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GYY4137对柯萨奇B3病毒感染乳鼠心肌细胞炎性因子分泌的影响
目的 观察硫化氢(H2S)新型缓释剂GYY4137对柯萨奇B3病毒感染的大鼠乳鼠心肌细胞炎性因子的影响,探讨其可能的作用机制.方法 培养乳鼠原代心肌细胞,建立病毒性心肌炎(VMC)体外模型,采用简单随机法随机分为正常组、模型组、模型+ 10 μmol/L GYY4137组、模型+50 μmol/L GYY4137组、模型+100 μmol/L GYY4137组.采用细胞增殖毒性实验(CCK-8)法检测各组心肌细胞活力.24h后,酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组白细胞介素-6(IL-6)、IL-1β及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达.Western blot法检测各组核转录因子-κB(NF-κB)抑制蛋白(Iκβoα)、细胞核因子蛋白(NF-κB p65)的表达.结果 不同浓度的GYY4137对各组心肌细胞活力无明显影响,各组心肌细胞活力均在80％以上;与正常组比较,CVB3感染各组IL-6、IL-1β、TNF-α[(175.80 ±5.05) ng/L,(25.80±1.97) ng/L,(65.33 ±3.51) ng/L]及胞核NF-κB p65表达显著升高(P＜0.01),Iκβα及胞质NF-κB p65表达降低(P＜0.01);与CVB3组比较,模型+10 μmol/L GYY4137组、模型+ 50 μmol/L GYY4137组、模型+100 μmol/L GYY4137组IL-6、IL-1β、TNF-α及胞核NF-κB p65表达明显降低,而Iκβα及胞质NF-κB p65表达增加(P＜0.01).结论 GYY4137可能通过抑制NF-κB信号转导通路,进而抑制柯萨奇B3病毒感染大鼠心肌细胞的炎性细胞因子的释放.
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不同营养状态下柯萨奇病毒B3感染HeLa细胞后对mTOR及p70S6K mRNA的影响
目的 探讨不同营养状况下柯萨奇病毒B3(CVB3)感染HeLa细胞对mTOR信号通路的影响.方法 采用非饥饿法和饥饿法2种方法培养HeLa细胞.(1)非饥饿法:HeLa细胞融合成40％ ～ 50％的单层细胞时,用含10 g/L胎牛血清的细胞培养液换液培养24 h后,病毒组用100倍半数感染量(100 TCID50)的病毒干预,而对照组用病毒维持液(含胎牛血清2 g/L细胞培养液)培养；(2)“饥饿法”:待HeLa细胞融合成40％ ～ 50％的单层细胞时,用不含胎牛血清的培养基换液培养24 h后,病毒组用100 TCID50的病毒干预,而对照组用病毒维持液(含胎牛血清2 g/L的细胞培养液)培养.采用倒置显微镜观察细胞形态学变化,用实时荧光定量PCR检测3、6、9、12、24 h不同时间点饥饿法及非饥饿法不同营养状态下HeLa细胞mTOR、p70S6KmRNA表达.结果 非饥饿法:病毒组仅在12 h及24 h mTOR、p70S6K mRNA表达显著低于对照组(P均＜0.05)；饥饿法:病毒组各时间点均显著低于对照组(P均＜0.05)；饥饿法病毒组和对照组Hela细胞mTOR、p70S6K mRNA表达均高于非饥饿法,mTOR mRNA差异均有统计学意义(P均＜0.05),而p70S6K mRNA差异均无统计学意义(P均＞0.05).结论 CVB3使HeLa细胞mTOR-P70S6K信号通路表达下调.
