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miR-449c在胃癌中的表达
目的:检测胃癌组织中miR-449c的表达情况,探讨其与胃癌发生及预后的关系.方法:选取32例胃癌患者,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测癌旁组织(NGT)、胃癌组织(GC)及不同细胞株中miR-449c表达水平, Lipofectamine 2000转染法对相关细胞株miR-449c表达进行上调和下调,MTT 方法检测细胞的生长活力变化,流式细胞术检测细胞凋亡情况;随访30 个月,比较miR-449c低表达和高表达患者的生存率.结果:GC组织miR-449c表达(0.36±0.28)明显低于NGT组织 miR-449c表达(1.01±0.14) (P<0.05),且AGS、SNU-1、SNU-5、SNU-16细胞miR-449c表达(0.39±0.08)、(0.33±0.07)、(0.25±0.06)、(0.22±0.04)均明显低于NGT组织(1.01±0.14)(P<0.05);miR-449c模拟物对SNU-16细胞进行转染,其miR-449c表达水平(8.49±2.50)明显高于空质粒转染(P<0.05),第2、3 d细胞生长活力(0.80±0.10)、(0.90±0.12)明显低于空质粒转染(P<0.05),凋亡率(80.12±9.01)明显高于空质粒转染(P<0.05);miR-449c抑制物对AGS细胞进行转染,其miR-449c表达水平(3.00±0.50)明显低于空质粒转染(P<0.05),第2、3 d细胞生长活力(1.20±0.14)、(1.70±0.18)明显高于空质粒转染(P<0.05),凋亡率(8.00±1.00)明显低于空质粒转染(P<0.05);随访30个月,miR-449c高表达患者生存率50.00%明显高于miR-449c低表达者(P<0.05).结论:miR-449c在胃癌组织中低表达,抑制细胞生长,促进细胞凋亡,其低表达可能与胃癌患者低生存率有关.
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稳定高表达miR-449c的5637膀胱癌细胞株的建立
目的 构建稳定表达miR-449c的人膀胱癌细胞株.方法 以HEK293细胞基因组DNA作为模板,采用高保真酶进行扩增得到pre-miR-449c序列,将所得目的片段克隆到FtetUGW-T载体上;经测序鉴定后,感染5637人膀胱癌细胞;经嘌呤霉素筛选后,利用倒置荧光显微镜观察筛选后的细胞增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达强度,采用荧光实时定量PCR检测miR-449c的表达,Western blot法检测其下游靶基因C-myc蛋白的水平.结果 成功构建了FtetUGW-T/miR-449c慢病毒载体,慢病毒包装后感染5637人膀胱癌细胞成功表达EGFP,感染后的细胞中高表达miR-449c,在稳定表达的膀胱癌细胞中C-myc蛋白表达较对照组显著降低.结论 成功构建了稳定高表达miR-449c的5637膀胱癌细胞株.
