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抗柯萨奇病毒B3的单味中药及主要作用原理
柯萨奇病毒B3是病毒性心肌炎的主要致病因素,该文综述了近年来国内外抗柯萨奇病毒B3效果确切的单味中药、作用方式、主要作用原理以及存在的一些问题和今后的研究方向,为进一步研究和临床用药提供参考.
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柯萨奇病毒B3感染HeLa细胞后Bax和Bim的表达
目的:观察HeLa细胞感染柯萨奇病毒B3 (CVB3)后Bax和Bim mRNA和蛋白的表达.方法:将HeLa细胞分为未予以CVB3感染的对照组和予以CVB3感染的病毒组,取3 h、6 h、9 h、12 h和24 h 的细胞,采用RT-PCR和Western blotting分别检测Bax和Bim mRNA和蛋白的表达.结果:Bax和Bim mRNA在对照组和病毒组HeLa细胞中均有表达,在病毒组和对照组中Bax和Bim mRNA的表达在各自组内均无显著差异(P＞0 05),但在24 h Bax和Bim在病毒组mRNA的表达低于对照组(P＜0 05).Bax和Bim蛋白表达在对照组中各时点均有表达,但无显著差异(P＞0 05).病毒组Bax蛋白在24 h表达下降,差异有统计学意义(P＜0 05),且病毒组表达明显低于对照组(P＜0 05);Bim蛋白的表达随感染时间延长而下降(P＜0 05),9 h、12 h和24 h表达病毒组低于对照组(P＜0 05).结论:Bax和Bim在CVB3感染诱导的HeLa细胞凋亡早期发挥作用.
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病毒性心肌炎小鼠不同时期心肌组织转录因子ROR-γt的表达
目的 观察Th17细胞特异性转录因子维甲酸相关核孤儿受体γt(retinoid-related orphan nuclear receptor γt,ROR-γt)在柯萨奇病毒B3 (coxsackie virus B3,CVB3)诱导的病毒性心肌炎小鼠不同时期心肌组织中的表达变化,初步探讨ROR-γt在病毒性心肌炎发病中的作用.方法 雄性BALB/c小鼠腹腔注射CVB3建立病毒性心肌炎小鼠模型(实验组),对照组小鼠腹腔注射等量的磷酸盐缓冲液,按注射后第0、1、2、3、4、6周分为6个时点亚组,每个时点亚组至相应时间取小鼠心脏,苏木精-伊红染色观察心肌病理改变、半定量反转录聚合酶链反应测定小鼠心肌组织ROR-γt mRNA的表达,Western - Blotting测定小鼠心肌组织ROR-γt蛋白的表达.结果 苏木精-伊红染色证实病毒性心肌炎模型构建成功.实验组小鼠中,1周亚组ROR-γt mRNA及其蛋白的表达较0周亚组升高,4周亚组表达高,6周亚组表达低于4周亚组但仍高于0周亚组;实验组各亚组ROR-γt mRNA及其蛋白的表达与相应时间对照组各亚组比较,差异均具有统计学意义(P均＜0.05).结论 Th17细胞特异性转录因子ROR-γt在病毒性心肌炎小鼠心肌组织中呈高表达,且其变化趋势与Th17细胞改变趋势一致,提示ROR-γt通过参与病毒性心肌炎中Th17细胞的分化,可能参与病毒性心肌炎的免疫发病过程.