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半乳糖凝集素-3在病毒性心肌炎小鼠心肌组织中的动态变化及临床意义
目的 探讨半乳糖凝集素-3(Gal-3)在小鼠柯萨奇病毒B3(CVB3)所致病毒性心肌炎(VMC)中的表达及其临床意义.方法 选取58只健康雄性Balb/C小鼠,随机分为VMC组(n=50)和对照组(n=8).VMC组小鼠腹腔接种半数组织培养感染剂量( TCID50)为10-5 L-1的Nancy株CVB3病毒液0.1mL,分别于接种第7、10、14、28天随机取8只处死；对照组小鼠腹腔接种不含病毒的eagle氏液0.1 mL,于第28天处死.光镜下观察小鼠心肌组织的病理变化并计算心肌病理积分；运用实时荧光定量PCR检测心肌组织中Gal-3 mRNA的表达,应用ELISA法检测外周血Gal-3水平,并与心肌病理积分作直线相关性分析.结果 1.与对照组小鼠比较,VMC组小鼠心肌组织Gal-3 mRNA的表达在第7天(0.91 ±0.64 vs 10.09 ±2.78)、第10天(0.91 ±0.64 vs 12.49 ±6.08)和第14天(0.91 ±0.64vs2.86±2.90)均明显增高(Pa＜0.05).2.与对照组小鼠外周Gal-3水平(5.27±1.11)比较,VMC组小鼠外周血Gal-3水平在第7天(9.70±2.39)、第10天(8.98±3.03)和第14天(7.73±1.88)也均明显增高(Pa＜0.05).3.小鼠心肌组织中Gal-3 mRNA与外周血中Gal-3表达水平均与心肌病理积分呈直线正相关(r=0.77、0.69,Pa＜0.05).结论 Gal-3参与VMC的发生与发展,且与VMC的病情严重程度有关,可作为VMC新的检测指标.
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卡维地洛对体外柯萨奇病毒B3致心肌细胞凋亡与Bcl-2/Bax蛋白表达的影响
目的 探讨卡维地洛对体外柯萨奇病毒B3(CVB3)致心肌细胞凋亡的抑制作用及其机制.方法 采用差速贴壁法培养原代Wismr乳鼠心肌细胞.实验分为正常对照组、病毒组、卡维地洛组及美托洛尔组.正常对照组仅加入不含血清的DMEM培养液.后3组于CVB3感染心肌细胞后分别加入不含血清的DMEM培养液、无血清培养基配制的卡维地洛、美托洛尔溶液.72 h后在倒置相差显微镜下观察各组心肌细胞的形态、搏动速率;采用黄嘌呤氧化酶法测定其心肌细胞培养液中超氧化物歧化酶(SOD)活性,硫代巴比妥酸法测定其心肌细胞培养液中丙二醛(MDA)水平,流式细胞术检测其心肌细胞凋亡率,免疫细胞化学法检测其心肌细胞内Bcl-2及Bax蛋白表达水平.结果 1.与病毒组比较,卡维地洛组心肌细胞搏动速率明显提高(P<0.05)、凋亡率明显降低(P<0.05),心肌细胞培养液中SOD活性显著升高(P<0.05)、MDA水平明显降低(P<0.05);美托洛尔组与病毒组比较,心肌细胞搏动速率、凋亡率、心肌细胞培养液中SOD活性、MDA水平均无统计学差异(Pa>0.05);2.与病毒组及美托洛尔组比较,卡维地洛组心肌细胞内Bel-2蛋白表达增多,而Bax蛋白表达减弱.结论 卡维地洛对体外CVB3感染的心肌细胞具有保护作用,作用机制可能与其具有抗氧化活性、增强心肌细胞内Bel-2蛋白表达、减弱Bax蛋白表达有关.
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余甘根苷B对柯萨奇病毒B3感染的心肌细胞及Balb/c小鼠的保护作用
目的:探讨余甘根苷B对柯萨奇病毒B3(CVB3)感染的心肌细胞及Balb/c小鼠的保护作用.方法:首先构建CVB3感染的心肌细胞模型和动物模型,观察心肌细胞的病变效应,检测心肌细胞上清液中天冬氨酸氨基转移酶(AST)和乳酸脱氢酶(LDH)释放量的变化,并通过电子显微镜观察小鼠心肌组织的超微结构变化,检测余甘根苷B对心肌细胞的保护作用.结果:在CVB3感染的心肌细胞模型中,CVB3感染可引起细胞发生碎裂、脱落等细胞病变现象,余甘根苷B作用后,可以显著减轻细胞病变,同时能明显抑制细胞释放的心肌酶AST和LDH的活性(P<0.05);在CVB3感染的小鼠模型中,小鼠心肌组织超微结构的结果显示,CVB3感染能引起心肌纤维断裂溶解、细胞核结构破坏等病理损伤,余甘根苷B 则能减轻CVB3感染造成的心肌组织的损伤.结论:余甘根苷B对CVB3感染的心肌细胞和Balb/c小鼠具有明显的保护作用.
