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中国土拉弗朗西斯菌holarctica亚种的遗传多样性
目的 研究国内外土拉弗朗西斯菌的遗传进化关系.方法 选择17个单核苷酸多态性、4个插入/缺失和12个可变数目串联重复,采用单核苷酸多态性和插入/缺失、多位点可变数目串联重复分析方法单独和组合起来对39株土拉菌(10株中国土拉菌和29株已公布测序的土拉菌)进行系统进化分析.结果 组合分析显示,3株中国土拉菌和日本的FSC022被分配到B5;剩余3株中国土拉菌和瑞典的FSC200被分配到B1;3株和美国的OSU18被分配到B2;1株和法国的FTNF002-00、德国的F92与美国的OR96246一起被分配到B4.10株中国土拉菌分为4种亚型,研究表明中国土拉菌具有广泛的遗传多样性.结论 本研究针对土拉菌B型建立了一套简易高效的分型方法,并以此为基础得出土拉菌B型的起源可能是亚洲地区.
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在辽宁省长角血蜱中检测出土拉弗朗西斯菌
目的 检测辽宁省长角血蜱中弗朗西斯菌属及其内共生体的携带情况.方法 2013年7月,在辽宁省采集长角血蜱357只共分成38组,进行土拉弗朗西斯菌(土拉菌)的特异培养和弗朗西斯菌属及其共生体16S rRNA的巢式PCR检测.对有目的片段扩增的PCR产物进行测序和同源性比对,并与网上已公布的弗朗西斯菌属和弗朗西斯菌属(类)内共生体的序列进行系统进化分析.结果 有测序结果的13组蜱中,5组为土拉菌,8组为弗朗西斯菌属(类)内共生体.由此推算,河栏镇长角血蜱对于土拉菌的小携带率为2.12％.系统进化分析显示,5组蜱和土拉菌聚在一个分支上,其余8组和弗朗西斯菌属(类)内共生体聚在一个主干分支上.结论 首次发现辽宁省长角血蜱携带土拉菌及弗朗西斯菌属(类)内共生体,对于提醒当地卫生部门做好土拉热防控具有一定意义.
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感染与细胞因子风暴
机体受到感染或创伤后，首先会激发炎症反应，这种反应可以激活人体内的先天性免疫系统应对感染或创伤。但病原体经过亿万年的演化，已经逐渐进化处多种方式避免触发炎症反应进而保存自身，例如流感病毒和革兰阴性细菌土拉弗朗西斯菌等可在宿主中触发危及生命的“细胞因子风暴”，而此种结果可能会导致显著的病理症状，甚至死亡。对于此类疾病，如能降低炎症免疫反应可明显改善预后。
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转铁蛋白受体1表达在弗朗西斯菌入侵巨噬细胞中的作用
目的 评估土拉弗朗西斯菌LVS感染鼠巨噬细胞期间获取铁的影响因素.方法 用表达绿色荧光蛋白(GFP)的土拉弗朗西斯菌LVS感染鼠巨噬细胞J774A.1.结合单抗的转铁蛋白受体-1用键合了Alexa594的羊抗鼠二抗显色.用实时定量PCR法检测5个铁代谢相关基凶在土拉弗朗西斯菌LVS感染或未感染J774A.1鼠巨噬细胞中的表达.用活的弗朗西斯菌和灭活菌分别感染巨噬细胞,免疫印迹分析比较Tfr1表达水平.用小十扰RNA下调转铁蛋白受体-1的表达,进而用土拉弗朗西斯菌LVS分别感染转铁蛋白受体-1表达下调的细胞和转染无关siRNA的细胞,并进行细菌计数.结果 土拉弗朗西斯菌疫苗株可以诱导转铁蛋白受体-1在宿主巨噬细胞中表达.基因表达分析显示土拉弗朗西斯菌LVS随着时间的增加通过诱导转铁蛋白受体1(Tfr1)~.节蛋白(Irp1和IRP2)主动获取铁.免疫印迹结果表明小干扰RNA对转铁蛋白受体-1的表达下调了大约75%.细菌入侵试验显示,在感染1h时,转铁蛋白受体-1表达下调的细胞内细菌数量等同于对照(F=1.06,P=0.326 5);而在感染24h时,Tfr1下调样本中的细菌数量明显低于对照样本(F=24.12,P=0.000 6).结论 在感染早期Tfr1的上调是由翻译后调节介导的,并随着Irp1和IRP2表达的增加而增加.Tfr1表达的增加通过转铁蛋白介导的铁运输扩充了细胞内动态铁池,使弗朗西斯菌易于获取铁.转铁蛋白受体-1的下调不影响细菌与其他膜蛋白的结合而入侵,但抑制细菌在细胞内的增殖.
