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护心灵对血管内皮细胞的保护作用
目的:探讨护心灵对HUVECs氧化损伤的保护作用.方法:本实验采用250umol/L H2O2造HUVEC氧化损伤模型,分组给药,用MTT法测定护心灵含药血清对氧化损伤HUVECs的保护作用,同时进行形态学观察.结果:250umol/L H2O2对HUVECs有损伤作用,对HUVECs氧化损伤有一定的保护作用.
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肿瘤坏死因子α致HUVECs内皮型一氧化氮合酶降解
目的 研究肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是否可以通过细胞内蛋白质降解途径引起人脐静脉内皮细胞(HUVECs)内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的蛋白量减少.方法 建立原代HUVECs培养,选取TNF-α不同浓度(0.01、0.1、1和10 ng/mL)、不同时间(24、48和72 h)处理HUVECs;溶酶体抑制剂氯化铵(NH4Cl)、caspase 抑制剂(caspase inhibitor)和泛素-蛋白酶体抑制剂(MG-132)预处理HUVECs 1.5 h后加入TNF-α(1 ng/mL)共处理 24 h,Western blot方法检测HUVECs中eNOS蛋白表达.结果 与对照组比较,1 ng/mL TNF-α处理细胞24 h,eNOS蛋白量明显减少(P<0.01);MG-132与TNF-α共处理组,eNOS蛋白量明显增加(P<0.01).结论 TNF-α可以通过泛素-蛋白酶体途径引起eNOS蛋白降解.
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17β-雌二醇及α-玉米赤霉醇对人脐静脉内皮细胞组织因子表达的影响
为探讨17β-雌二醇(17β-estrodiol,17β-E2)及植物雌激素α-玉米赤霉醇(α-zearalanol,α-ZAL)对人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)组织因子(tissue factor,TF)蛋白含量及mRNA表达的影响,进行人脐静脉内皮细胞原代培养,传至2～3代后用于实验.在细胞培养液中分别加入不同浓度17β-E2及α-ZAL作用48h,采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定细胞裂解液中TF蛋白浓度,双辛丁酸法(bicinchoninic acid,BCA)检测细胞总蛋白含量.提取细胞总RNA,用RT-PCR观察17β-E2及α-ZAL对TF mRNA表达的影响.结果发现:10-7mol/L17β-E2及α-ZAL均可明显降低HUVECs组织因子蛋白含量及mRNA的表达,二者的作用类似.表明17β-E2及α-ZAL可明显抑制HUVECs组织因子的表达,这可能是它们抗血栓形成、发挥心血管保护作用的机制之一.
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姜黄素抑制ox-LDL诱导HUVECs凋亡
目的 研究姜黄素对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)凋亡的保护作用及其可能机制.方法 体外培养HUVECs,实验分为:对照组、ox-LDL组、ox-LDL加内质网应激(ERS)抑制剂PBA组、姜黄素组、ox-LDL加姜黄素组和ox-LDL加姜黄素加PI3K抑制剂LY294002组.CCK-8法检测细胞存活率;流式细胞仪检测细胞凋亡;激光共聚焦显微镜观察活化转录因子6(ATF6)转位;Western bolt检测ERS相关蛋白:糖调节蛋白78(GRP78)、蛋白激酶样内质网激酶(PERK)和肌醇激酶-1(IRE-1)以及相关通路蛋白:LOX-1、AKT和p-AKT的表达.结果 与对照组相比,ox-LDL可增加细胞凋亡,提高ERS相关蛋白的表达(P<0.01),促使ATF6向核内转位,以及提高LOX-1(P<0.01)和降低p-AKT的表达(P<0.01);与ox-LDL组相比,PBA可抑制ox-LDL诱导的细胞凋亡(P<0.01),姜黄素可抑制ox-LDL诱导的ERS相关蛋白和LOX-1的表达(P<0.01),ATF6的核转位,内皮细胞的凋亡(P<0.01),同时它还可提高ox-LDL引起的p-AKT表达下调(P<0.01);LY294002可部分削弱姜黄素抑制ox-LDL诱导ERS相关蛋白表达的作用(P<0.05).结论 姜黄素可降低ox-LDL诱导HUVECs的凋亡,其可能机制是通过抑制LOX-1的表达和激活AKT通路减轻细胞ERS来实现的.
