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白藜芦醇对甲醛诱导PC12细胞氧化损伤的影响
目的 探讨白藜芦醇对甲醛诱导PC12细胞损伤干预的可能机制.方法 以甲醛损伤PC12细胞为氧化应激损伤模型,用不同浓度(6.25、12.5、25、50、100 μmol/L)的白藜芦醇预处理PC12细胞2 h后,加入终浓度为80 μmol/L甲醛作用24 h.并设氨基胍100 μmol/L为阳性对照组.采用四甲基偶氮噻唑蓝比色法检测细胞活力;分光光度法测定乳酸脱氢酶(LDH)漏出量;硫代巴比妥酸法测定MDA含量;黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性;二硫对二硝基苯甲酸(DTNB)比色法测定谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性;硝酸还原酶法测定一氧化氮(NO)含量、一氧化氮合酶(iNOS)活性;并收集各组细胞,检测细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ(COⅡ)蛋白活性及mRNA的表达;Hoechst 33258荧光染色法和流式细胞技术检查细胞凋亡情况.结果 白藜芦醇能明显改善甲醛所致PC12细胞损伤,与甲醛处理组相比,细胞存活率随着白黎芦醇浓度的增加而加强,且100 μmol/L白藜芦醇组细胞存活率为(92.66±3.27)%,高于氨基胍阳性对照组[(82.18±2.06)%];在白黎芦醇6.25～100 μmol/L浓度范围内,SOD、GSH-Px活性、COⅡ蛋白及mRNA表达水平随着白藜芦醇浓度增加而逐渐升高;LDH漏出量、NO、MDA含量、iNOS活性随着处理浓度的增加而逐渐降低.结论 白藜芦醇对甲醛诱导PC12细胞损伤具有保护作用,在一定范围内呈剂量-效应关系;能有效改善甲醛所致PC12细胞的氧化损伤,提高细胞存活率;这种抗氧化活性可能与抑制甲醛/ROS、甲醛/NOS/NO氧化应激途径、减轻线粒体损伤有关.
关键词： 白藜芦醇 甲醛 鼠肾上腺嗜铬细胞瘤单克隆细胞系 细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ -
冠心病患者线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ基因片段的重排
采用玻璃粉微量吸附法获取DNA直接作为PCR反应的模板，利用巢式PCR技术，检测冠心病患者血细胞内编码细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ的线粒体DNA扩增片段多态性，探讨线粒体DNA的片段缺失与动脉粥样硬化发生发展的关系。研究发现在全部冠心病患者编码细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ的基因中出现了大约100 bp的缺失片段，其中1例冠心病患者中还出现了大约450 bp核基因组和600 bp的线粒体DNA扩增片段，而在正常对照老人中没有出现片段的重排现象。表明冠心病患者中存在该基因片段的缺失和模板量减少的现象，该基因可能参与了冠状动脉粥样硬化的形成与发展，编码呼吸链复合物一些亚基线粒体DNA片段的重排可能是动脉粥样硬化进行性发展的恶化因素。
关键词： 线粒体DNA缺失 细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ 基因 冠状动脉疾病 -
肿瘤坏死因子受体相关蛋白1对大鼠缺氧心肌细胞保护作用的机制
目的 探讨肿瘤坏死因子受体相关蛋白1(TRAP1)对大鼠缺氧心肌细胞保护作用的机制. 方法 取1～3d龄SD大鼠乳鼠,分离培养心肌细胞,用于以下实验.(1)取细胞,按随机数字表法(分组方法下同)分为TRAP1组和对照组,提取细胞总蛋白.TRAP1组细胞总蛋白加入小鼠抗大鼠TRAP1单克隆一抗,对照组细胞总蛋白加入小鼠来源的同型IgG,免疫共沉淀法和蛋白质谱分析检测TRAP1可能作用的蛋白.(2)取细胞,分为常氧空白对照组、常氧+TRAP1干扰对照组、常氧+TRAP1干扰组、常氧+TRAP1过表达对照组、常氧+TRAP1过表达组,每组1孔.常氧空白对照组细胞常规培养,后4组细胞分别加入TRAP1RNA干扰空病毒载体、TRAP1 RNA干扰腺病毒载体、TRAP1过表达空病毒载体、TRAP1过表达腺病毒载体.另取细胞,分为常氧空白对照组、缺氧空白对照组、缺氧+ TRAP1干扰对照组、缺氧+TRAP1干扰组、缺氧+TRAP1过表达对照组、缺氧+TRAP1过表达组,每组1孔.各缺氧组细胞同前对应的常氧组细胞处理后,缺氧6h.