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沙蚕金属蛋白酶体外抗凝血与溶栓作用
目的 研究沙蚕金属蛋白酶(NVMP)体外的抗凝血和血栓溶解作用.方法 以pH7.4的生理盐水为对照,在体外研究NVMP对家兔新鲜血液的抗凝血和血栓溶解作用；采用SDS-PAGE电泳法观察NVMP对纤维蛋白原的降解作用；采用琼脂糖-纤维蛋白平板法研究NVMP在体外溶解纤维蛋白的作用方式.结果 不同剂量的NVMP在体外均具有较强的抗凝血和溶解血栓的作用；沙蚕金属蛋白酶先水解纤维蛋白原的Aα链,然后是Bβ和γ链；能够直接溶解纤维蛋白,也具有激活纤溶酶原将其转变成纤溶酶,间接水解纤维蛋白的激酶活性.结论 NVMP在体外具有明显的降纤、抗凝血和溶解血栓的作用,是一种有临床应用前景的治疗血栓性疾病的药物.
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一种新的沙蚕纤溶酶的纯化、活性鉴定及部分分子特性
目的:从沙蚕Nereis virens的体腔液中纯化、鉴定出一种新的纤溶酶,并对其进行分子表征.方法:运用离子交换层析、凝胶过滤层析等常规色谱方法纯化蛋白酶,采用纤维蛋白板检测法鉴定纤溶活性及活性分布曲线,利用2D-电泳方法检测此纤溶酶的表观分子量和等电点,并检测多种蛋白酶抑制剂对其酶活性的影响,以确定此蛋白酶的类型.结果:获取一种新的具有极强纤维蛋白水解活性的单链蛋白酶,其相对分子质量为29000,等电点为4.5,其蛋白水解活性在pH7.8和45℃时表现为高,并能被二异丙基氟磷酸(DFP)和甲苯磺酚氟(PMSF)完全性抑制,确证其为一种典型的丝氨酸内肽酶.结论:Nereis virens的体腔液中存在一种纤溶活性极强的单链丝氨酸内肽酶,该纤溶酶对预防和治疗血栓性疾病具有一定的药用价值.
关键词： 沙蚕 Nereis virens 纤溶酶 纤维蛋白水解活性 丝氨酸内肽酶类 -
高效液相凝胶过滤色谱法测定沙蚕金属蛋白酶的纯度
目的 采用高效液相色凝胶过滤谱法测定纯化的沙蚕金属蛋白酶的纯度.方法 以TSK-GEL G2000 SW (7.5×300mm)为色谱柱,20mM PB+0.15 M NaCl (pH7.0)为流动相,流速为1.0 ml/min,检测波长为280 nm,上样量为20μl,采用等度洗脱的方式,根据峰面积归一法,测定沙蚕蛋白酶的纯度.结果 用该种方法检测的沙蚕蛋白酶的纯度高于95％.结论 前期纯化的沙蚕金属蛋白酶获得了较为理想的纯度.
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沙蚕胶囊的毒理学实验研究
沙蚕为环节动物门,多毛纲(Polychaeta),沙蚕科.沙蚕含有大量的蛋白质,脂肪和微量元素,有良好的滋补价值[1],清代赵学敏著<本草纲目拾遗>中记载:"补脾胃,生血利湿,行小便".白芍,当归,熟地,黄苠,均为2000年药典收载的常用中药,有几千年的药用历史,其改善营养性贫血功能十分肯定.
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3种沙蚕中脂肪酸分析及5种不饱和脂肪酸测定
目的 建立气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)法分析疣吻沙蚕Tylorrhynchus heterochaetus、双齿围沙蚕Perinereis aibuhitensis和日本刺沙蚕Neanthes japonica中脂肪酸,并采用GC法测定EPA(二十碳五烯酸)、DHA(二十二碳六烯酸)、AA(花生四烯酸)、LNA(亚麻酸)、LA(亚油酸)含有量.方法 石油醚提取沙蚕中脂肪酸后,氢氧化钾-甲醇溶液将其甲酯化.GC-MS/MS法分析14批样品中主要的脂肪酸成分,NIST库匹配,并计算相对含有量.GC法测定5种不饱和脂肪酸的含有量,通过SPSS16.0软件进行聚类分析.结果 沙蚕中含有18种脂肪酸,其中不饱和脂肪酸含有量较高.5种不饱和脂肪酸线性关系均良好(r ＞0.999 7),加样回收率(n=6)为94.1％～99.94％.聚类分析将样品分成两类,可鉴别疣吻沙蚕,但不能区分双齿围沙蚕和日本刺沙蚕.结论 该方法稳定可靠,可用于沙蚕的质量评价.
