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新疆紫草PAL,HMGR,PGT基因的过表达和RNA干扰载体的构建
新疆紫草Arnebia euchroma是药用紫草的主要来源,其重要成分紫草素类化合物具有很高的药用和工业价值.研究采用GATEWAY技术,构建新疆紫草次生代谢关键酶基因PAL,HMGR,PGT的过表达载体和RNAi载体,为相关转基因株系的构建搭建好平台.新疆紫草次生代谢关键酶基因过表达和RNA干扰载体的构建,是基于遗传物质的遗传研究平台的搭建,对于次生代谢途径上基因功能验证和功能基因的挖掘提供了极大的便利,同时也填补了新疆紫草在转基因领域研究的空白,对于培育紫草素高产株系具有重要意义.
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Smad3对非小细胞肺癌A549细胞和宫颈癌HeLa细胞迁移的影响
目的 过表达、敲低或抑制Smad3的活性,探讨Smad3对非小细胞肺癌A549细胞和宫颈癌HeLa细胞迁移的影响.方法 设计扩增Smad3基因全长编码序列cDNA的引物,通过分子克隆技术构建pCMV-Myc-Smad3过表达载体,同时设计并合成靶向Smad3的siRNA序列,在A549和HeLa细胞中过表达或敲低Smad3,或者利用Smad3的抑制剂SIS32μM处理细胞,采用细胞划痕的方法研究Smad3对A549和HeLa细胞迁移的影响.结果 利用分子克隆技术成功构建pCMV-Myc-Smad3过表达载体.过表达Smad3促进A549和HeLa细胞的迁移.敲低Smad3抑制A549和HeLa细胞的迁移.SIS3抑制Smad3的活性导致A549和HeLa细胞的迁移速率变慢.结论 Smad3促进A549和HeLa细胞的迁移.
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MicroRNA-9过表达载体的构建与鉴定
目的:MicroRNA(miRNA)是一类对基因表达起着转录后调控的小分子RNA,在正常发育和疾病发生过程中都发挥着重要的功能.其中,miR-9是一个序列高度保守的成员,在神经发育中调节神经干细胞的多种行为,包括分化、迁移等.但是,目前研究发现的miR-9的功能还存在一些相互矛盾和不清楚的地方,因此,我们拟构建miR-9的过表达载体,以便于对miR-9进一步的仔细研究.方法:我们采用分子克隆的常用方法,以pcDNA6.2-GW/miR为基础,构建出pcDNA6.2-GW/miR-9的表达质粒,分别用PCR、酶切和测序的方法验证质粒构建的正确性,并在Hela细胞和NIH3T3细胞中验证该质粒是否可以过表达miR-9小分子.结果:我们成功构建出正确的pcDNA6.2-GW/miR-9表达质粒,并且该质粒无论在人源的Hela细胞还是在小鼠源性的NIH3T3细胞中都可以过表达miR-9小分子.结论:构建了一个在不同种属间通用的miR-9过载体,为我们进一步研究miR-9的功能奠定了基础.
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蛋白激酶C受体1过表达载体、干扰载体的构建及鉴定
目的：构建并鉴定蛋白激酶C受体1（ RACK1）过表达及干扰真核表达载体。方法采用逆转录聚合酶链反应（ RT-PCR）从人肝癌细胞系Huh-7．5．1中扩增RACK1全长cDNA系列，用巢式PCR扩增对应的CDS，并将其克隆到PIRES2-EGFP，PCR鉴定后进行测序分析。以人RACK1基因为靶基因，设计合成两对短发夹结构的互补DNA序列和一对阴性对照序列，退火后与酶切后的载体RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen进行连接，并行酶切分析和测序鉴定。将构建好的过表达载体和干扰载体用脂质体转染HUVEC细胞系。结果两对引物PCR扩增的序列大小与预期结果一致，PIRES2-EGFP/RACK1载体954个碱基成功插入到预计位点，序列完全一致。 RNA干扰载体pRetroQ/RACK1-1、pRetroQ/RACK1-2和pRetroQ/HK插入序列均与预计相符。荧光显微镜观察，转染的HUVEC细胞均表达EGFP和GFP。结论成功构建RACK1过表达载体及其RNA干扰载体，并可被成功导入HU-VEC细胞系。
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慢病毒介导长链非编码RNA LOC100132354过表达载体的构建及鉴定
目的 探讨慢病毒介导LOC100132354过表达载体的构建及鉴定.方法 化学合成LOC100132354全基因序列,与GV303载体进行连接反应获得重组质粒;进一步制备感受态细胞,并行转化实验,PCR鉴定进行转化子,对阳性转化子进行测序;构建好的LOC100132354过表达载体转染至293T细胞包装病毒,采用荧光显微镜观察荧光情况,用qPCR检测LOC100132354的表达情况.结果 酶切结果与预期一致,阳性转化子克隆测序结果与LOC100132354的RNA序列完全一致,293T细胞转染后荧光表达结果较强,qPCR结果显示293T细胞转染过表达载体后LOC100132354表达水平为对照组的555427.148倍,差异有统计学意义(P＜0.001).结论 成功构建了慢病毒介导LOC100132354过表达载体,为后续进一步研究提供了基础.
