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人参皂苷20(s)-Rg3对llc-pk1细胞中顺铂所致肾毒性的保护作用
目的:探讨人参皂苷20(s)-Rg3对llc-pk1细胞中顺铂所致肾毒性的保护作用.方法:通过基于细胞的肾脏保护试验,研究了发酵黑参(FBG)及其活性成分人参皂苷20(S)-Rg3对猪肾(LLC-PK1)细胞中顺铂(化疗药物)诱导的损伤的保护作用.结果:由顺铂诱导的细胞活力降低,再使用FBG提取物和人参皂苷20(S)-Rg3依赖剂量后明显恢复.用FBG提取物或人参皂苷20(S)-Rg3处理后会降低顺铂诱导升高与磷酸化c-Jun N-末端激酶(JNK),p53和裂解的半胱天冬酶-3升高的蛋白.通过用FBG和人参皂苷20(S)-Rg3的共同处理,由于顺铂的诱导导致凋亡LLC-PK1细胞升高的百分比显著降低.结论:人参皂苷20(s)-Rg3可改善LLC-PK1的细胞毒性,人参皂苷20(S)-RG3可能是通过阻断JNK-P53-caspase-3信号级联反应来介导这种作用的重要组成部分.
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红斑丹毒丝菌C43065株甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的克隆与表达
目的 克隆和表达红斑丹毒丝菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)基因. 方法 采用PCR从红斑丹毒丝菌C43065株基因组中扩增编码GAPDH的gapC基因片段,将其克隆至原核表达载体pET32a(+)的BamH Ⅰ和Kpn Ⅰ多克隆位点上,构建重组载体pET32a-gapC,转化大肠埃希菌BL21 (DE3),在IPTG诱导下表达N端带有Trx的重组蛋白GapC,用SDS-PAGE和Western blot检测表达产物. 结果 扩增得到的C43065株gapC基因片段大小为1 005 bp,与已报道的红斑丹毒丝菌Fujisawa株gapC基因核苷酸序列的同源性为99％.SDS-PAGE结果显示表达蛋白分子质量单位约为57 ku,与预期的大小相近.Western blot检测结果显示表达的重组蛋白GapC能与抗6个组氨酸标签鼠单克隆抗体发生特异性反应. 结论 用大肠埃希菌表达系统成功表达GapC蛋白,可用于红斑丹毒丝菌GapC生物学功能的进一步研究.
关键词： 红斑丹毒丝菌 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 基因克隆 原核表达 -
G3PD修饰蛋白对药物诱导的老年急性肾功能衰竭大鼠肾功能的影响
目的探讨3-磷酸甘油醛脱氢酶(G3PD)的修饰蛋白(MP)对庆大霉素诱导的老年急性肾功能衰竭(ARF)大鼠肾小管修复以及肾功能改善的影响. 方法将老年鼠及青年鼠各分成3组,即正常组、模型组和MP组.庆大霉素腹腔注射(140 mg*kg-1*d-1),连续7 d,制备大鼠ARF模型.采用镉还原比色法检测一氧化氮(NO),采用硫代巴比妥酸法和羟胺法分别测定丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD),苦味酸法测定血肌酐(Scr).同时,光镜、电镜观察肾组织学改变. 结果老年MP组与老年模型组相比,NO含量明显升高[血清(94.29±7.68)μmol/L与(70.14±5.53)μmol/L,肾脏(5.94±1.36)μmol/g组织与(3.62±1.11)μmol/g组织,均为P＜0.01];青年MP组与青年模型组相比,NO同样明显升高.另外,老年、青年MP组与各自模型组相比,MDA降低,SOD升高,同时Scr下降(均为P＜0.01);光镜、电镜显示肾脏病理改变减轻. 结论 MP可以升高老年及青年ARF大鼠的NO含量,减轻肾脏病理变化,改善肾功能.