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植物雌激素α-玉米赤霉醇对HUVEC组织因子基因表达的转录调控作用
目的探讨植物雌激素a-玉米赤霉醇(ZAL)影响血管内皮细胞组织因子(TF)基因表达的转录调控机制,并与内源性动物类雌激素17β联雌二醇(17β联estradiol,E2)进行比较分析.方法进行人脐静脉内皮细胞(HUVECs)原代培养,利用基因重组技术构建4个含人TF基因5'上游不同长度序列的荧光素酶报告基因质粒,用脂质体转染法分别转入以下6组细胞:①正常对照组;②10-7mol/LE2刺激组;③10-7mol/LZAL刺激组;④10-6mol/LAngⅡ刺激组;⑤10-7mol/L E2+10-6mol/L AngⅡ刺激组;⑥10-7mol/L ZAL+10-6mol/L AngⅡ刺激组;测定细胞裂解液中荧光素酶比活性(relative luciferase activity,RLA)的变化.结果转染pGL3-TF-171/+71的各组细胞RLA均较低,不同刺激组之间无显著差异;AngⅡ可使质粒pGL3-TF-593/+71,pGL3-TF-316/+71,pGL3-TF-236/+71荧光素酶表达大量增加,E2、ZAL均可不同程度地抑制AngⅡ的上述效应,2者间无显著差异.结论含有1个NF-κB位点和2个AP-1位点的-236 bp～-171 bp区域在E2或ZAL影响TF基因转录中有重要作用.
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NADPH氧化酶4在高糖促进HUVECs内活性氧产生机制中的作用
目的:研究在高浓度葡萄糖刺激状态下,人脐静脉内皮细胞(HUVECs)内活性氧的主要来源.方法:Ⅱ型胶原酶消化法分离培养人脐静脉内皮细胞,流式细胞术检测细胞内活性氧的生成,RT-PCR及Westem blot检测细胞内NADPH氧化酶4(NOX4)的表达.结果:高糖处理HUVECs后细胞内ROS升高、NOX4表达明显上调;NOX抑制剂DPI能够抑制NOX4表达的上调和细胞内ROS的升高.结论:高糖处理HUVECs时细胞内ROS升高主要来源于NOX4.
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氧化低密度脂蛋白诱导内皮细胞损伤中泛素蛋白酶体系统的表达变化
目的 观察泛素蛋白酶体系统(UPS)在氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)损伤中的表达变化.方法 运用不同浓度及时间点的ox-LDL处理HUVECs,采用免疫印迹技术检测泛素抗体(Ub)及E1酶(泛素激活酶)、E2酶(泛素耦联酶)、E3酶(泛素连接酶)的表达.结果 ox-LDL可上调HUVECs的Ub、E1酶、E2酶、E3酶表达,并呈剂量依赖性(与对照组比较,灰度值分别为:0.46±0.08比0.25±0.09;0.63±0.09比0.45±0.09;0.49±0.07比0.35±0.06;0.67±0.05比0.45±0.05.以上结果均为ox-LDL 100 μg/ml,均P＜0.05);ox-LDL(100μg/ml)作用于HUVECs,上述蛋白的表达上调,并于12h和24h出现两个表达高峰.与对照组比较,12 h灰度值分别为:0.58±0.08比0.25±0.09; 0.72±0.08比0.45±0.08; 0.65 ±0.10比0.35±0.06;0.65±0.05比0.43±0.05.24 h灰度值分别为:0.72±0.08比0.25±0.09; 0.79±0.08比0.45±0.08;0.72±0.04比0.35±0.06; 0.65±0.05比0.43±0.05,均P＜0.05.结论 ox-LDL诱导的HUVECs的损伤与泛素蛋白酶系统被激活有关.
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丙酮酸乙酯对人脐静脉内皮细胞HMGB1表达的影响
目的:本研究意在探讨丙酮酸乙酯(EP)对炎症因子HMGB1表达的影响,从而证实EP在急性脓毒症中的作用及机制.方法:采用原代培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs),免疫组化法鉴定其纯度,台盼蓝拒染实验鉴定细胞活力.观察不同计量的EP对人脐静脉内皮细胞分泌HMGB1的作用.细胞分三组:LPS 100 ng/mL+EP 0 μM组、LPS 100 ng/mL+EP 5 μM组、LPS 100 ng/mL+EP 10 μM组.采用Western blot方法检测培养上清液HMGB1的含量.结果:各细胞组于LPS 100 ng/mL刺激16 h后,EP 5 μM剂量组对HMGB1分泌具有一定的抑制作用,与EP 0 μM组比,HMGB1含量明显降低(t＝21.27,P＜0.05);10 μM剂量组与0 μM组比,降低HMGB1作用更为明显(t=26.38,P＜0.05).结论:丙酮酸乙酯可以减少血管内皮细胞释放HMGB1,对急性脓毒症有改善作用.