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土拉弗朗西斯菌检测研究进展
土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)是土拉菌病(Tularemia)的致病菌,是具传染性的致病菌之一,在自然界中已发现一百种以上的动物感染此菌.因其传播途径多样,易扩散、毒性强而被美国疾病控制预防中心列入A类生物恐怖制剂.土拉菌病是一种人畜共患病,致死率高,及时、准确的检测土拉菌对于土拉菌病患者及时治疗和防止扩散具有重要的意义.土拉菌检测方法很多.如菌培养,微凝集实验、酶联免疫吸附、快速检测试纸条、生物传感器、PCR、核酸杂交检测、质谱分析、基因芯片等.但到目前为止还没有一种成熟的用于土拉菌检测方法,其主要原因在于土拉菌致病性强,且不易分离培养.本文综述了土拉菌细菌学、免疫学、分子生物学方法检测的新研究进展.
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细胞膜微结构域中胆固醇对小鼠巨噬细胞摄取土拉弗朗西斯菌的作用
本文旨在探讨细胞膜微结构域中胆固醇在小鼠巨噬细胞摄取土拉弗朗西斯菌LVS株中的作用.用电穿孔法将穿梭质粒pFNLTP6 gro-gfp导入土拉弗朗西斯菌LVS株;细胞胆固醇用菲律平Ⅲ染色,结合单克隆抗体的小窝蛋白-1用键合了Alexa 594的羊抗鼠二抗显色;用Z轴电动聚焦的荧光显微镜分析土拉弗朗西斯菌LVS株感染;用甲基-β-环糊精干扰富含脂质的胞膜,损耗胆同醇,以评估膜微结构域的损伤对土拉弗朗西斯菌入侵的影响,菲律平Ⅲ用于检测胆固醇损耗的效果.结果显示,细胞胆同醇在早期与摄取的土拉弗朗西斯菌疫苗株共定位,膜微结构域相关成分小窝蛋白-1与两者接触密切;土拉弗朗西斯菌入侵巨噬细胞需要胆固醇丰富的膜结构域.结果提示,胆固醇丰富的膜微结构域和小窝蛋白-1在土拉弗朗西斯菌早期进入巨噬细胞过程中发挥重要作用.
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TaqMan探针实时荧光定量PCR快速检测土拉弗朗西斯菌
目的 建立TaqMan探针实时荧光定量PCR方法(QF-PCR),快速检测土拉弗朗西斯菌.方法 针对土拉弗朗西斯菌的外膜蛋白fopA基因,利用Primer 5.0设计引物及TaqMan探针,人工合成fopA基因保守片段,克隆到载体作为阳性标准品,进行荧光定量检测,制作定量标准曲线,并以合成fopA基因为模板,PF、PR为引物,研究其灵敏度、特异性和准确性.结果 构建了含fopA基因的重组质粒,以不同浓度的重组质粒制作标准曲线,在103～107拷贝数之间有较好的线性关系.灵敏度试验表明,该方法可检测到30.6个拷贝数的重组质粒,比普通PCR灵敏度高;特异性试验表明,能选择性检测土拉弗朗西斯菌,而与其他病原菌无交叉反应,与普通菌落PCR结果一致;重复性试验表明,拷贝数为3.06×106样品5次平行试验,标准差为0.201,变异系数为0.88％.结论 本研究建立了TaqMan探针QF-PCR快速检测技术,具有灵敏度高、特异性强、重复性好等特点,可用于快速、实时、定量检测土拉弗朗西斯菌,为快速检测生物战剂级微生物建立了一种人工合成特异基因TaqMan探针实时荧光定量PCR新方法.
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土拉菌单克隆抗体的制备及其特性的研究
用土拉弗朗西斯菌疫苗株作为抗原获得了2株单克隆抗体Ft9和Ft44，其抗体亚类分别为IgG2b和IgM，Ft9单抗识别的抗原位点是土拉菌的外膜蛋白，Ft44识别的是脂多糖。2株单抗均可在酶联免疫吸附试验中检出土拉菌，Ft9单抗还可在凝集和免疫荧光试验中与土拉菌发生特异性反应，并不与相关细菌交叉。
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土拉菌的实验室检测及分析技术研究进展
土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)属弗朗西斯菌属,能引起人或动物的土拉菌病(Tularemia).患者可见发热、淋巴结肿大、肺炎等症状.土拉菌在世界各地分布广泛,自然疫源地主要分布在北半球.目前,至少有包括中国在内的18个国家曾经报导过人间病例.