关键词： 心肌炎 维甲酸相关核孤儿受体γt 柯萨奇病毒B3 小鼠 -
养心透毒方对病毒性心肌炎小鼠心肌组织的保护作用
目的 观察养心透毒方对柯萨奇病毒(CVB3)感染小鼠造成的CVB3病毒性心肌炎(VMC)的保护作用。方法 将HeLa细胞培养的CVB3制成悬液，测定半数组织细胞感染量(TCID50)，小鼠腹腔接种CVB3培养液建立VMC模型。小鼠随机分为正常组，模型组，利巴韦林+辅酶Q10(CoQ10)组，养心透毒方低、高剂量组，灌胃给药4周。应用酶联免疫法检测各组小鼠IgG和IgM阈值，测定血清肌钙蛋白T(cTnT)、白细胞介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平，组织匀浆测定心肌IL-2和TNF-α含量，HE染色观察小鼠的心肌组织病理形态学改变。结果 养心透毒方低、高剂量组IgM、IgG阳性的动物数均少于模型组。模型组心肌组织及血清IL-2、TNF-α含量与正常组比较均有显著性差异(P＜0.05)，心肌组织有明显病理改变。养心透毒方可使小鼠心肌组织坏死程度减轻，心肌炎症浸润减少，降低组织和血清的IL-2和TNF-α含量(P＜0.05)。结论 养心透毒方能减少小鼠CVB3病毒的感染率，降低组织中炎症因子的水平，对小鼠早期VMC具有防治作用。
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卡维地洛对柯萨奇病毒B3病毒性心肌炎小鼠的疗效及其抗氧化应激作用
目的观察卡维地洛对柯萨奇病毒B3(CVB3)病毒性心肌炎小鼠的疗效.方法将80只小鼠随机分为3组:正常对照组(n=20),心肌炎组(n=30)与卡维地洛组(n=30),利用BALB/C小鼠感染CVB3建立病毒性心肌炎模型,感染24h后每天灌胃给予卡维地洛10mg/kg直至第14天,分别于接种第7天和第14天随机从各组抽取若干只小鼠取血后处死并留取心脏等标本.结果卡维地洛降低病毒性心肌炎小鼠急性期的死亡率,显著减轻心脏病理损伤,显著降低HW/BW(HW=心脏重量,BW=身体重量)比值;小鼠感染CVB3后第7天和第14天体内脂质过氧化物丙二醛(MDA)增高而超氧化物岐化酶(SOD)降低;卡维地洛干预后第7天小鼠心肌与血清中MDA含量显著降低,SOD含量有增加趋势但无统计学意义;干预后第14天SOD含量显著增加,MDA含量显著降低.结论卡维地洛对病毒性心肌炎有保护作用,不仅可以显著减轻感染小鼠的心肌损害,提高生存率,还具有明显抗氧化功效.
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碱性成纤维细胞生长因子对柯萨奇病毒B3性心肌炎小鼠心肌氧化应激的影响
目的 研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对柯萨奇病毒B3(CVB3)所致病毒性心肌炎(VMC)小鼠心肌氧化应激的影响.方法 雄性Balb/c小鼠通过腹腔接种CVB3复制VMC模型.75只雄性Balb/c小鼠随机分为5组(每组15只):正常对照组、VMC组及bFGF低、中、高剂量干预组(bFGF给药采用肌肉注射,bFGF低、中、高剂量干预组的bFGF剂量分别为1 000.0、2 000.0、4 000.0 IU·kg-1,1次/d,共6次;bFGF的首次给药为腹腔接种CVB3的同时肌肉注射bFGF).于腹腔接种CVB3后第7天处死小鼠.用光镜观察心肌组织的病理变化;用分光光度法测定心肌组织的超氧阴离子(O2.-)、过氧化氢(H2O2)、羟自由基(·OH)、丙二醛(MDA)含量;用酶联免疫吸附法测定心肌组织的金属硫蛋白(MT)含量及血清的心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)含量;用逆转录-实时荧光定量聚合酶链反应方法 检测心肌组织的MT-Ⅰ mRNA、MT-Ⅱ mRNA表达.结果 VMC组心肌组织的O2.-、H2O2、·OH、MDA含量及病理积分、血清cTnI含量明显高于正常对照组(P<0.01),心肌组织MT-Ⅰ mRNA、MT-Ⅱ mRNA表达水平及MT含量明显低于正常对照组(P<0.01);bFGF低、中、高剂量3个干预组心肌组织的O2.-、H2O2、·OH、MDA含量及病理积分、血清cTnI含量明显低于VMC组(P<0.01),心肌组织MT-Ⅰ mRNA、MT-Ⅱ mRNA表达水平及MT含量明显高于VMC组(P<0.01),且与bFGF的剂量呈量效关系.结论 bFGF抑制CVB3导致心肌氧化应激而减轻CVB3对心肌的损伤,与其拮抗CVB3抑制心肌合成MT而增加心肌清除O2.-、H2O2、·OH的能力有关.