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27种南药有效部位体外抗柯萨奇病毒B3活性测定
目的:探讨27种南药有效部位体外抗柯萨奇病毒B3(CVB3)的作用.方法:采用观察细胞病变效应法(CPE法)检测10种南药(岗梅根、溪黄草、南板蓝根、叶下珠、叶下珠(广西)、两面针、广藿香、土牛膝、沙姜和青天葵)的27个有效部位在HeLa细胞中的抗CVB3活性,从中筛选出有抗CVB3活性的有效部位.结果:从27种有效部位中筛选出土牛膝的醋酸乙酯提取物和青天葵的甲醇提取物2种有抗CVB3活性的有效部位,其半数抑制浓度(IC50)分别为12.06 mg/L和77.67 mg/L.结论:27种南药有效部位中有2种具有抗CVB3活性.
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柯萨奇病毒 B3诱导的病毒性心肌炎 C57BL／6J小鼠模型的建立
目的：建立由柯萨奇病毒B3（CVB3）Nancy株诱导的病毒性心肌炎（VMC） C57BL／6J小鼠模型。方法：4周龄、6周龄C57BL／6J小鼠各50只，每个年龄组随机选取15只作为对照（腹腔注射PBS），剩余35只腹腔接种含CVB3 Nancy株的病毒悬液（1×105 PFU／只），于感染后第14天取心脏，行HE染色和CD3、CD45免疫组化染色，进行病理学评价，检测血清白细胞介素-1β（ IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（ TNF-α）水平，并做心肌组织中病毒滴度检测，采用Western blot法检测磷酸化AKT、IkBα、GSK3β的表达。结果：4周龄小鼠造模过程中有19只（54．3％）死亡；与对照小鼠比较，模型小鼠心肌呈现弥漫性炎性细胞浸润和片状心肌细胞变性坏死， CD3、CD45阳性细胞弥漫浸润于心肌间质，血清IL-1β、TNF-α水平明显升高（P＜0．05），心肌组织中磷酸化AKT、IkBα、GSK3β表达增高（P＜0．05）。6周龄小鼠造模过程中有3只（8．6％）死亡，模型小鼠心肌组织中炎症反应轻于4周龄模型小鼠（P＜0．05）。结论：成功建立了VMC的C57BL／6J小鼠模型，4周龄C57BL／6J小鼠更适用于模型的建立。
关键词： 柯萨奇病毒B3 病毒性心肌炎 C57 BL/6 J小鼠 动物模型 -
生脉散复方制剂对体外感染柯萨奇B3病毒的大鼠心肌细胞的影响
目的 探讨生脉散复方制剂对病毒性心肌炎的影响.方法 取新生SD大鼠心室肌培养48 h后接种103TCID50的柯萨奇B3病毒,观察生脉散合炙甘草汤加减液Ⅰ、生脉散合炙甘草汤加减液Ⅱ对感染病毒大鼠心肌细胞的影响.结果 生脉散合炙甘草汤加减液Ⅱ明显减轻感染病毒后心肌病变,改善细胞搏动,明显降低心肌细胞释放酶(乳酸脱氢酶、磷酸肌酸激酶)活性,减轻超微结构病变.结论 生脉散合炙甘草汤加减液Ⅱ对感染柯萨奇B3病毒SD大鼠培养心肌细胞具有抗病毒和明显的保护作用.生脉散合炙甘草汤加减液Ⅱ的作用优于不加虎杖的生脉散合炙甘草汤加减液Ⅰ.
