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小鼠microRNA-150慢病毒过表达载体及抑制载体的构建及鉴定
目的 构建microRNA-150慢病毒过表达载体及抑制载体.方法 设计针对microRNA-150前体的过表达基因片段及针对microRNA-150成熟体的反义片段,应用基因重组技术将目的 基因片段克隆到pWPI慢病毒载体中,并进行DNA测序鉴定重组克隆.结果 菌落PCR筛选鉴定出构建正确的慢病毒载体,DNA测序证实插入的基因序列正确.结论 成功构建microRNA-150慢病毒过表达载体及抑制载体,为研究microRNA-150在肝再生中的作用及其机制提供了稳定的细胞转染载体.
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血小板微粒的形成、清除及主要功能的研究进展
血液中的微粒( microparticles,MP)是由不同的细胞(包括血小板、红细胞、粒细胞、单核细胞、淋巴细胞和内皮细胞等)脱落而成,几乎所有的真核细胞在受到刺激或凋亡后都会产生微粒[1]. 血小板微粒( plate-let-derived microparticles,PMP)是血液中微粒的主要来源,在非疾病的状态下占循环微粒总量的70% ~90% [2]. PMP的膜表面含有来自血小板的磷酯酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)以及多种糖蛋白的,如趋化因子受体、CD62 ( P-选择素)、CD63、GPⅡb-Ⅲa、GPIb等,这种富含多种物质的膜表面使PMP具有与血小板类似的粘附、聚集和止血等功能[3-4]. 同时,PMP的内部含有来自于血小板的蛋白质及microRNA等遗传物质,可以作为细胞间信息交流的传递者,调控多种细胞(如单核细胞、巨噬细胞等)的分化及凋亡. 此外,PMP还与多种疾病密切相关,在特发性血小板减少性紫癜( ITP) [5]、糖尿病[6]、口腔癌[7]等多种疾病中PMP含量增高. PMP的发生机制、体内清除机制及生理功能在近几年已有较为广泛的研究,现就这三方面的新研究进展进行综述.
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microRNA与肿瘤
microRNA(miRNA)是一类长度为18-25个核苷酸的单链非编码RNA,广泛存在于真核生物中,主要通过与靶mRNA的3'端非翻译区(3'UTR)完全或部分互补结合,导致mRNA降解或翻译受到抑制,从而在转录后水平负调控靶基因的表达.
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MicroRNA在前列腺癌发生发展中的研究进展
前列腺癌是男性泌尿系常见的恶性肿瘤之一.MicroRNA(循环或游离RNA,miRNA)在转录后水平对基因表达进行调控,通过类似癌基因,抑癌基因或其他方式调控肿瘤过程的发生、发展和转归过程.近研究表明一些MicroRNA在前列腺癌病人外周血中特异表达,为前列腺癌病人的早期诊断及预后判断提供了新的分子标志物.
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MicroRNA-21的生理作用及其在缺血性心脏病中的研究进展
MicroRNA(miRNA)是一类由22个左右核苷酸组成的高度保守的非编码小RNA分子,可通过抑制靶基因mRNA的翻译或通过促进mRNA降解对靶基因起到负性调控的作用.miRNA的生物功能复杂多样,与心脑血管疾病、肿瘤、血液系统疾病及肝脏疾病等也有密切关系.目前已发现数千种miRNA,miR-21是miRNA家族中的一员,参与心血管系统的多种生理及病理过程,近年来发现在缺血性心脏病中具有重要作用.本文就miR-21在缺血性心脏病的相关研究进展作一综述.
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人类乳腺组织中miRNA的表达与乳腺癌相关性的研究进展
乳腺癌是严重危害女性健康的主要恶性肿瘤之一,也是全世界女性发病率高的癌症.我国虽属乳腺癌低发区国家,但近年来发病率有增高趋势,每年3%～4%的速度增长,而且许多大中城市乳腺癌的发病率已经跃居首位[1-2].近年来,随着医学科学技术的发展,在乳腺癌疾病的研究和临床治疗技术方面,已经有了长足的进展.
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MicroRNA在脑梗死危险因素中的研究进展
微小RNA(MicroRNA,miRNA)作为参与调控基因表达的分子,是近年来研究的热点,从基因水平上阐述了miRNA在许多疾病的病程中发挥着重要作用.脑梗死在老年人中有着较高的发病率,且近年来随着人们生活水平的上升,其发病率有着上升且年轻化的趋势,故研究及预防其危险因素有着至关重要的作用.就miRNA在脑梗死的危险因素中的研究成果进行简要综述.
