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庆大霉素诱导LLC-PK1细胞凋亡的实验研究
目的:观察庆大霉素是否能诱导体外培养的肾小管上皮细胞发生凋亡诱导,并探讨细胞凋亡与庆大霉素肾毒性之间的关系.方法:将体外培养的猪肾近端小管上皮细胞(LLC-PK1细胞)与0.2-3.2mg/m1浓度的庆大霉素共同培养达24 96h,倒置相差显微镜下观察细胞生长情况,HE染色观察凋亡细胞形态变化,MTT法测定庆大霉素对LLC-PK1细胞增殖的抑制率,抽提细胞DNA行琼脂糖凝胶电泳观察细胞凋亡的梯形条带,流式细胞术测定细胞凋亡率.结果:庆大霉素对LLC PK1细胞增殖有抑制作用,庆大霉素具诱导LLC-PK1细胞凋亡的作用,凋亡率呈药物浓度和作用时间的依赖性.结论:庆大霉素的肾毒性可能与其诱导体内肾小管上皮细胞凋亡有关.
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人参皂苷20(s)-Rg3对llc-pk1细胞中顺铂所致肾毒性的保护作用
目的:探讨人参皂苷20(s)-Rg3对llc-pk1细胞中顺铂所致肾毒性的保护作用.方法:通过基于细胞的肾脏保护试验,研究了发酵黑参(FBG)及其活性成分人参皂苷20(S)-Rg3对猪肾(LLC-PK1)细胞中顺铂(化疗药物)诱导的损伤的保护作用.结果:由顺铂诱导的细胞活力降低,再使用FBG提取物和人参皂苷20(S)-Rg3依赖剂量后明显恢复.用FBG提取物或人参皂苷20(S)-Rg3处理后会降低顺铂诱导升高与磷酸化c-Jun N-末端激酶(JNK),p53和裂解的半胱天冬酶-3升高的蛋白.通过用FBG和人参皂苷20(S)-Rg3的共同处理,由于顺铂的诱导导致凋亡LLC-PK1细胞升高的百分比显著降低.结论:人参皂苷20(s)-Rg3可改善LLC-PK1的细胞毒性,人参皂苷20(S)-RG3可能是通过阻断JNK-P53-caspase-3信号级联反应来介导这种作用的重要组成部分.
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本周氏蛋白催化作用与多发性骨髓瘤患者肾损伤的关系
本研究通过体外细胞实验观察多发性骨髓瘤(MM)患者尿中本周氏蛋白(Bence Jones protein,BJP)酰胺酶催化作用与肾小管细胞毒性作用的关系,进一步了解BJP对MM肾损伤的毒性机制.测定13例MM患者尿BJP的酰胺酶动力学参数米氏常数(Km)和催化常数(kcat)；以不同浓度BJP与猪肾小管上皮细胞( LLC-PK1)共同培养24h后,用MTT法测定细胞增殖抑制率；以明显抑制细胞增殖的BJP浓度与LLC-PK1细胞共同培养后使用流式细胞术检测细胞凋亡.结果表明,临床出现肾损伤的MM患者尿中BJP较未出现肾损伤MM患者尿中BJP更易对LLC-PK1细胞产生毒性作用,且BJP的kcat值越高,对LLC-PK1细胞毒性作用越强.流式细胞仪检测发现,BJP能够诱导LLC-PK1细胞发生凋亡及坏死,毒性作用随BJP浓度的增高而增强.结论:BJP能够对肾小管上皮细胞产生直接毒性作用,并随BJP浓度的增高而增强；BJP酰胺酶催化作用强度与其毒性作用呈正相关,其可能是MM患者发生肾损伤的机制之一.
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线粒体是双乙酰丙酮氧钒在肾上皮细胞中诱导产生活性氧物种的主要来源
本研究利用具有降糖效应的双乙酰丙酮氧钒确定其在两种肾上皮细胞系LLC-PK1和MDCK中诱导产生活性氧物种的来源.利用四种常用的荧光试剂分别检测了VO(acac)2诱导产生的过氧化氢(H2O2)和超氧阴离子(·O2)的水平并确定了它们在细胞内的主要来源部位.实验结果表明,VO(acac)2在LLC-PK1和MDCK两种肾细胞系中均能显著诱导ROS的生成,并且ROS主要来源于线粒体.本研究结果提示,可通过局部降低线粒体部位ROS的水平来减少钒化合物的毒性损伤,同时不影响钒化合物的活性.
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镉诱导LLC-PK1细胞凋亡对基因表达的影响
目的探讨镉诱导猪肾近曲小管上皮细胞(LLC-PK1)凋亡对bcl-2、p53(mtp53)、c-myc、c-fos与ras基因表达的影响.方法采用流式细胞仪分别测定bcl-2、p53、c-myc、c-fos与ras基因表达产物.结果不同浓度CdCl2(0,10,20,40 μmol/L)作用LLC-PK1细胞,8 h后bcl-2表达逐渐下降,并呈良好的剂量-反应关系(r=-0.910,P＜0.05);4,8 h p53表达均明显下降,呈剂量-反应关系(r值分别为-0.716,-0.972,P均＜0.05);8 h后c-myc表达逐渐下降,呈剂量-反应关系(r=-0.694,P＜0.05);8 h后c-fos表达未见剂量-反应关系;8 h后ras表达逐渐下降,呈明显的剂量-反应关系(r=-0.887,P＜0.05).结论镉诱导LLC-PK1细胞凋亡的机制可能与镉抑制bcl-2、p53、c-myc、ras基因表达有关.
