白(Tuj-1)、波形蛋白(Vimentntin)和Gelc-C免疲荧光染色,对NSC的增殖及其分化的细胞进行鉴定.结果 体外培养的NSC增殖成神经干细胞球并传代,鉴定为Neatin,粢色阳性细胞和5-溴脱氧尿苷(BIdU)标记粢色阳性细胞,并可诱导分化为神经元细胞(Tuj-1染 色阳性细胞)、神经胶质细胞(Vimentin染色阳性细胞)和少突胶质细胞(Galc-C染色阳性细胞).结论 采用无血清培养墓中加入特定生长因子的培养技术,可培养出在体外稳定增殖并有多向分化潜能的新生大鼠海马NSC.
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NR1基因RNA干扰的海马神经干细胞体系的构建
目的:构建NR1基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)的海马神经于细胞体系,用于离体水平研究NR1对精神分裂症模型海马神经发生的调控作用.方法:利用293T细胞,将病毒原液稀释至不同病毒梯度,经过逐孔稀释法检测慢病毒滴度;体外培养海马神经干细胞,分别加入MOI值为100、10、1的慢病毒,确定海马神经干细胞的适MOI值;海马神经干细胞体系中加入浓度为200 μmol/L的MK-801 24 h后,加入干扰NR1亚基的慢病毒12 h,通过荧光显微镜观察海马神经干细胞干扰效率,通过Western Blot检测转染后海马神经干细胞NR1的蛋白表达.结果:(1)重组的慢病毒滴度可达2×108 ～2×109 TU/mL.MOI值为100时,海马神经干细胞转染率可达90％;(2) Western Blot结果显示:感染慢病毒的海马神经干细胞中NR1蛋白表达水平明显降低(P＜0.05).结论:成功构建了NR1基因RNA干扰的海马神经干细胞体系,慢病毒介导的shRNA可有效的干扰海马神经干细胞中NR1亚基的表达,为进一步探讨NR1对精神分裂症海马神经发生调控机制的研究提供了依据.
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耳蜗提取液诱导海马神经干细胞分化的实验研究
为探讨新生鼠耳蜗提取液对于诱导海马神经干细胞分化为内耳毛细胞的影响,采用无血清和单克隆培养方法,将新生鼠耳蜗部位的提取液加入离体的海马神经干细胞的培养液中.应用nestin、BrdU、NF200、GFAP、Myosin ⅦA和P27KIP1免疫荧光染色,观察神经干细胞的形态及分化而来的神经元、神经胶质细胞、内耳毛细胞和内耳支持细胞的形态,并检测由海马神经干细胞分化而来的细胞数量.结果表明海马神经干细胞在无血清培养下,可形成nestin 阳性细胞球.但在诱导液中加入耳蜗提取液后,免疫荧光染色可见NF200、GFAP、Myosin ⅦA和P27KIP阳性细胞.结果提示在耳蜗微环境的作用下海马神经干细胞除了向神经元和神经胶质细胞方向分化外,还可向内耳毛细胞和支持细胞方向分化.