关键词： 碱性成纤维细胞生长因子 病毒性心肌炎 柯萨奇病毒B3 金属硫蛋白 氧化应激 -
内源性硫化氢对柯萨奇病毒B3性心肌炎小鼠心肌内病毒复制的影响
目的 观察内源性硫化氢(H2S)对柯萨奇病毒B3(CVB3)所致病毒性心肌炎(VMC)小鼠心肌内病毒复制的影响,探讨内源性H2S在VMC发病机理中的作用.方法 雄性Balb/c小鼠通过腹腔接种CVB3复制VMC模型.75只雄性Balb/c小鼠随机分为5组(每组15只):正常对照组、VMC组及胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)不可逆抑制剂-炔丙基甘氨酸(PAG)低、中、高剂量干预组(PAG给药采用皮下注射,PAG低、中、高剂量干预组的PAG剂量分别为:20.0、40.0、80.0 mg·kg-1,1次/d,共6次.PAG的首次给药为腹腔接种CVB3的同时皮下注射PAG).于腹腔接种CVB3后第7天处死小鼠.用光镜观察心肌组织的病理变化;用分光光度法测定心肌组织的H2S含量;用酶免疫吸附法测定心肌组织的CSE活性及血清的心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)含量;用逆转录-聚合酶链反应方法检测心肌组织CVB3mRNA表达.结果 VMC组心肌组织的CSE活性、H2S含量明显低于正常对照组(P﹤0.01),心肌组织的病理积分、CVB3mRNA表达水平及血清的cTnⅠ含量明显高于正常对照组(P﹤0.01);PAG低、中、高剂量3个干预组心肌组织的CSE活性、H2S含量明显低于VMC组(P﹤0.01),心肌组织的病理积分、CVB3mRNA表达水平及血清的cTnⅠ含量明显高于VMC组(P﹤0.01).结论 心肌内源性H2S能抑制CVB3在心肌内复制.
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RNA干扰用于柯萨奇病毒B3感染治疗作用研究
目的 研究观察自行构建的siRNA表达载体对柯萨奇病毒B3 (CVB3)感染的潜在治疗作用.方法 以CVB3聚合酶编码区基因序列为靶点,构建发夹型siRNA真核表达载体pGCsi-U6/GFP/P及与CVB基因组序列无关的阴性对照pGCsi-U6/GFP/N.利用脂质体转染进入Hela细胞后,用CVB3毒株进行攻击,观察感染后Hela细胞病变情况,并用RT-PCR法检测细胞培养上清中的CVB3负链RNA水平.结果 构建的表达质粒pGCsi-U6/GFP/P在Hela细胞能够正确表达,其表达产物能够使CVB3基因沉默,并间接抑制了CVB3的复制.结论 本实验成功构建了能够抑制CVB3的发夹状siRNA表达质粒,该质粒具有增强细胞抗CVB3感染的能力.
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养心颗粒治疗病毒性心肌炎模型小鼠的实验研究
目的:研究养心颗粒对病毒性心肌炎( VMC)模型小鼠的治疗作用.方法:小鼠腹腔注射(接种)柯萨奇病毒 B3稀释液,随机分为养心颗粒治疗组和对照组,观察小鼠的一般情况和死亡情况,并于接种病毒后不同时间取其血样和心脏组织,作酶学检查、病毒分离、组织光镜观察和透射电镜检查.结果:治疗组小鼠存活率高于对照组,酶学检查两组比较有显著性差异( P<0. 05),病毒分离两组比较无差异,心肌病变积分治疗组较对照组明显减轻( P<0. 05),电镜观察发现治疗组的病变较对照组明显减轻.结论:养心颗粒对病毒性心肌炎模型小鼠具有一定治疗作用.
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养心颗粒对柯萨奇病毒B3感染小鼠心脏内细胞因子的调节作用研究
目的:研究养心颗粒对柯萨奇病毒B3感染小鼠心脏内肿瘤坏死因子(TNF)-α和干扰素(IFN)-γ的调节作用.方法:腹膜下注射柯萨奇病毒B3接种Balb/c小鼠.实验分为对照、黄芪提取物(6g·kg-1)和养心颗粒高、低剂量(6.3g·kg-1)组,分别于接种后第7,14,28天采集小鼠心脏标本,以酶联免疫吸附法测定心脏内TNF-α和IFN-γ的含量.结果:与对照组比较,第7天养心颗粒高、低剂量组感染小鼠心脏内IFN-γ水平显著升高,但养心颗粒高剂量组自第14天开始、低剂量组第28天开始,对感染小鼠心脏内TNF-α的释放显著减弱(p<0.05).结论:养心颗粒对柯萨奇病毒B3感染小鼠心脏细胞因子TNF-α和IFN-γ的调节作用与黄芪提取物相似,并且其在感染后期对TNF-α和IFN-γ的抑制作用可能强于黄芪.