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生理层流剪切力对未成熟树突状细胞microRNA表达谱的影响
目的:探讨生理层流剪切力对未成熟树突状细胞(imDCs) microRNA表达谱的影响.方法:用锥板剪切系统加载10 dyn/cm2的剪切力作用于imDCs 1 h,对照组不加载剪切力,基因芯片技术检测microRNA的表达变化并对其结果进行生物信息学分析.结果:与对照组相比,imDCs在层流剪切力作用后有25个microRNAs表达发生变化,变化倍数＞1.5,差异有统计学意义(P＜0.05);生物信息学分析显示这些变化的microRNA的靶基因主要参与免疫功能调控和细胞对流体剪切力应答相关的信号通路.结论:层流剪切力能够影响imDCs mi-croRNA的表达谱,说明物理因素(剪切力)可能参与了机体的免疫功能调控.
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MicroRNA与代谢异常相关心血管疾病的研究进展
MicroRNA(miRNA)是一类广泛存在于真核生物中的非编码单链小RNA,通过影响多个靶基因的表达构建复杂的调控网络,参与细胞增殖、分化、凋亡及代谢调控等过程从而影响机体发育及多种疾病的发生发展.心脏正常生理功能的维持依赖于心肌能量代谢平衡,多种心血管疾病与代谢紊乱密切相关.目前,多项研究已证实microRNA调控糖代谢、脂代谢及线粒体功能等.诸多代谢关键靶点受不同microRNA的调控,参与心血管疾病的发生发展过程.本文主要介绍microRNA调控物质代谢及与代谢异常心血管疾病的相关研究进展.
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BRCA1mRNA与MicroRNA-146a在非小细胞肺癌中的表达及临床意义
目的 比较miRNA-146a、BRCA1mRNA在非小细胞肺癌组织及癌旁组织中的表达水平差异及二者相关性.方法 采用实时RT-PCR方法检测30例非小细胞肺癌的癌组织及癌旁组织标本中miRNA-146a、BRCA1mRNA的表达水平,并分析它们之间的相关性.结果 miRNA-146a和BRCA1mRNA在癌组织和癌旁组织相对表达量分别为:(42.67±34.29 vs14.67±9.54,P＜0.05)、(7.79±5.11 vs 10.13±6.53,P＜0.05);miRNA-146a和BRCA1mRNA呈负相关(P＜0.05);二者与患者性别、年龄、分期、病理类型、复发情况之间差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 BRCA1mRNA与MicroRNA146a有望成为NSCLC诊疗及预后判断个体化指标,二者之间可能存在相互调控关系.
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miR-10b、miR145及miR155在乳腺癌患中的表达及临床意义
目的 探讨microRNA-10b(miR-10b)、microRNA-145(miR-145)及microRNA-155(miR-155)在乳腺癌患者病理组织及血清中的表达水平,进而评价其在乳腺癌诊断中的价值.方法 收集100例正常健康志愿者,150例乳腺癌患者血液和39例乳腺癌患者的癌组织和癌旁组织,提取血液和组织中的microRNA,采用实时荧光定量PCR检测miR-10b、miR-145及miR-155表达水平,分析其与乳腺癌患者临床病理参数之间的相关性,并绘制ROC曲线分析其在乳腺癌诊断中的价值.结果 治疗前乳腺癌患者血清中的miR-10b,miR-145和miR-155表达水平高于对照组(P＜0.05),三者表达水平均与肿瘤转移显著相关,与年龄、组织学特征、ER表达无相关性(P＞0.05)miR-10 b与临床分期显著相关(P＜0.05),miR-10b的ROC曲线下面积为0.936,miR-145的ROC曲线下面积为0.904,miR-155的ROC曲线下面积为0.91.miR-10b,miR-145,miR155在Ⅲ级乳腺癌患者肿瘤组织的表达水平明显高于Ⅰ～Ⅱ级乳腺癌患者癌组织的表达水平(P＜0.05).结论 血清中miR-10 b、miR-145及miR-155有可能作为乳腺癌早期诊断的肿瘤标志物.
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microRNAs与系统性红斑狼疮研究进展
microRNAs (miRNAs)是一组非编码蛋白质的单链小分子RNA.通过基因表达转录后调控,导致基因的异常表达,参与生物体的多种生物学过程.近年来研究发现,microRNA参与系统性红斑狼疮(SLE)的发生、发展.本文对miRNAs在SLE中的研究进展作综述,对miRNA在SLE的调控和发病机制等进行阐述,为SLE研究提供思路.