关键词： 慢病毒 过表达载体 长链非编码RNA LOC100132354 -
人血红素氧化酶-1基因pShuttle-CMV穿梭载体在Caco-2细胞株的表达及意义
目的 构建血红素氧化酶-1(HO-1)基因的真核过表达载体,观察转染人结肠癌细胞株Caco-2细胞后对其生长的影响和细胞定位.方法 构建人pShuttle-CMV-HO1载体,经测序、酶切鉴定正确后,采用脂质体转染法将载体转入Caco-2细胞中,经G418筛选并建立稳定过表达Caco-2细胞HO-1基因的细胞株.实验分为2组,分别为实验组(Caco-2-pS/HO-1)、对照组(Caco-2-pS),每组设3个复孔,应用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)法和Western blot法分别检测HO-1 mRNA和蛋白的表达水平；通过免疫荧光法观察HO-1分子在细胞内的分布；采用细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测HO-1基因过表达后对Caco-2细胞的增殖影响.结果 酶切及测序显示pShuttle-CMV-HO1载体构建符合预期.与Caco-2-pS组比较,Caco-2-pS/HO-1组细胞HO-1基因mRNA表达明显增加(63.55±0.86比3.66±0.36,P＜0.05),HO-1蛋白表达呈现相同趋势；对转染目的载体的细胞应用m-CY3标记的抗体进行免疫荧光实验,激光共聚焦显微镜观察到HO-1分子主要分布于细胞质与细胞膜；Caco-2-pS/HO-1组较Caco-2-pS组细胞增殖数量明显增加[(5.43±0.24)个比(3.25±0.25)个,P＜0.05].结论 成功构建HO-1基因真核过表达载体,HO-1蛋白主要表达于细胞膜及细胞质中,HO-1蛋白异常表达可以促进Caco-2细胞增殖,从而对体外肠黏膜屏障模型起到保护作用.
关键词： 血红素氧化酶-1基因 Caco-2细胞 过表达载体 肠黏膜屏障 -
小鼠arhgap39基因真核过表达载体的构建及其蛋白表达的初步研究
目的 构建arhgap39基因真核过表达载体并初步研究arhgap39蛋白表达的相关问题.方法 提取小鼠海马组织总RNA,逆转录合成cDNA,根据GeneBank中基因信息设计引物,高保真PCR扩增arhgap39基因的编码区,随后将其转移到真核载体上,转染NG-108细胞并观察其在细胞内的表达情况.结果 经酶切和测序鉴定表明成功构建arhgap39基因的相关真核过表达载体;将其转染NG-108细胞,免疫印迹试验证实arhgap39成功过表达,arhgap39的分子量约为140 kD.结论 我们的实验结果确认了arhgap39蛋白的分子量,并对其可能存在的存在形式做了验证性研究,可以为进一步的研究提供理论基础和研究工具.
关键词： arhgap39基因 过表达载体 剪切体 分子量 小鼠 -
miR-18a过表达及抑制表达人鼻咽癌细胞株的构建
[目的]建立稳定miR-18a过表达及表达的人鼻咽癌细胞系,为研究miR-18a在鼻咽癌发生发展中的功能奠定基础.[方法]将miR-18a前体的编码基因片段及miR-18a反义寡核苷酸克隆到慢病毒载体中,DNA测序鉴定;将构建好的载体转染293T细胞,获得重组miR-18a过表达及抑制表达的慢病毒载体,感染人鼻咽癌细胞CNE1和CNE2,嘌呤霉素筛选获得稳定干扰miR-18a表达及过表达miR-18a的细胞系,PCR及western blot鉴定.[结果]成功构建真核表达的慢病毒miR-18a干扰载体及过表达载体,滴度均为3×108TU/mL;转染miR-18a抑制表达的慢病毒载体的CNE1和CNE2中ATM表达增高;与对照病毒转染相比,转染miR-18a过表达慢病毒载体的CNE1(20.3倍,P<0.01)和CNE2(122.5倍,P<0.01)中miR-18a表达显著增高,靶蛋白ATM表达下调.[结论]成功构建人miR-18a慢病毒抑制表达和过表达载体,并获得相应的慢病毒稳转人鼻咽癌细胞株.