关键词： 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 氨基酸修饰 一氧化氮 肾功能衰竭 急性 -
甘油醛-3-磷酸脱氢酶与人脑胶质瘤的相关性研究
目的探讨甘油醛-3-磷酸脱氢酶在神经胶质瘤中的表达及其临床意义.方法选择1999年11月-2004年1月手术切除,经病理证实的胶质瘤标本51例(胶质瘤组)、脑膜瘤9例(脑膜瘤组)、垂体瘤5例(垂体瘤组).根据WHO 2000年分级标准,胶质瘤组Ⅱ级胶质瘤16例(星形细胞瘤13例、少突胶质细胞瘤1例、室管膜瘤1例、混合性星形-少突胶质细胞瘤1例);Ⅲ级胶质瘤17例(间变性星形细胞瘤9例、间变性少突胶质细胞瘤7例、间变性室管膜瘤1例);Ⅳ级胶质瘤18例(均为胶质母细胞瘤).脑膜瘤组为Ⅰ级脑膜瘤6例(纤维型脑膜瘤),Ⅱ级脑膜瘤3例(非典型性脑膜瘤).垂体瘤组中垂体生长激素/催乳素细胞腺瘤1例,垂体催乳素细胞腺瘤1例,垂体多激素细胞腺瘤3例.采用免疫组化方法检测脑肿瘤组织中甘油醛-3-磷酸脱氢酶的表达程度.结果(1)胶质瘤Ⅱ～Ⅳ级标本免疫组化染色均呈阳性反应,脑膜瘤、垂体瘤和正常对照组则为阴性反应.(2)不同病理分级的胶质瘤标本中甘油醛-3-磷酸脱氢酶表达水平各异,其中胶质瘤Ⅱ级者甘油醛-3-磷酸脱氢酶阳性细胞检出率为12.8%,Ⅲ级22.9%,Ⅳ级44.5%,三者间差异具有显著性意义(P＜0.05);而且甘油醛-3-磷酸脱氢酶阳性细胞检出率与胶质瘤的病理分级呈线性正相关(r=0.606,P＜0.05).结论甘油醛-3-磷酸脱氢酶蛋白表达水平的增高在胶质瘤患者中具有一定的特异性,而且表达水平随着胶质瘤恶性程度的增高而增加.研究结果提示,甘油醛-3-磷酸脱氢酶可能作为重要因子影响神经胶质瘤的生物学行为;反义基因治疗可选择甘油醛-3-磷酸脱氢酶作为另一靶点.
关键词： 神经胶质瘤 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 免疫组织化学 脑膜瘤 垂体瘤 -
周期型马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶基因真核表达载体的构建及DNA免疫研究
目的 构建周期型马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶(BmGAPDH)真核表达载体pcDNA3.1-BmGAPDH,并观察其在小鼠体内的细胞免疫应答效应.方法 以周期型马来丝虫总RNA为模板,RT-PCR方法扩增目的 基因片段.与pGEM-T Easy克隆载体连接,筛选出阳性克隆.经PCR和双酶切鉴定后,亚克隆至真核表达质粒pcDNA3.1,构建pcDNA3-BmGAPDH表达载体,将纯化的pcDNA3.1-BmGAPDH和CpG经后腿胫前肌免疫BALB/c小鼠,并设PBS对照组及空质粒对照组,共免疫3次,每次免疫间隔2周.用RT-PCR方法检测肌肉组织内目的 基因;用噻唑蓝(MTT)法、ELISA方法分别检测免疫小鼠T淋巴细胞刺激增殖指数和血清中细胞因子IFN-γ、IL-4水平.应用SPSS统计学软件进行样本均数的t检验.结果 成功构建了pcDNA3.1-BmGAPDH真核表达载体,基因片段全长为1020 bp.DNA序列分析与基因库已知基因序列同源性为99%.该真核表达载体免疫小鼠后,从小鼠肌肉组织扩增出目的 基因重组质粒组小鼠淋巴细胞刺激增殖指数显著高于PBS对照组及空质粒对照组,淋巴细胞刺激增殖指数分别为1.398、1. 006和1.017(P<0.05).重组质粒组IFN-γ、IL-4细胞因子水平均高于PBS对照组及空质粒对照组,分别为163.905、58.589、51.317 ng/L和107.906、27.111、34.627 ng/L(P<0.05).免疫佐剂CpG与疫苗同时注射可增强机体的免疫应答,表现为IFN-γ水平和免疫4周后淋巴细胞刺激增殖指数显著上升.结论 pcDNA3.1-BmGAPDH真核表达载体能在小鼠体内表达并可诱导相关的细胞免疫应答.