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miRNA-124在上皮性卵巢癌组织中的表达及临床意义
目的 探讨miRNA-124在上皮性卵巢癌组织中的表达及临床意义.方法 选择2013年2月至2014年11月在浙江省台州医院就诊的上皮性卵巢癌组织85例 、良性上皮卵巢肿瘤组织35例和正常卵巢组织45例作为研究对象.采用实时荧光定量逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测组织中miRNA-124的表达水平,分析miRNA-124的相对表达量与临床病理特征及预后的关系.结果 卵巢癌组织中miRNA-124相对表达量为2.35±1.11,良性卵巢肿瘤组织中的表达量为5.13±2.01,正常组织中为6.29±2.12.卵巢癌组织中miRNA-124相对表达量明显低于良性卵巢肿瘤组织和正常组织(t值分别为7.123、11.650,均P<0.001);良性卵巢肿瘤组织中miRNA-124相对表达量低于正常组织(t=2.499,P=0.007).临床分期和组织分级越高,miRNA的相对表达量越低(t值分别为13.581、23.232,均P<0.001);有淋巴结转移者,miRNA的相对表达量越低(t=11.671,P<0.001);组织学类型与miRNA的相对表达量无关(t=1.003,P>0.05).高表达组的总生存率明显高于低表达组,差异有统计学意义(χ2=7.824,P=0.008).低表达量组中位生存期为(7.93±1.54)个月,明显低于高表达量组的(14.51±6.72)个月,差异有统计学意义(t=6.053,P<0.001).结论 上皮性卵巢癌组织中miRNA-124的相对表达量降低,提示其可能在卵巢癌的发病机制中起到抑癌基因的作用,另外,miRNA-124的表达量与卵巢癌的进展和转归有关.
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脂肪细胞分化相关miRNA-hsa-miR-378生物信息学分析
[目的]利用各种生物信息学工具分析hsa-miR-378转录调控、靶基因功能,以期为研究hsa-miR-378在人脂肪细胞分化过程中的功能与调控机制提供线索. [方法]应用UCSC Genome Browser、Promoter scan等在线工具,分析hsa-miR-378在基因组上下游10 kb以内的CpG岛分布情况、转录起始位置(TSS)、转录因子结合位置(TFBS)等；选择TargetScan、PicTar、MiRanda三种计算方法预测hsa-miR-378的靶基因,取三个预测结果的交集,并合并DIANA LAB-TarBase 6.0数据库的已验证靶标,对所得靶基因集分别进行GO注释描述、GO富集分析和pathway富集分析. [结果]hsa-miR-378可能具有独立的启动子,可能受C/EBPβ转录因子的调控；其预测靶基因集合富集于转录调控、蛋白质修饰、细胞分化等生物学过程和功能(P＜0.01)；并显著富集于TGF-β信号通路、Wnt信号通路等4个信号通路,以及甲状腺癌、系统性红斑狼疮等8个疾病通路中(P＜0.05). [结论]通过对hsa-miR-378转录调控元件、靶基因的分析,为hsa-miR-378在人脂肪细胞中的功能与调控机制研究提供了线索和理论依据.
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稳定高表达miR-449c的5637膀胱癌细胞株的建立
目的 构建稳定表达miR-449c的人膀胱癌细胞株.方法 以HEK293细胞基因组DNA作为模板,采用高保真酶进行扩增得到pre-miR-449c序列,将所得目的片段克隆到FtetUGW-T载体上;经测序鉴定后,感染5637人膀胱癌细胞;经嘌呤霉素筛选后,利用倒置荧光显微镜观察筛选后的细胞增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达强度,采用荧光实时定量PCR检测miR-449c的表达,Western blot法检测其下游靶基因C-myc蛋白的水平.结果 成功构建了FtetUGW-T/miR-449c慢病毒载体,慢病毒包装后感染5637人膀胱癌细胞成功表达EGFP,感染后的细胞中高表达miR-449c,在稳定表达的膀胱癌细胞中C-myc蛋白表达较对照组显著降低.结论 成功构建了稳定高表达miR-449c的5637膀胱癌细胞株.
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携带miRNA质粒的新型聚乙烯亚胺纳米凝胶抑制大鼠Kupffer细胞核因子κB的表达
目的 用新型聚乙烯亚胺纳米凝胶(PEI-NP)携带小RNA(miRNA)质粒沉默大鼠Kupffer细胞(KC)核因子κB(NF-κB)的表达.方法 凝胶电泳检测PEI-NP装载miRNA质粒的容量;PEI-NP/miRNA质粒转染RAW264.7细胞后分别采用CCK-8法检测细胞毒性,annexin Ⅴ-FITC/PI双染色结合流式细胞术检测RAW264.7细胞凋亡和转染率,实时定量PCR(qRT-PCR)检测RAW264.7细胞NF-κB mRNA水平,Western blot法检测RAW264.7细胞NF-κB蛋白水平,透射电镜观察阳离子聚合物在RAW264.7细胞和肝组织KC内的分布;免疫组织化学技术检测KC内NF-κB的表达.结果 PEI-NP/miRNA质粒质量比为20∶1时载荷率接近100％,体外转染RAW264.7细胞48h,转染率为(33.63±1.94)％.与对照组相比,PEI-NP/miRNA转染的RAW264.7细胞NF-κB蛋白含量显著降低,透射电镜观察到RAW264.7细胞内有大量PEI-NP.肝脏组织透射电镜只在KC内观察到PEI-NP分布;与对照组相比,免疫组织化学染色结果显示,KC内NF-κB蛋白水平明显降低.结论 PEI-NP携带miRNA质粒能成功转染体外培养的巨噬细胞和体内肝脏KC并沉默NF-κB的表达.