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大黄素配伍中药活性成分体外抗柯萨奇B3病毒试验
目的:研究大黄素与不同中药活性成分配伍后体外抗柯萨奇病毒B3(CVB3)的作用,并探讨其抗病毒机制.方法:用不同组成、不同浓度的中药材提取液处理CVB3感染的Hep-2细胞,72 h后用MTT法测定细胞活性.结果:在Hep-2细胞系中,所有经配伍后的中药组合都能抑制CVB3致细胞病变作用,提高细胞存活率,降低细胞毒性.对病毒直接作用效力高的药物组合为大黄素:姜黄素:苦参碱=2:1:2;抗病毒合成效力高的药物组合为大黄素:姜黄素:苦参碱=2:0:1.结论:大黄素与中药活性成分配伍,其细胞毒性降低,抗CVB3效力增强.
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参麦注射液对感染柯萨奇B3病毒心肌细胞的影响
目的 在细胞水平探讨参麦注射液(SMI)对实验性病毒性心肌炎的治疗作用.方法 采用原代培养的SD大鼠心肌细胞感染柯萨奇B3病毒(CVB3)造成实验性病毒性心肌炎细胞模型;设立正常对照组、模型组、SMI高剂量(10 g/L)组、SMI中剂量(5 g/L)组及SMI低剂量(2.5 g/L)组,观察心肌细胞感染CVB3后第3天和第5天的搏动频率、细胞病变、细胞超微结构、上清液中乳酸脱氢酶(LDH)的活性和CVB3 滴度.结果 感染CVB3 后心肌细胞的搏动频率明显减慢;第5天模型组有半数细胞搏动停止,细胞病变明显,线粒体肿胀且形态不完整,内质网扩张,部分肌原纤维损坏,上清液中LDH的活性显著升高;SMI各剂量组心肌细胞均维持搏动,且高剂量组细胞病变程度、LDH活性和CVB3 滴度均明显低于模型组,除部分肌原纤维损坏外,线粒体形态完整,内质网未见扩张.结论 SMI对感染CVB3 的培养心肌细胞搏动功能具有保护作用,并能降低心肌细胞上清液中CVB3 滴度和减轻CVB3 对心肌细胞的损伤.
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反复CVB3m感染小鼠病理学及免疫学研究
目的 研究反复柯萨奇病毒B3 m(CVB3 m)感染对小鼠的影响,建立可行的病毒性心肌病动物模型.方法 115只3～4周龄雄性Balb/c小鼠随机分为增量感染组,等量感染组,单次感染组和正常对照组,于首次感染病毒后第104天处死小鼠,应用阻抗微分法测定心输出量,病理及组织化学技术分析心肌病理损伤和胶原系统改变 ,计算胶原容积分数.ELISA法测定血清sIL-2R含量.结果 增量感染组小鼠死亡率持续增高,心脏重量增加,心功能下降,心肌胶原容积分数和血清sIL-2R含量高于其它各组(P＜0.05),病理学特征为基质胶原明显增生重建.结论 反复增量病毒感染诱发小鼠心脏重构和免疫系统功能异常可做为病毒性心肌病模型进一步研究.