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内参基因GAPDH在3T3-L1脂肪细胞分化中的表达变化
目的 观察甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)在3T3-L1脂肪细胞分化过程中表达水平是否存在变化,并与其他常用的内参基因相比较.方法 以实时定量PCR检测3T3-L1脂肪细胞分化0、1、3、5、7d几种不同常见内参基因的表达是否存在变化,并以Western印迹方法进行证实.结果 (1)内参基因GAPDH和转铁蛋白受体(TFRC)在脂肪细胞分化过程中基因表达水平逐渐明显升高,其中GAPDH mRNA 在脂肪细胞分化1、3、5、7d分别增加5.7、7.6、22.0和24.5倍(均P＜0.01),β-actin、α-微管蛋白(α-tubulin)、肽酰脯氨酰异构酶(PIPA)和18S mRNA表达水平未见明显改变；采用实时定量PCR检测脂肪细胞分化的关键转录因子PPARγ2、CCAAT/增强结合蛋白(C/EBP)α和C/EBPβ的表达时,以GAPDH作内参明显低估他们的表达变化；GAPDH蛋白表达也随着脂肪细胞分化逐渐增加,β-actin、α-tubulin蛋白表达未见明显变化；(2)小檗碱明显抑制脂肪细胞分化过程中GAPDH mRNA和蛋白的表达,在脂肪细胞分化5、7d时GAPDH mRNA表达水平分别降低68.1％和66.3％(P＜0.05或P＜0.01),但小檗碱对其他内参基因的表达无明显改变.结论 GAPDH在3T3-L1脂肪细胞分化过程中表达增加,不适合作为内参.
关键词： 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 内参基因 脂肪细胞分化 小檗碱 -
木榄甘油醛-3-磷酸脱氢酶全长cDNA的克隆及其序列分析
甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)是糖酵解过程和卡尔文循环中的关键酶,在糖代谢和能量代谢过程中起着重要的作用.为揭示GAPDH在植物耐盐过程中的作用,研究了从前期构建的盐胁迫下木榄幼叶cDNA文库中克隆到编码GAPDH的cDNA全序列,并对其编码蛋白的理化性质、结构特点和空间分布特点进行了分析.序列分析结果表明:木榄GAPDH的cDNA全长为1 482 bp,编码区为1 218 bp,编码一个由405个氨基酸残基组成蛋白质,理论M_r为43.4 k,理论等电点(pI)为8.65.基于该蛋白的氨基酸序列分析基础上的系统发育分析表明木榄的进化地位与毛果杨较为接近.结构分析和预测结果显示:木榄的GAPDH为无信号肽和跨膜区的亲水性蛋白,含有GAPDH的保守结构域NADB_Rossmann(71-222aa)和Gp dh_C(227-383aa).同源模建分析结果表明:该蛋白与菠菜相比具有1个高度保守的活性区,该活性区由第70～405氨基酸残基组成.