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低渗培养对LLC-PK1细胞pICln蛋白分布的影响
目的 探讨低渗条件下LLC-PK1细胞pICln蛋白的分布变化.方法 分别用等渗和50%低渗培养基对LLC-PK1细胞进行培养,用抗pICln血清抗体对细胞可溶性和不溶性成分的pICln进行Western blot检测,同时进行细胞的荧光抗体染色.结果 Western blot显示等渗培养时LLC-PK1细胞可溶性成分中pICln免疫反应带的密度为(51±3)%;50%低渗培养时明显增多到(69±3)%,两者比较有统计学意义(P＜0.01).荧光抗体染色也显示了pICln在胞质中明显增多.结论 pICln对低渗是敏感的, 它可能作为胞质调节蛋白、低渗时在胞质中分布增多能促进胞内渗透性物质的运出,参与调节细胞体积而对抗低渗.
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低氧对LLC-PK1细胞增殖及去分化的影响
目的:研究低氧对近端肾小管细胞株(LLC-PK1)细胞增殖和去分化的作用.方法:LLC-PK1细胞分别置于低氧(3% O2)和正常氧(18% O2)孵箱中培养,用3H-胸腺嘧啶掺入法和细胞计数,观察细胞增殖情况;以钠依赖葡萄糖和氨基异丁酸(AIB)转运为指标,观察细胞分化程度;用放射核素法测定蛋白激酶C(PKC)活性.结果:与正常氧培养比较,低氧培养16 h,3H-胸腺嘧啶掺入显著增加;培养24 h,细胞数显著增加;培养72 h,细胞摄取α-甲基糖甙和AIB显著降低.细胞低氧培养4 h,细胞膜与细胞质PKC活性比率增高,随后降至原先水平;但继续培养至24 h,PKC活性再次增高,直至72 h,表明PKC呈急性和持续双相激活.PKC抑制剂可显著抑制低氧诱导的3H-胸腺嘧啶掺入,并显著增加α-甲基糖甙和AIB转运.结论:慢性低氧可诱导LLC-PK1细胞的增殖和去分化,这些作用部分由PKC持续激活介导.
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血清对镉抑制LLC-PK1细胞增殖的影响
目的:探讨细胞培养液中有、无小牛血清对镉诱导猪肾近曲小管上皮细胞(LLC-PK1)损伤的影响,为研究镉对LLC-PK1细胞毒性的方法提供依据.方法:用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法比较有、无小牛血清细胞存活率,Image-Pro Plus软件系统拍摄有、无血清细胞光学形态变化.结果:相同浓度CdCl2作用8h、12h后,有血清条件下的细胞存活率高于无血清条件下的存活率.无血清条件下,40umol/LCdCl2作用LLC-PK1细胞12h,视野下几乎全部为悬浮细胞;有血清的条件下,40μmol/LCdCl2作用下12h,部分细胞悬浮,大多为正常贴壁细胞.结论:血清可明显抑制镉对LLC-PK1细胞毒性效应,在研究镉体外培养细胞毒性的实验中,采用无血清条件为宜.
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庆大霉素诱导LLC-PK1细胞凋亡与p27Kip1表达关系的研究
目的观察庆大霉素对体外培养的肾小管上皮细胞凋亡的诱导作用;研究细胞周期调节蛋白-p27Kipl蛋白和mRNA表达在凋亡过程中的变化;并探讨细胞凋亡与p27Kipl之间的关系.方法对体外培养的猪肾近端小管上皮细胞株(LLC-PK1细胞)予以不同浓度的庆大霉素溶液分别作用24～96h,以MTr法测定庆大霉素对LLC-PK1细胞增殖的抑制率,抽提细胞DNA进行琼脂糖凝胶电泳观察细胞凋亡条带,流式细胞术测定细胞凋亡率和细胞增殖动力学,Western Blot法检测细胞内p27Kipl的蛋白表达,RT-PCR法检测细胞p27KiplmRNA表达的变化.结果庆大霉素对LLC-PK1细胞增殖有抑制作用,具诱导LLC-PK1细胞凋亡的作用,凋亡率呈药物浓度和作用时间依赖性;庆大霉素致细胞周期停滞于G1期.p27Kipl蛋白在细胞内的表达随着干预的庆大霉素浓度增加而逐渐上调,蛋白水平与凋亡率之间呈正相关,其mRNA表达趋势与其蛋白表达一致.结论庆大霉素诱导的LLC-PK1细胞凋亡与细胞周期蛋白p27Kipl表达密切相关.