实时荧光定量RT-PCR检测各组细胞中细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ(COX Ⅱ)mRNA表达.本实验重复3次.(3)取细胞,分为常氧空白对照组、缺氧空白对照组、缺氧+ TRAP1过表达对照组、缺氧+TRAP1过表达组、缺氧+TRAP1过表达+COX Ⅱ干扰对照组、缺氧+TRAP1过表达+COX Ⅱ干扰组,每组3孔.前4组细胞的处理同(2),后2组细胞分别加入COX Ⅱ RNA干扰空病毒载体、COX Ⅱ RNA干扰腺病毒载体转染后,再分别加入TRAP1过表达腺病毒载体.细胞计数试剂盒8及酶标仪检测细胞增殖活性,碘化丙啶和Hoechst 33342染色检测细胞死亡率.另取细胞,分为常氧空白对照组、缺氧空白对照组、缺氧+TRAP1干扰对照组、缺氧+TRAP1干扰组、缺氧+TRAP1干扰+COXⅡ过表达对照组、缺氧+TRAP1干扰+COX Ⅱ过表达组,每组3孔,前4组细胞的处理同(2),后2组细胞均加入TRAP1RNA干扰腺病毒载体转染后,再分别加入COX Ⅱ过表达空病毒载体、COX Ⅱ过表达腺病毒载体,同前检测细胞增殖活性和死亡率.本实验重复3次.对数据行单因素方差分析、LSD检验. 结果 (1)TRAP1组细胞有TRAP1表达,对照组细胞未见TRAP1表达.TRAP1可能作用的3个蛋白是角蛋白、COX Ⅱ和预测分子量为13×103的未知蛋白.(2)与常氧空白对照组比较,常氧+ TRAP1干扰对照组、常氧+TRAP1过表达对照组细胞COX Ⅱ mRNA表达量无明显变化(P值均大于0.05),常氧+TRAP1干扰组细胞COX Ⅱ mRNA表达量明显降低(P＜0.01),常氧+TRAP1过表达组细胞COX Ⅱ mRNA表达量明显升高(P＜0.01).缺氧空白对照组细胞COX Ⅱ mRNA表达量较常氧空白对照组明显降低(P＜0.01).与缺氧空白对照组比较,缺氧+TRAP1干扰对照组、缺氧+TRAP1过表达对照组细胞COX Ⅱ mRNA表达量无明显变化(P值均大于0.05),缺氧+TRAP1干扰组细胞COX Ⅱ mRNA表达量明显下降(P＜0.01),缺氧+ TRAP1过表达组细胞COX Ⅱ mRNA表达量明显升高(P＜0.o1).(3)常氧空白对照组、缺氧空白对照组、缺氧+ TRAP1过表达对照组、缺氧+TRAP1过表达组、缺氧+TRAP1过表达+COX Ⅱ干扰对照组、缺氧+TRAP1过表达+COX Ⅱ干扰组细胞增殖活性分别为0.498±0.022、0.303±0.018、0.313 ±0.032、0.456 ±0.031、0.448±0.034、0.335±0.026,细胞死亡率分别为(4.7±1.5)％、(24.7±3.1)％、(26.0±2.7)％、(13.3±2.5)％、(12.7±2.1)％、(21.0±1.7)％.与常氧空白对照组比较,缺氧空白对照组细胞增殖活性降低、细胞死亡率增加(P值均小于0.01).与缺氧空白对照组比较,缺氧+TRAP1过表达对照组细胞增殖活性、细胞死亡率均无明显变化(P值均大于0.05),缺氧+TRAP1过表达组细胞增殖活性升高、细胞死亡率降低(P值均小于0.o1).与缺氧+TRAP1过表达组比较,缺氧+TRAP1过表达+COX Ⅱ干扰对照组细胞增殖活性、细胞死亡率均无明显变化(P值均大于0.05),缺氧+TRAP1过表达+COX Ⅱ干扰组细胞增殖活性降低、细胞死亡率增加(P值均小于0.01).(4)常氧空白对照组、缺氧空白对照组、缺氧+TRAP1干扰对照组、缺氧+ TRAP1干扰组、缺氧+TRAP1干扰+COXⅡ过表达对照组、缺氧+TRAP1干扰+COX Ⅱ过表达组细胞增殖活性分别为0.444±0.025、0.275±0.016、0.283±0.021、0.150±0.009、0.135±0.011、0.237±0.017,细胞死亡率分别为(3.7±0.6)％、(21.0±2.7)％、(20.3±3.1)％、(31.7±2.5)％、(33.3±3.2)％、(19.3±1.5)％.与缺氧空白对照组比较,缺氧+TRAP1干扰对照组细胞增殖活性、细胞死亡率均无明显变化(P值均大于0.05).与缺氧空白对照组和缺氧+TRAP1干扰对照组比较,缺氧+ TRAP1干扰组细胞增殖活性降低、细胞死亡率增加(P值均小于0.01).与缺氧+TRAP1干扰组比较,缺氧+TRAP1干扰+COX Ⅱ过表达对照组细胞增殖活性、细胞死亡率均无明显变化(P值均大于0.05),缺氧+TRAP1干扰+COX Ⅱ过表达组细胞增殖活性升高、细胞死亡率降低(P值均小于0.01). 结论 TRAP1能够正向调节COX Ⅱ mRNA表达,COX Ⅱ是TRAP1保护缺氧心肌细胞的下游效应分子.
关键词： 肌细胞 心脏 缺氧 细胞增殖 细胞死亡 肿瘤坏死因子受体相关蛋白1 细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ