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静脉丙种球蛋白对病毒性心肌炎作用的研究
为探讨国产人静脉血丙种球蛋白(IVIG)对病毒性心肌炎的保护及治疗作用,取BALB/c小鼠随机分为IVIG保护组与治疗组.保护组接种柯萨奇B3病毒(CVB3)后,立即使用剂量分别为200mg·kg-1·d-1、500mg·kg-1·d-1、1g·kg-1·d-1的IVIG 7天.治疗组则将接种CVB3后存活到1周的小鼠,使用上述三个剂量的IVIG治疗7天.14天后处死动物.分别评价生存率、体重(BW)、心脏重量(HW)、心脏重/体重及心肌炎症的病理组织学改变.结果:保护组中500mg及1g组动物存活率100%,未发生心肌炎症;200mg组生存率为95%,个别动物有轻微心肌炎症发生,与对照组比较差异显著(P＜0.01).治疗组心肌炎症均有减轻,发病症状减轻或消失,生存率提高,BW增加,HW及病灶面积较小,但200mg组与对照组比较差异无显著性;500mg及1g组与对照组比较差异有显著性(P＜0.05),但两者间差异无统计学意义.结论:国产人血冻干IVIG对CVB3感染后的动物有保护及治疗作用.
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rAd/MDC-VP1初免pcDNA3/MDC-VP1加强策略抗CVB3的免疫效果研究
目的:应用柯萨奇病毒B3( CVB3)腺病毒载体疫苗rAd/MDC-VP1初免,核酸疫苗pcDNA3/MDC-VP1加强免疫的策略免疫小鼠,观察其免疫效果.方法:BALB/c小鼠随机分为A～D4组,分别肌肉注射PBS、rAd/MDC-VP1、pcD-NA3/MDC-VP1、rAd/MDC-VP1+pcDNA3/MDC-VP1,用ELISA和微量中和试验法分别检测CVB3 VP1特异性IgG和中和抗体滴度,CCK-8法检测脾淋巴细胞增殖活性和特异性CTL杀伤活性；用致死量的CVB3攻击小鼠后,检测小鼠血中病毒滴度并观察动物的存活情况.结果:D组CVB3 IgG、非特异性淋巴细胞增殖活性及特异性CTL杀伤活性明显高于其他各组(P＜0.05)；CVB3攻击后,D组小鼠血中病毒滴度较其他各组显著降低,生存率为41.67％,明显高于其他各组(P＜0.05).结论:rAd/MDC-VP1初免pcDNA3/MDC-VP1加强的免疫策略能显著提高小鼠细胞和体液免疫水平,提高致死量病毒攻击后的保护率.
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柯萨奇病毒B3通过caspase依赖途径诱导HeLa细胞凋亡
目的评价柯萨奇病毒B3(CVB3)致HeLa细胞死亡的方式及分子机制.方法用CVB3作用于HeLa细胞,在不同时间收集细胞,通过相差显微镜、电子显微镜、流式细胞仪以及分子生物学手段,检测HeLa细胞的病变及caspase-3基因mRNA和蛋白质的表达.结果CVB3作用于HeLa细胞后,细胞很快发生变性和坏死,24h后较多细胞凋亡;caspase基因在病毒作用早期即被活化,表现在caspase-3 mRNA在病毒作用后6h内,迅速增高达峰值.在24h内,又降至接近病毒作用前的水平.caspase-3蛋白表达在42h内逐渐增高.结论CVB3可诱导HeLa细胞发生坏死和凋亡两种反应,坏死早于凋亡,细胞凋亡与caspase-3的表达密切相关.
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柯萨奇病毒B3感染的病毒性脑炎小鼠模型的建立
目的 建立柯萨奇病毒B3(CVB)感染的病毒性脑炎小鼠模型.方法 BALB/c纯系小鼠分两组,实验组小鼠颅内直接注射滴度为4.5×108pfu的柯萨奇病毒B3悬液20μl,对照组颅内注射生理盐水20μl,应用逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)法测定脑组织中CVB3 RNA含量,HE染色观察脑组织病理学的改变.结果 与对照组相比,模型组动物于注射后1 d开始出现病毒性脑炎的表现;另外脑组织观察到CVB3的阳性条带,并出现大量的炎细胞浸润、充血水肿和片状坏死,皮质细胞排列紊乱,形态不规则,有空泡样改变,出现核同缩、碎裂、溶解等.结论 颅内直接注射柯萨奇病毒B3悬液,可快速建立柯萨奇病毒B3感染的病毒性脑炎小鼠模型.