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DENV-2NGC株诱导HUVEC凋亡及与Fas/FasL表达的关系
目的:观察登革2型病毒NGC株(Dengue virus-2 NGC strain,DENV-2 NGC)诱导的HUVEC凋亡及其Fas/FasL表达的变化.方法:利用BALB/c乳鼠脑内接种以及C6/36细胞增殖病毒,RT-PCR鉴定病毒,细胞半数感染量(TCID50)测定法确定病毒滴度.直接免疫荧光法观察DENV-2吸附HUVEC;AO/EB染色法检测DENV-2感染后HUVEC细胞凋亡形态;流式细胞术动态测定不同滴度DENV-2诱导HUVEC凋亡率的变化,检测不同剂量病毒感染48小时的细胞感染情况及HUVEC膜表面Fas/FasL的表达水平.组间比较采用独立样本t检验.结果:DENV-2能够吸附于HUVEC并诱导HUVEC凋亡,凋亡率达(18.44±1.29)%,与未接种病毒组比较(5.78±1.43)%,差异有显著性(P＜0.05),但凋亡率并未随着时间延长和病毒剂量增加,呈现出明显的上升或下降的趋势.DENV-2对HUVEC的感染率并未与细胞凋亡率呈现明显的相关性.与对照组相比,接种病毒组的HUVEC膜表面Fas的表达水平均有明显的增加,但FasL表达水平仅在接种病毒的1 000TCID50组显著增加.结论:DENV-2 NGC能够感染HUVECs并诱导其凋亡,可能是DHF/DSS发病机制中血管内皮屏障损伤导致血浆外渗的主要原因之一,Fas/FasL激活的凋亡死亡受体途径可能在DENV-2 NGC诱导的HUVECs凋亡中发挥了作用.
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亚砷酸钠对人脐静脉血管内皮细胞的毒性效应
目的 探讨亚砷酸钠对体外培养的人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)毒性效应的分子机制.方法 通过观察细胞形态和细胞增殖实验分别观察亚砷酸钠对细胞形态及增殖能力的影响；PI染色结合流式细胞仪检测细胞周期的变化；应用实时定量RT-PCR技术检测c-Jun、c-Myc的mRNA表达水平.结果 随着亚砷酸钠浓度增加,漂浮的细胞越来越多；细胞增殖抑制率越来越高；细胞周期结果显示,S期的细胞数明显减少,大多数细胞被阻滞在G0/G1期,呈典型的剂量-效应关系；亚砷酸钠下调HUVEC的c-Myc mRNAs水平.结论 亚砷酸钠通过下调c-Myc基因表达,抑制细胞增殖能力,提示其在地砷病引起的血管损伤中发挥重要作用.
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反应停的抗新生血管形成及抗肿瘤作用研究
目的研究反应停的抗新生血管形成及抗肿瘤作用.方法在HUVECs中MTT法检测细胞活性,电镜观察细胞死亡类型,流式细胞仪定量细胞凋亡率;用鸡胚尿囊膜模型观察新生血管形成;肉瘤S180小鼠体内模型观察反应停的抗肿瘤作用,并通过免疫组化观察反应停对肿瘤组织微血管数的影响.结果反应停对HUVECs有直接抑制作用,IC50为(22.91±1.74) μmol·L-1;经反应停作用48 h后的HUVECs,随剂量增加,电镜下可见核不规则,染色体浓集,空泡状内质网及凋亡小体等不同时期细胞凋亡现象;流式细胞检测显示反应停可依剂量诱导HUVECs凋亡或坏死;鸡胚尿囊膜新生血管形成模型中,反应停抑制新生血管形成的阳性率随剂量而增加;小鼠S180肿瘤移植模型中,反应停单独使用,虽可明显减少肿瘤血管密度, 无抑制肿瘤生长作用;与环磷酰胺联合使用,可减少环磷酰胺用量,与环磷酰胺有协同抗肿瘤作用.结论反应停有抗新生血管形成作用,单独应用对小鼠S180肿瘤无抑制作用,但与环磷酰胺有协同作用.