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利用噬菌体随机肽库筛选抗柯萨奇病毒B3多肽的研究
本实验将柯萨奇病毒B3型(CVB3)大量扩增,应用蔗糖密度梯度离心法纯化病毒.利用噬菌体随机9肽库进行筛选,3轮淘洗后,测定噬菌体克隆抗病毒复制能力.提取阳性克隆DNA并进行测序,推导外源多肽的氨基酸序列.结果表明:3个具有明显抗病毒复制能力的噬菌体阳性克隆被筛选出来,使TCID50由10-7.5SFU/mL分别降至10-5.25、10-6、10-5.5SFU/mL,由此证明可以应用噬菌体肽库来筛选具有抗病毒作用的多肽,本研究为抗病毒多肽制剂的研究奠定了基础.
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大黄在体内抗柯萨奇病毒B3的实验研究
柯萨奇病毒(Coxsackievirus, CV)属小核糖核酸病毒科肠道病毒属，根据其对乳鼠的致病能 力不同分为A、B两组，A组病毒能够引起乳鼠广泛性肌炎及坏死，B组病毒可致局灶性肌炎。 研究表明，CVB是病毒性心肌炎的主要病因［1，2］。为寻找一种有效的抗CVB3治 疗药物，笔者通过体外实验发现大黄注射液有抗柯萨奇病毒作用［3］，并根据中药 大黄五脏皆治的理论,本研究进一步利用CVB3病毒性心肌炎小鼠模型观察了该药的抗病毒 作用。现报告如下.
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柯萨奇病毒B3基因组及其变异与心肌损伤的关系
肠道病毒感染是人类急性和慢性心肌炎的常见病因之一,而且也与人类扩张 型心肌病(DCM)的发生发展有密切关系 [1]}.病毒分离,血清学研究,免疫组化技术 、原位核酸杂交技术以及聚合酶链反应技术(PCR)均提示肠道病毒与心肌炎关系密切.近 ,LI等 [2]}用肠道病毒特异性单克隆抗体,采用改良的免疫组化技术对心肌炎或DCM病人心 肌切片中肠道病毒抗原进行检测,此法直接证明了心肌炎或DCM病人体内确实有子代病毒产 生.但是,肠道病毒究竟通过怎样的机制引起心肌损伤还未阐明,推测可能有多种机制参与 .本文仅就肠道病毒(柯萨奇病毒B3,CVB3)基因组结构及其基因变异与心肌损伤的关系方面加以综述.
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RIP1/RIP3坏死体介导的程序性坏死在急性病毒性心肌炎小鼠心肌损伤中的作用研究
目的:观察RIP1/RIP3坏死体在柯萨奇病毒B3(CVB3)诱导的急性病毒性心肌炎中的表达及意义,探讨其特异性抑制剂Nec-1的心肌损伤保护作用.方法:40只雄性BALB/c小鼠,分为正常对照组(腹腔注射0.9％氯化钠溶液)、CVB3组(腹腔注射CVB3 4 h后,尾静脉注射等剂量的DMSO)、Nec-1组(腹腔注射CVB3 4h后,尾静脉注射Nec-1)和空白对照组(无任何处理).腹腔注射药物均连续7d.采用Western blotting及免疫组织化学技术对心脏标本RIP1/RIP3坏死体进行检测,并在光镜及电镜下观察Nee-1对小鼠心肌损伤的保护作用.结果:与对照组相比,CVB3组心肌组织RIP1和RIP3表达增加,Nec-1组较CVB3组明显降低(均P＜0.01);Nec-l组小鼠心肌组织病变程度明显改善.结论:程序性坏死在CVB3诱导的急性病毒性心肌炎中起到重要作用,Nec-1能阻断这种作用并可能产生新的治疗方式.