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芪芩Ⅰ号对小鼠柯萨奇B3病毒性心肌炎的防治作用
目的:探讨复方制剂芪芩Ⅰ号(QiqinⅠ)水煎剂对柯萨奇病毒B3(CVB3)的抑制作用和对小鼠CVB3病毒性心肌炎的防治作用. 方法:①在Hep-2细胞上采用微量细胞病变抑制法,从直接灭活病毒、抑制细胞内病毒复制、阻断病毒吸附三方面研究芪芩Ⅰ号对CVB3的抑制作用. ②采用BALB/c鼠建立CVB3病毒性心肌炎的动物模型,建立病毒对照组和芪芩Ⅰ号组,然后在不同时间点处死小鼠,记录其心肌组织病变积分. 结果:①芪芩Ⅰ号水煎剂对细胞无毒且效应明显的原生药浓度是2.88 g/L和1.44 g/L. ②芪芩Ⅰ号可能具有直接灭活CVB3、抑制细胞内CVB3复制、阻断CVB3吸附细胞的作用. ③芪芩Ⅰ号组小鼠的心肌病变积分明显低于病毒对照组,二者比较有显著差异(P<0.01). 结论:体外实验证实芪芩Ⅰ号可能对CVB3有抑制作用,动物实验进一步证明芪芩Ⅰ号在体内对小鼠CVB3病毒性心肌炎有良好的防治作用.
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小柴胡汤对病毒性心肌炎动物模型IL-2、TNFα、T淋巴细胞亚群的影响
目的 探讨小柴胡汤对病毒性心肌炎动物模型白细胞介素2(1L-2)、肿瘤坏死因子.(TNFα)和T淋巴细胞亚群的作用.方法 将40只6～8周龄、体质量15～19g雌性BALB/c小鼠随机分成治疗组和对照组,每组20只.经腹腔接种亲心肌细胞株柯萨奇病毒B3建立心肌炎模型,用小柴胡汤灌胃给药治疗.分别于治疗后5、7、15和21d检测血清中的IL-2、INFα和血液中的T淋巴细胞亚群.结果 病毒感染后5d,治疗组小鼠IL-2活性无明显增高,与对照组比较差异无统汁学意义;感染后7～21 d,治疗组小鼠IL-2活性逐渐增高,与对照组比较差异有统计学意义[7d:(83.4±4.6)mg/L vs(72.7±1.2)mg/L,P＜0.05;1 5d:(86.7±5.1)mg/L vs(69.4±4.5)mg/L;21d:(95.3±4.8)mg/L vs(64.2±4.6)mg/L].病毒感染后5～21 d,治疗组小鼠血清中TNFα水平逐渐增高,与对照组比较差异有统计学意义[5d:(158.8±11.3)mg/L vs(87.2±13.7)mg/L,P＜0.01;7d:(173.7±12.5)mg/L vs(109.6±12.4)mg/L,P＜0.01;15d:(294.2±16.2)mg/L vs (127.5±1 5.1)mg/L,P＜0.01;21d:(366.7±18.6)mg/L vs (145.3±18.3)mg/L,P＜0.01].病毒感染后5 d,治疗组小鼠外周血中CD4+和CD8+均无明显增高,与对照组比较差异无统计学意义;感染后7～21 d.治疗组小鼠外周血中CD4+和CD8+均逐渐增高,与对照组比较差异有统计学意义.结论 小柴胡汤具有调节免疫应答功能,从而对病毒性心肌炎起到有效治疗作用.
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心安颗粒体内外抗柯萨奇病毒B3的实验研究
目的:探讨心安颗粒体内外抗柯萨奇病毒B3作用.方法:采用Hela细胞感染CVB3,通过对细胞病变的抑抑程度了解药物的体外抗病毒作用;采用BALB/C小鼠腹腔注射CVB3建立小鼠病毒性心肌炎模型,小鼠随机分为空白对照组、模型组、心安颗粒10、20、40g(生药)·kg-1·d-1组和病毒唑0.1g·kg-1·d-1组,注射CVB32小时后给药,连续用药7天,第8天处死小鼠,取血测定血清中和抗体,取心肌制成细胞悬液测定病毒滴度.结果:在体外能特异性抑制CVB3感染的Hela细胞的病变程度,作用优于黄芪精;在体内心安颗粒治疗组与模型组相比,血清中和抗体及心肌细胞病毒滴度明显降低(P<0.01).结论:心安颗粒有体内外抗柯萨奇病毒B3作用.