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土拉菌的快速检测及其感染诊断
土拉菌病(Tularaemia)是一种急性、感染性人兽共患疾病,其致病菌是土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis),易感动物为啮齿类动物,人通过破损的皮肤、结膜感染,吸入或食入极少量(10～50个)土拉菌便可发病,临床表现为皮肤溃烂、淋巴腺肿大、肺部感染和伤寒样症状,病情严重甚至死亡.
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土拉弗氏菌病的研究进展
土拉弗氏菌病(Tularaemia,或称野兔热、鹿蝇热)是一种急性、感染性人兽共患疾病,发生在北半球的多数国家,流行于北纬30°～71°地区.其致病菌是土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis,简称土拉弗氏菌).
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复合探针荧光定量PCR检测土拉弗朗西斯菌
目的:建立检测土拉弗朗西斯菌复合探针荧光定量PCR方法.方法:对土拉弗朗西斯菌的FopA基因设计引物和探针,用荧光定量PCR检测,并对特异性、灵敏度和重复性进行评价.结果:本方法对所试验的土拉弗朗西斯菌纯培养物的低检测浓度为100 CFU/ml,定量的检测变异系数小于5％.在模拟的污染血液样品中的检出限为1×103 CFU/ml.结论:本文建立的复合探针荧光定量PCR方法能高效、敏感、特异地检测土拉弗朗西斯菌.
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陕西省部分地区土拉弗朗西斯菌病自然疫源地调查研究
目的:调查陕西省是否存在土拉弗朗西斯菌病的自然疫源地.方法:蜱类调查采用布旗法;小型啮齿动物调查采用夜夹法, 病例采用回顾性流行病学调查;血清学检测采用酶联免疫吸附实验;病原分子生物学检测采用巢式-PCR法;统计学处理应用SPSS 9.0统计学软件.结果:调查发现富县、陇县和南郑县硬蜱科 (ixodidae) 5属15种蜱类, 即硬蜱属 (ixodes) 1种、革蜱属 (dermacentor) 5种、血蜱属 (haemaphysalis) 4种、璃眼蜱属 (hyalomma) 3种和扇头蜱属 (rhipicephalus) 2种, 以革蜱和血蜱种类较多.啮齿目7科16属24种, 即松鼠科 (sciuridae) 2属2种, 鼯鼠科 (pteromyidae) 2属2种, 跳鼠科 (dipididae) 1属1种, 鼹形鼠科 (spalacidae) 1属2种, 仓鼠科 (cricetidae) 4属5种, 鼠科 (muridae) 5属11种, 豪猪科 (hystricidae) 1属1种, 以鼠科种类多.检测富县、陇县和南郑县部分林区居民血清样本707份, 其中土拉弗朗西斯菌病血清IgG抗体阳性49份, 总阳性率为6.93％, 说明当地人群中存在土拉弗朗西斯菌病的自然感染.检测蜱标本1 117只, 从达吉斯坦革蜱 (D.daghestanicus) 、日本血蜱 (H.japonica) 、嗜群血蜱 (H.concinna) 等3个蜱种中检测出25只蜱为土拉弗朗西斯菌标本阳性, 总阳性率为2.24％.其中以日本血蜱的阳性率高, 为15.39％ (χ2=20.91, P=0.01), 说明当地蜱体中存在土拉弗朗西斯菌的自然感染.当地分布的达乌尔黄鼠 (S.dauricus) 、花鼠 (T.sibiricus) 、黑线姬鼠 (A.agrarius) 、小家鼠 (M.musculus) 和褐家鼠 (R.norvegicus) 等小型兽类, 在周边省区已被学者证实为土拉弗朗西斯菌病的保菌宿主和传播者, 提示富县、陇县和南郑县部分林区存在土拉弗朗西斯菌的保菌宿主啮齿目小型兽类.从25份阳性标本中选取10份进行序列测序, 获得核酸序列与土拉弗朗西斯菌B亚种菌株序列AF247690.2 100％同源;对阳性标本进行SSTR9区域扩增, 共有6种不同的拷贝数, 其中拷贝数为9的居多 (40.00％);利用MEGA 4.0软件进行聚类分析显示20份标本主要分为两大群.结论:陕西省富县、陇县和南郑县部分林区存在土拉弗朗西斯菌病的自然疫源地.