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菟丝子黄酮对氧化损伤的人脐静脉内皮细胞的保护作用
目的 探讨菟丝子黄酮对氧化损伤的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的保护作用.方法 体外培养内皮细胞,采用MTT法测定细胞的增殖,分光光度计法检测一氧化氮(N0)、一氧化氮合酶(NOS)、放射免疫方法测定内皮素-1(ET-1),观察菟丝子黄酮对过氧化氢(H202)损伤的HUVECs的影响.结果 ①菟丝子黄酮(0.1 ～ 0.5mg/L)可提高正常培养的HUVECs的细胞活性,且具有浓度依赖性;菟丝子黄酮(0.5 mg/L)能明显减轻H202对HUVECs所致的氧化损伤,使细胞增殖活性增高((P＜0.01).②H202损伤模型组(200mmol/L)与空白组比较,NO释放和NOS活性水平显著下调(P＜0.01),ET-1释放水平显著上调(P＜0.01),菟丝子(0.5mg/L)+H2O2(200mmol/L)组与H2 O2损伤模型组(200 mmol/L)比较,NO释放水平和NOS活性明显上调(P＜0.01),ET-1水平显著下调(P＜0.01).结论 菟丝子黄酮对H2O2诱导的HUVECs的损伤具有保护作用.
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右美托咪定对血管内皮细胞氧化应激损伤的影响
目的:探讨右美托咪定(dexmedetomidine)对过氧化氢(H2O2)诱导损伤的人脐静脉血管内皮细胞(HUVECS)的影响.方法:体外培养HUVECS,随机分为6组:对照组(NC组)、H组、D组、DH组、DHY组和HY组.200 μmol/L H2O2建立血管内皮细胞氧化应激损伤模型,采用倒置显微镜观察各组细胞形态差别；MTT法测定各组细胞存活率;Hochest染色和流式细胞术检测细胞凋亡情况；测定各组细胞超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA).结果:与NC组比较,H组细胞生存率降低(P＜0.01),细胞凋亡率升高(P＜0.05),SOD活力下降(P＜0.05),MDA含量增加(P＜0.05)；而DH组相对于H组,细胞生存率升高,细胞凋亡率降低,SOD活力升高,MDA含量减少(均P＜0.05).结论:右美托咪定对H2O2诱导损伤的血管内皮细胞具有一定的保护作用.
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洛铂和顺铂对血管内皮细胞及肝、肾细胞损伤的体外实验研究
目的 分析洛铂(LBP)和顺铂(DDP)对传代培养的人脐静脉内皮细胞株(HUVECs)、人肝细胞株(QSG-7701)和人近端肾小管上皮细胞(HK-2细胞)的抑制作用,并初步探讨其可能机制.方法 采用MTT法检测LBP和DDP对HUVECs、QSG-7701和HK-2细胞抑制作用的差异,并测定HK-2细胞培养液中丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)含量,观察LBP和DDP对HK-2细胞脂质过氧化过程的影响.结果 在相同浓度、相同作用时间下,DDP组对HK-2细胞抑制率明显高于LBP组(P＜0.05),而LBP组对HUVECs细胞的抑制率明显高于DDP组(P＜0.05);LBP 组和DDP组对QSG-7701抑制率的差异无统计学意义(P＞0.05);此外,与空白对照组比较,LBP组和DDP组均使HK-2细胞培养液中MDA含量明显升高,SOD活性明显降低(P均＜0.05),但LBP组和DDP组间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 LBP和DDP均对肝、肾细胞有较强的抑制作用,LBP的肾细胞毒性较DDP低,LBP组对正常人脐静脉内皮细胞抑制作用明显强于DDP组,提示LBP可能具有更强的抑制血管形成的能力;氧化性损伤可能是两者造成肾毒性的机制.