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空心莲子草微乳体外抗柯萨奇病毒B3的实验研究
目的: 观察空心莲子草微乳在体外抗柯萨奇病毒B3(CVB3)的作用,为将纳米技术应用于该药的研发提供理论依据.方法: 提取空心莲子草抗病毒活性成分并制备成微乳制剂,以高效液相法测定微乳中空心莲子草浓度,测定微乳的粒径及其分布,考察微乳的稳定性,通过细胞实验评价药物的抗病毒作用.结果: 微乳的平均粒径为32 nm,具有很好的稳定性,有明显抑制CVB3的作用,治疗指数27.31.结论:空心莲子草微乳有显著的抗CVB3的作用,微乳化的空心莲子草安全性比未经微乳化的高.
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黄芪对柯萨奇病毒B3感染小鼠心肌线粒体结构及离子泵活性的影响
目的:观察柯萨奇病毒B3 (CVB3)感染小鼠心肌线粒体结构和离子泵活性的变化,以及黄芪的治疗作用.方法:雄性Balb/c小鼠随机分为CVB3感染组、CVB3感染加黄芪治疗组和对照组,比较线粒体超微结构及线粒体Na+-K+ATP酶、Ca2+-ATP酶活性.结果:感染组线粒体结构破坏,Na+-K+ATP酶、Ca2+-ATP酶活性下降.黄芪治疗组线粒体结构破坏较轻,Na+-K+ATP酶、Ca2+-ATP酶活性较感染组高.结论:CVB3感染早期即可见心肌线粒体结构破坏,离子泵活性下降.黄芪可提高离子泵活性,稳定心肌线粒体膜.
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细胞凋亡与小鼠病毒性心肌炎的实验研究
目的:探讨细胞凋亡在病毒性心肌炎发病中的作用.方法:采用光镜、电镜、原位末端标记法(TUNEL)观察病毒性心肌炎(viral myocarditis,VM)鼠不同时期病理改变及细胞凋亡情况.结果:小鼠感染后 7 d即见炎性细胞浸润及心肌坏死,10～14 d病变严重,21 d以后心肌炎性细胞浸润及心肌坏死逐渐减轻,代之心肌纤维化,对照组无病变.实验组7、 10、14、21、28 d均可见到凋亡细胞,且感染后7～14 d细胞凋亡数明显高于21～28 d(P＜0.05),对照组未见凋亡细胞.结论:细胞凋亡在病毒性心肌炎中起着重要作用,它参与了病毒性心肌炎的发生、发展.
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柴胡黄芩炙甘草对小鼠CVB3心肌炎治疗作用的研究
目的探讨单剂柴胡、黄芩、炙甘草对柯萨奇病毒B3(CVB3)感染的病毒性心肌炎小鼠的治疗作用.方法用CVB3感染Balb/C小鼠造成病毒性心肌炎模型,分别用生理盐水、柴胡、黄芩、炙甘草灌胃治疗,观察病毒感染后不同时间点的心肌组织病理变化.结果柴胡组小鼠在感染后第5,7,10天心肌病理积分为1.33±0.82,1 60±0.63和1.87±0.74,明显低于对照组(2.22±1.37,3.27±0.96,2.60±1.06)(P＜0.05或0.01).炙甘草组小鼠在感染后第5,7天心肌病理积分为1.26±0.88和1.80±0.68,明显低于相应对照组(P＜0.05或0.01).黄芩组小鼠在感染第14,21天后心肌病理积分(1.53±0.74,0.80±0.56)与对照组(2.33±0.98,1 40±0 83)比较差异有显著性(P＜0.05).结论单剂柴胡、黄芩、炙甘草在不同的时间点对心肌细胞起保护作用.