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沙蚕活性物质的提取分离及对黑色素瘤细胞A375的作用机制
为研究沙蚕提取物的体外抗肿瘤活性与机制,取海洋环节动物沙蚕(Nereis virens)冻干粉,经乙醇浸提、乙酸乙酯萃取,得到萃取物A1;经硅胶柱分段梯度洗脱分离得组分Bi,其中石油醚∶乙酸乙酯(体积比3∶7)洗脱的组分B4具有较好的抗肿瘤活性.采用制备型HPLC对B4进一步梯度洗脱分离得到Ci等5个组分.噻唑蓝(MTT)法测定表明,组分C4具有显著的体外抗A375细胞生长的活性,其IC50(48 h)值达到52.67 μg/mL.AO/EB染色法观察细胞凋亡,显示药物处理48 h后细胞明显出现凋亡现象;通过流式细胞术及测定相对酪氨酸酶活力和黑色素含量,发现组分C4的抗肿瘤细胞A375机制以诱导细胞凋亡为主.
关键词： 沙蚕 分离 抗肿瘤细胞A375活性 细胞凋亡 细胞分化 -
沙蚕(Perinereis aibuhitensis)硫酸多糖的结构表征及抗凝血活性研究
目的 对来源于沙蚕(Perinereis aibuhitensis)的硫酸多糖进行结构表征和抗凝血活性研究.方法 采用两步酶解法从沙蚕中提取多糖;利用强阴离子交换色谱和凝胶渗透色谱对粗多糖进行分离纯化;通过离子色谱法、高效液相色谱法(HPLC)、高效凝胶渗透色谱-多角度激光光散射仪(HPGPC-MALLS)联用技术、硫酸软骨素酶ABC酶法分析、核磁共振氢谱(1H-NMR)等方法,研究纯化多糖的化学组成和结构特征;通过测定APTT、PT和TT评价其体外抗凝血活性.结果 从沙蚕中纯化得到了2种硫酸多糖组分PAE1和PAE2,PAE1主要由Gal、Glc、GalN、GlcA及少量Fuc组成;PAE2主链为硫酸软骨素C[→4GlcAβ1 →3GalNAc6Sβ1→],支链主要由Fuc、Gal和Glc构成.PAE1和PAE2均可明显延长APTT和PT.结论 首次从沙蚕中提取、分离得到2种硫酸多糖,其中PAE2是1种含有Fuc、Gal与Glc支链并具有明显的体外抗凝血活性的结构新颖的类硫酸软骨素,该发现为沙蚕硫酸多糖的开发提供了依据.
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重组沙蚕溶栓活性蛋白酶的纯化及其性质研究
目的 表达、纯化重组沙蚕溶栓活性蛋白酶并对其性质进行研究.方法 将表达裁体pMAL-PPA转化入E.coli DH5a构建工程茵,IPTG诱导工程茵大量表达麦芽糖结合蛋白-沙蚕溶栓活性蛋白酶(MBP-PPA),细胞裂解液中融合蛋白经Amylose-resin亲和层析与DEAE-Scpharose FF离子交换层析得到了纯化.用Factor Xa切割融合蛋白后经酪蛋白平板法检测其纤雏蛋白溶酶原激活活性,然后对其部分性质进行了研究.结果 构建了表达MBP-PPA的工程茵,经纯化得到相对分子质量约51kDa的融合蛋白.Factor Xa切割融合蛋白后,重组沙蚕溶栓活性蛋白酶(PPA)体外具有纤维蛋白溶酶原激活活性,性质研究表明PPA热稳定性好,适pH为8.0,该酶在pH6.0～9.0范围内有较好的稳定性,酶活在有机溶剂中至少维持20d,25mmol·L-1PMSF能完全抑制其活性.结论 证实PPA是一种纤溶酶原激活荆,且将来有望成为一种新型溶辁药物.
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沙蚕组织内几种营养成分的分析
对沙蚕组织内营养成分进行了分析.结果表明,沙蚕组织内含有67.43%的氨基酸,14.24%的脂肪酸,其中EPA含量为6.5343%,谷氨酸含量为10.288%;此外还含有大量的Zn,I和Se等元素以及纤溶酶等,显示了它作为功能食品及药用物质的潜在应用价值.
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沙蚕毒素类农药中毒7例临床报告
我院1998年12月至1999年10月共收治沙蚕毒素类农药中毒7例,现将其临床特点及治疗报告如下.
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不同品种沙蚕中氨基酸含量的HPLC测定及多元统计分析
目的:测定不同品种沙蚕中15种氨基酸含量并进行多元统计分析.方法:采用酸水解法制备水解氨基酸样品溶液,以异硫氰酸苯酯为衍生化试剂衍生后进行HPLC分析.采用CAPCELL PAK C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),以0.1 mol· L-1醋酸钠溶液(pH 6.5)-乙腈(93∶7)为流动相A,乙腈-水(8∶2)为流动相B,梯度洗脱,流速1.0 mL· min-1,柱温40℃,检测波长254 nm,进样量2μL.采用主成分分析法对不同品种沙蚕中15种氨基酸相对含量进行分析.结果:15种氨基酸在一定浓度范围内呈良好线性关系,线性相关系数r值均大于0.999 6,加样回收率(n=6)为96.1％～101.5％,氨基酸衍生溶液在12h内稳定;氨基酸相对含量的主成分分析可以达到降维的目的,各品种沙蚕样品得到较好的区分.结论:所建立的条件方法可靠,精密度和重复性良好,可用于沙蚕中水解氨基酸含量的测定,主成分分析可用于揭示沙蚕的特征氨基酸,为沙蚕品质特征评价提供依据.