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miR-508-5P慢病毒过表达载体的构建及对S期激酶相关蛋白2靶向调控作用
目的 构建miR-508-5p慢病毒过表达载体,探讨其对SKP2基因的靶向调控作用.方法 基于化学法合成miR-508-5p茎环结构RNA,将其克隆入线性化的pSicoR质粒中,经双酶切及测序鉴定,将阳性重组体转染至HEK293T细胞;同时构建与miR-508-5p互补靶基因SKP2的3 '非翻译区(3'UTR),将其克隆入线性化的pMIR-Report载体中.通过相对荧光素酶活性、Western blot法及实时荧光定量PCR (qRT-PCR)法验证miR-508-5p与SKP2 3'UTR的靶向调控关系.结果 经PCR、酶切及测序结果证明成功构建了pSicoR-miR-508-5p及pMIR-Report-SKP2-3'UTR重组质粒,并通过实验证实miR-508-5p过表达明显抑制SKP2的蛋白表达水平及mRNA相对含量(P＜0.05);抑制miR-508-5p的表达,则明显上调SKP2的蛋白表达水平及mRNA相对含量(P＜0.05).结论 成功构建pSicoR-miR-508-5p慢病毒过表达载体,证实通过靶向作用于SKP2-3' UTR的特异序列直接抑制SKP2基因的表达.
关键词： microRNA miR-508-5P S期激酶相关蛋白2 -
人外周血树突状细胞MicroRNA表达谱的鉴定与分析
目的:探讨MicroRNA在专职抗原提呈细胞(APC)树突状细胞(DC)中的表达数种与数量分析.方法:从健康人外周血中分离单核细胞,经重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和重组人白细胞介素4(rhIL-4)刺激,待成长为成熟DC后,提取总RNA,用miRCURY LNATM microRNA Array进行分析.结果:经分析显示DCs中高表达(标准值＞2)的miRNA有85个,其中显著高表达的有hsa-miR-720、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-1260b、hsa-miR-1290、hsa-miR-22、hsa-miR-21、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-1246、hsa-miR-4284、hsa-miR-24、hsa-miR-491-3p、hsa-miR-3613-3p、hsa-miR-23b、hsa-miR-1280、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-1260、hsa-miR-23a、hsa-miR-29b、hsa-miR-16等.结论:提示以上miRNA分子在DCs参与的免疫应答中可能发挥着重要作用.
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病毒感染与miRNA的免疫调控机制研究进展
小RNA(miRNA)是长度在20～ 22碱基的一类非编码RNA,在细胞的发生、分化和凋亡等过程中有重要作用.病毒感染宿主之后,可以引发宿主体内miRNA表达谱的一系列变化,其中不乏在机体免疫过程中具有重要作用的miRNA.这一现象提示我们,病毒可以通过调控宿主细胞miRNA表达,进而导致细胞损伤或逃避免疫杀伤形成慢性感染的可能性.此外,部分病毒可以自身产生病毒miRNA,这一类小RNA也被证明在机体与病毒对抗的过程中具有重要意义.本文主要总结了病毒感染机体后,宿主miRNA表达谱的变化、宿主miRNA参与免疫应答的调控、宿主miRNA的抗病毒作用以及病毒产生miRNA对宿主免疫调控的影响,以期为病毒靶向治疗提供新的理论基础.
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microRNA调控CD4+T淋巴细胞分化与成熟的机制研究进展
小RNA (miRNA)是免疫系统的重要调节物,免疫细胞的谱系发育、增殖、分化、迁移和效应作用均受到miRNA的调控.miRNA主要通过靶作用于转录因子的mRNA形成复杂而精细的调控网络,不同的Th亚群受不同miRNA的调节,同时,某些miRNA如miR-155、miR-146a、miR-17-92簇等也可在多个不同的辅助T(Th)细胞亚群中起特定的调控作用,维持这些Th细胞亚群之间的分化平衡.miRNA的异常表达将导致Th细胞亚群之间的分化平衡被打破或功能失调,从而引发炎症或自身免疫性疾病.本文就免疫应答过程中miRNA对初始CD4+T细胞的活化及Th细胞亚群分化的重要调节作用进行综述.