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CVB3对不同营养状态的HeLa细胞mTOR信号通路调控的影响
目的:探讨不同营养状况对柯萨奇病毒B3 (CVB3)感染HeLa细胞后mTOR信号通路调控的影响.方法:HeLa细胞的培养方法:非饥饿法用常规含10％胎牛血清细胞培养液换液培养24 h后次日再用CVB3干预；饥饿法用不含胎牛血清的培养基换液培养24 h后次日再干预.将HeLa细胞分为非饥饿法病毒组与对照组、饥饿法病毒组与对照组4组,采用RT-PCR检测不同时间点HeLa细胞CVB3外壳蛋白、mTOR和p70S6K mRNA表达.结果:非饥饿法:病毒组mTOR,p70S6KmRNA表达与对照组比较仅在12,24h,差异有统计学意义(P＜0.05),而饥饿法病毒组各时间点均低于对照组(均P＜0.05)；饥饿法病毒组和对照组HeLa细胞mTOR表达均高于非饥饿法(均P＜0.05),而p70S6KmRNA差异无统计学意义(均P＞0.05).结论:CVB3使HeLa细胞mTOR-p70S6K信号通路表达下调,饥饿法mTOR表达高于非饥饿法.
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雷帕霉素对柯萨奇病毒B3诱导的大鼠心肌细胞mTOR和eIF-4E表达的调控作用
目的:研究雷帕霉素对柯萨奇病毒B3(coxsackievirus B3,CVB3)诱导的心肌细胞哺乳类雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)和真核起始因子4E(eukaryotic initiation factor-4 E, eIF-4E)表达的调控,探讨mTOR/eIF-4E信号传导在病毒性心肌炎(viral myocarditis,VM)的作用.方法:CVB3感染原代培养的SD大鼠心肌细胞建立病毒性心肌炎的细胞模型.根据细胞毒力实验筛选10 nmol/L的雷帕霉素干预CVB3感染的心肌细胞,采用RT-PCR和Western免疫印迹方法检测mTOR和eIF-4E mRNA表达及蛋白质水平.结果:CVB3诱导心肌细胞变性,雷帕霉素可减轻其变性;CVB3使大鼠心肌细胞的mTOR和eIF-4E mRNA和蛋白表达上调,与对照组比较,有统计学差异(P<0.05),雷帕霉素可使CVB3感染的心肌细胞mTOR和eIF-4E mRNA和蛋白表达明显下调,与CVB3组比较,有统计学差异(P<0.05).结论:雷帕霉素能明显抑制CVB3感染的大鼠心肌细胞mTOR和eIF-4E表述,提示mTOR/eIF-4E信号传导在病毒性心肌炎中可能起重要作用.
关键词： 哺乳类雷帕霉素靶蛋白 真核起始因子4E 柯萨奇病毒B3 心肌细胞 -
饥饿状态下CVB3对Hela细胞4EBP1表达的影响
目的 观察饥饿状态下柯萨奇病毒B3(CVB3)感染Hela细胞后对4EBP1表达的影响.方法 用RT-PCR法检测CVB3感染后非饥饿及饥饿状态下Hela细胞中4EBP1的表达.结果 饥饿与非饥饿状态下对照组及CVB3感染组(病毒组)Hela细胞中均有4EBP1表达,病毒组4EBP1表达降低(P＜0.05),随病毒感染时间延长,4EBP1表达下降更明显(P＜0.05);非饥饿组4EBP1表达低于饥饿组(P＜0.05).结论 CVB3感染Hela细胞后4EBP1表达下降,随时间的延长下降更明显,饥饿促进4EBP1的表达.
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杉叶厥藻多糖的提取、纳米硒化及抗病毒活性研究
目的:从杉叶厥藻中提取多糖类活性物质,并测定其抗病毒活性.方法:水提醇沉法提取粗多糖,以活性为导向,DEAE-Cellulose离子交换层析和Sephadex G-200 凝胶柱层析法进行精制.制备的多糖样品测定理化性质,并进行纳米硒化,MTY法测定细胞毒性,CPE法测定抗柯萨奇病毒B3活性.结果:杉叶厥藻粗多糖属硫酸多糖,其多糖平均含量为27.9%,硫酸基平均含量为11.5%;粗多糖纯化得率为66.3%;多糖经纳米硒化后,平均粒径为28.6nm;纯多糖SCp11的半数有效浓度为2.2 mg/mL,治疗指数为3057.0;多糖硒化后,细胞毒性略有增加,但活性增强,治疗指数增加.结论:杉叶厥藻多糖及其硒化产物是一种有开发前景的抗病毒活性物质.