关键词： 木榄 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 生物信息分析 结构与功能 盐胁迫 -
癫(痫)持续状态模型中海马神经元损伤及其可能机制
目的探讨癫(痫)持续状态(SE)大鼠模型中海马神经元损伤、谷氨酸α-氨基-3-羟基-5-甲基异(噁)唑-4-丙酸(AMPA)受体第二亚单位GluR2的表达变化以及是否存在GluR2与甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)蛋白复合物的耦合变化.方法 应用氯化锂-毛果芸香碱建立SE大鼠模型(62只),同时设立正常对照组(20只),按照随机数字表法将建SE大鼠分为SE后1h组(6只)、6h组(12只)、24h组(12只)、72 h组(12只)及7d组(20只).按照随机数字表法选择正常对照及SE后6h、24 h、72 h、7d(各6只)作Nissl染色、原位末端标记(TUNEL)分别观察大鼠海马形态学变化、凋亡发生;再选择对照组及SE后1h、6h、24 h、72 h及7d组大鼠(各6只)用Western blot检测GluR2蛋白的表达变化,用免疫共沉淀及Western blot技术研究GluR2与GAPDH蛋白复合物的耦合变化情况.结果 SE后各时间点海马CA1、CA3区神经细胞数量显著减少,与正常对照组比较差异有统计学意义(F=30.866、24.043,P均＜0.05);SE后24h、72 h、7d海马CA1、CA3区凋亡细胞数量增加,与正常对照组比较差异有统计学意义(F=84.762、52.574,P均＜0.01);与正常对照组比较,SE后1h、6h海马GluR2蛋白相对表达量减少,但差异无统计学意义(P＞0.05),SE后24 h、72 h、7 d GluR2相对表达量减少,差异有统计学意义(F=76.506,P＜0.01);SE后72 h与正常对照组比较,GluR2与GAPDH形成的蛋白复合物耦合增加,差异有统计学意义(t=7.029,P＜0.05).结论 SE可导致海马区神经元损伤,GluR2表达降低及GluR2/GAPDH蛋白复合物耦合增加可能是其机制之一.
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杜氏盐藻甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子驱动氯霉素乙酰转移酶基因的表达及其活性检测
目的 为建立稳定高效的盐藻生物反应器寻找合适的内源性启动子驱动表达外源基因.方法 克隆鉴定了盐藻甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因5 ′上游区序列并成功构建由盐藻GAPDH基因启动子驱动的氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因表达载体pUC-Gcat.利用构建的表达载体电击转化盐藻并在含有氯霉素的培养基中筛选转化藻株.随机挑选稳定转化的盐藻藻株进行CAT酶联免疫吸附测定分析.结果 获得3株稳定转化的盐藻藻株.聚合酶链式反应鉴定和CAT酶联免疫吸附测定分析结果表明,CAT基因已整合到了转化的盐藻基因组中.结论 本研究所克隆的内源性盐藻GAPDH基因启动子能够驱动CAT基因在盐藻中表达.
关键词： 杜氏盐藻 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 氯霉素乙酰转移酶 启动子 -
中国旱獭(M.himalayana)GAPDH分子的部分cDNA克隆及序列分析
目的 对新近建立的乙肝研究动物模型喜马拉雅旱獭3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的部分cDNA序列进行了克隆和序列分析,为该模型在HBV感染研究中的应用奠定基础.方法 根据Genbank的人GAPDH cDNA的序列设计特异性引物,以提取的旱獭脾组织总RNA为模板,RT-PCR扩增旱獭GAPDHcDNA序列.纯化的PCR产物连接至T载体(pMD 18-T),然后构建重组质粒pMD18-T-mhGAPDH.对重组质粒进行PCR初筛、酶切鉴定,将阳性克隆测序.对序列进行同源性以及种系进化分析.结果 扩增的旱獭GAPDH序列为535 bp,编码序列为533 bp (nt3-535),编码177个氨基酸.获得的序列和其它类哺乳动物GAPDH的同源性均在88％以上,其中与土拨鼠GAPDH的同源性高(99.62％),氨基酸序列同源性高达100％.构建种系进化树,分析结果提示喜马拉雅旱獭GAPDH与土拨鼠GAPDH的亲缘关系接近.结论 成功的克隆了喜马拉雅旱獭GAPDH的部分序列.序列分析结果提示喜马拉雅旱獭GAPDH与土拨鼠GAPDH的亲缘关系近,同源性高.
关键词： 喜马拉雅旱獭 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 乙型乙肝病毒 动物模型