关键词： 铂类 HUVECs QSG-7701 HK-2 cells -
金丝桃素光动力通过抑制HUVECs细胞增殖、迁移和管腔形成抑制血管生成
目的 探讨金丝桃素光动力(hypericin-photodynamic therapy,HY-PDT)对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)增殖、迁移及管腔形成的影响,研究抑制血管生成的作用机制.方法 以血卟啉为阳性药,用金丝桃素及血卟啉分别与HUVECs避光孵育24 h后,给予585 nm黄光照射(1.0 J/cm2),24 h后采用MTT法检测不同浓度HY对HUVECs细胞增殖的影响,细胞划痕实验观察HUVECs迁移情况,Matrigel实验观察对HUVECs细胞管腔形成的作用,qRT-PCR检测Smad2基因mRNA的表达,Western blot检测ERK1/2、p-ERK1/2、Smad2表达变化.结果 HY-PDT能够抑制HUVECs细胞增殖、迁移及管腔形成;HY-PDT使HUVECs中ERK1/2磷酸化比率(p-ERK1/2/ERK1/2)显著降低(P＜0.01),并显著下调Smad2mRNA及蛋白表达(P＜0.01).结论 HY-PDT通过抑制ERK1/2蛋白磷酸化活化、降低Smad2 mRNA表达及蛋白水平,使HUVECs细胞增殖、迁移管腔形成受到抑制,抑制血管的生成.
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小檗碱对HeLa细胞诱导的血管内皮细胞增殖作用的影响
目的:探讨小檗碱对HeLa细胞诱导血管内皮细胞增殖作用的影响及其作用机制.方法:用MTT法检测小檗碱对HUVECs增殖及HeLa细胞条件培养液诱导HUVECs增殖的影响;用ELISA检测HeLa细胞上清液中VEGF的含量.结果:在0～48h范围内小檗碱对HUVECs的增殖有明显抑制作用,并有浓度时间依赖关系;经浓度为5μg/ml～40μg/ml小檗碱作用后的HeLa细胞条件培养液对HUVECs增殖的抑制率为24.4%～44.2%,而HeLa细胞条件培养液对HUVECs增殖有明显促进作用;小檗碱抑制HeLa细胞VEGF的表达.结论:小檗碱可能通过抑制HeLa细胞VEGF的表达从而抑制肿瘤血管生成.
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bFGF单抗的抗血管新生作用
目的 在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)以及鸡胚中来研究抗碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)单抗对血管新生的作用.方法 制备3种腹水型bFGF单抗MabF7,MabF10,MabF12.CCK-8法检测bFGF单抗对HUVECs细胞增殖的影响;Transwell小室研究bFGF单抗对HUVECs迁移的影响;ECM gel检测其对HUVEC体外成管的影响;并研究其体内对鸡胚尿囊膜(CAM)血管新生作用.结果 MabF7,MabF10,MabF12均可中和bFGF的活性;3株单抗均可抑制内皮细胞迁移过程,无抗体组,对照抗体组,MabF7,MabF10,MabF12组细胞迁移率分别为100%,106.25%±7.89%,69.50%±6.86%,74.00%±4.16%,67.75%±3.30%;3株单抗均可抑制内皮细胞成管过程,无抗体组,对照抗体组,MabF7,MabF10,MabF12组管状结构形成率分别为:100%,105.93%±3.85%,56.53%±4.35%,29.23%±6.45%,12.77%±2.67%;计数尿囊膜上加药滤纸周围呈放射状的血管条数,bFGF组,bFGF+MabF7组,bFGF+MabF10组,bFGF+MabF12呈放射状的血管条数分别为15±0.82,7.5±1.29,13.5±3.10,8.5±0.58.结论 bFGF单抗对HUVECs的增殖、迁移、成管以及鸡胚尿囊膜血管新生均有抑制作用,从而为具有抗肿瘤作用的抗体药物的研发奠定基础.
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金属硫蛋白2A重组质粒的构建及其在血管内皮细胞中的表达
目的 建立人血管内皮细胞金属硫蛋白2A(MT2A)上调表达细胞模型.方法 构建重组质粒pEGFP-N1-MT2A,转染至人脐静脉内皮细胞(HUVECs),荧光显微镜观察转染效果,RT-PCR及蛋白印迹法测定细胞MT2A表达水平.结果 测序证实pEGFP-N1-MT2A重组质粒构建正确,转染至HUVECs后,通过RT-PCR蛋白印迹实验证实细胞MT2A表达水平升高.结论 成功构建了重组质粒pEGFP-N1-MT2A,转染至HUVECs可使MT2A表达水平升高.