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microRNA-223过表达与抑制表达慢病毒载体的构建及鉴定
目的 构建microRNA-223过表达慢病毒载体及抑制表达慢病毒载体,并验证其过表达或抑制表达microRNA-223的效率.方法 设计针对microRNA-223前体的过表达基因片段及针对microRNA-223成熟体的反义片段,应用聚合酶链反应(PCR)调取目的基因及通过退火反应获得双链DNA寡聚核苷酸片段.并通过基因重组技术将目的基因片段及反义片段分别克隆到GV229及GV232慢病毒载体中,进行PCR鉴定及DNA测序比对分析,构建相应的microRNA-223过表达慢病毒载体及抑制表达慢病毒载体.利用荧光定量PCR法检测microRNA-223表达水平.结果 对阳性克隆进行PCR鉴定及DNA测序证明,microRNA-223过表达慢病毒载体及抑制表达慢病毒载体构建成功.microRNA-223过表达慢病毒载体能显著提高细胞中microRNA-223表达水平,microRNA-223抑制表达慢病毒载体能明显抑制细胞中microRNA-223表达水平.结论 成功构建microRNA-223过表达慢病毒载体及抑制表达慢病毒载体,为进一步研究microRNA-223对口腔癌发生发展的影响及其机制提供了稳定的细胞转染载体.
关键词： MicroRNA-223 慢病毒 过表达载体 抑制表达载体 -
小鼠microRNA-150慢病毒过表达载体及抑制载体的构建及鉴定
目的 构建microRNA-150慢病毒过表达载体及抑制载体.方法 设计针对microRNA-150前体的过表达基因片段及针对microRNA-150成熟体的反义片段,应用基因重组技术将目的 基因片段克隆到pWPI慢病毒载体中,并进行DNA测序鉴定重组克隆.结果 菌落PCR筛选鉴定出构建正确的慢病毒载体,DNA测序证实插入的基因序列正确.结论 成功构建microRNA-150慢病毒过表达载体及抑制载体,为研究microRNA-150在肝再生中的作用及其机制提供了稳定的细胞转染载体.
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pGV141-satb2真核表达载体的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达
目的:构建satb2的真核过表达载体,观察转入重组载体后C3H10T1/2细胞中satb2的表达情况.方法:根据satb2基因CDS区设计引物,以PCR的方法获得目的基因,将satb2片段双酶切后插入到pGV141载体中进行重组质粒的构建,用PCR和基因测序进行鉴定,将构建成功的重组质粒转染入C3H10T1/2细胞,并通过目的蛋白的检测观察satb2在骨髓间充质干细胞中的表达情况.结果:重组过表达载体GV141-satb2构建成功;与未转染质粒C3H10T1/2细胞相比,转染pGV141-satb2质粒的C3H10T1/2细胞中satb2蛋白表达显著增高,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:satb2真核过表达载体构建成功,体外转染实验证实可显著提高骨髓间充质C3H10T1/2细胞中satb2蛋白的表达.
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CDK2AP1基因过表达慢病毒载体的构建与鉴定
目的:构建CDK2AP1基因慢病毒过表达载体,感染人口腔鳞癌细胞系SCC-25细胞系中,为CDK2AP1基因体内外实验研究奠定实验基础.方法:将pCDH-CMV-GFP慢病毒载体Sal Ⅰ和Xba Ⅰ酶切位点插入CDK2AP1基因序列,构建pCDH-GFP-CDK2AP1慢病毒质粒.经PCR鉴定、测序验证CDK2AP1基因后,将其和慢病毒包装质粒混合物共同转染病毒包装细胞293TN,转染24小时后产生重组病毒GFP-CDK2AP1慢病毒颗粒.经病毒浓缩纯化后,感染SCC-25口腔鳞癌细胞系并测定感染效率.结果:GFP CDK2AP1病毒中携有转染正确的CDK2AP1基因,感染人SCC-25细胞系后能稳定表达.结论:成功地在舌鳞癌细胞系SCC-25中构建了CDK2AP1基因的重组慢病毒过表达载体,为研究其在头颈鳞癌的生物学功能奠定基础.
