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H2O2诱导大鼠原代海马神经细胞建立氧化损伤细胞模型
目的 以H2O2诱导大鼠原代海马神经细胞建立氧化损伤细胞模型.方法 取新生大鼠海马神经细胞,培养至第5天,加入终浓度为50、100、150、200和250μmol/L的H2O2,培养12、24和48 h后,观察细胞形态,通过MTT法测定细胞存活率,CCK-8法测定细胞损伤率,LDH酶标法测定上清液LDH活性,Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡率,确定出细胞损伤的佳浓度时间.结果 H2O2可诱导神经细胞损伤且呈时间浓度依赖性.150 μmol/L H2O2作用24 h时,MTT法测得细胞存活率为(70.18±4.66)％;CCK-8法测得细胞损伤率为(28.30±6.72)％;LDH酶标法测得LDH活性为(208.81±12.24) U/L;流式细胞术测得细胞早期凋亡率为(11.53±2.53)％,晚期凋亡率及坏死率为(13.75±2.22)％.结论 150μmol/L的H2O2作用24 h,可成功构建海马神经细胞氧化损伤模型.
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神经鞘磷脂合成酶2基因敲除小鼠海马神经细胞自噬现象
目的 利用神经鞘磷脂合成酶2( SMS2)基因敲除小鼠探讨神经酰胺对海马神经细胞自噬现象的影响. 方法 将SMS2杂合子(SMS2+/-)小鼠采用杂交、回交、互交的方法进行繁殖,用酚-氯仿提取法提取小鼠基因组DNA,PCR扩增目的基因,琼脂糖凝胶电泳对小鼠基因型作出鉴定,建立纯合子(SMS2-/-)小鼠模型；采用透射电子显微镜、免疫荧光染色及Western blotting技术观察生后第7天(P7)、P14和P30 SMS2-/-小鼠海马CA1区神经细胞自噬的发生(每种方法每个时间点8只小鼠). 结果 1.SMS2-/-小鼠海马CA1区神经细胞自噬现象:电子显微镜下,模型组海马神经元内出现较多自噬体或自噬溶酶体样结构.光镜下,模型组P7、P14和P30 CA1区神经元自噬细胞数较对照组高(P＜0.01)；2.自噬相关蛋白Beclin-1对于自噬的调节作用:Beclin-1在模型组与对照组间的表达规律与微管相关蛋白1轻链3( MAPLC3)基本一致,P7、P14、P30模型组Beclin-1阳性细胞数明显多于对照组(P＜0.01).Beclin-1与MAPLC3两者在同一细胞中基本呈重叠表达；3.Western blotting检测各组海马CA1区神经细胞MAPLC3蛋白的相对表达量与上述结果一致. 结论 SMS2-/-小鼠海马神经细胞内神经酰胺增高,神经酰胺不仅促进细胞凋亡,同时促进自噬,造成小鼠海马神经细胞自噬现象增强.
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中药复方水煎液对体外培养大鼠海马神经细胞缺氧损伤的保护作用
目的探讨中药复方水煎液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ号对大鼠海马神经细胞缺氧损伤有无保护作用.方法 16只Wistar大鼠,随机分为4组,第1组每天分两次灌喂生理盐水4ml,第2-4组分别每天分两次灌喂等量中药复方水煎液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ号,3天后取血,制备血清.另取新生48小时内的Wistar大鼠,在无菌条件下断头取脑,分离海马,制成细胞悬液体外培养.在培养第7天将培养皿随机分为5组,第1组为正常对照组,第2-5组分别加入灌喂生理盐水及中药复方Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ号的大鼠血清,24小时后2-5组培养皿置缺氧环境1小时,之后再培养24小时,检测各培养皿细胞存活率及培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性和丙二醛(MDA)含量.结果灌喂复方Ⅰ号组和Ⅱ号组大鼠血清的培养液中LDH的活性和MDA的含量明显低于缺氧对照组,细胞存活率高于缺氧对照组,均有统计学意义( P<0.05-0.001).结论中药复方Ⅰ号和Ⅱ号对体外培养大鼠海马神经元缺氧损伤具有保护作用.
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乌参醒脑方对大鼠脑缺血致血管性痴呆的神经保护作用
目的:考察乌参醒脑方(WSXN)对大鼠脑缺血致血管性痴呆的神经保护作用.方法:大鼠随机分为假手术组、模型组、WSXN低、中、高剂量组(28,56,112 mg·kg-1)和EGB761阳性对照组(80 mg·kg-1),每组10只;采用改良的Pulsinelli四血管阻断法制备全脑缺血-再灌注损伤学习记忆的大鼠血管性呆模型.灌胃给药20 d(预防6d+治疗14d),对照组给予等容量溶媒.采用Morris水迷宫定向航行试验及空间探索试验检测各组大鼠的学习记忆能力,光镜观察脑海马神经组织及细胞形态学变化.结果:大鼠全脑缺血再灌注引起脑海马神经细胞损伤和学习忆力能力损害;中、高剂量WSXN和EGB761能剂量依赖性地显著增加脑缺血后大鼠海马幸存的活锥体神经元密度和尼氏体数目,还能改善血管性痴呆大鼠的空间学习记忆和参照记忆能力.结论:乌参醒脑方对全脑缺血再灌注神经损伤和血管性痴呆有显著的治疗作用.
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葛根素对氧糖剥夺大鼠海马神经细胞Ca2+和NO的影响
目的 研究葛根素(puerarin,Pur)对缺氧缺糖状态下海马神经细胞内ca2+和NO水平的影响.方法 选用新生大鼠体外培养8 d的海马神经细胞,进行3 h的氧糖剥夺(oxygen/glucose deprivation,OGD)或30 min的L-谷氨酸(0.5mmol·L-1)处理后再正常培养24 h,Pur处理组在OGD或谷氨酸处理的同时和以后24 h给予不同剂量(40,100 μmol·L-1)PIlr.Annexin V联合流式细胞仪检测细胞的凋亡率和坏死率;以Fluo-3或DAF-2为荧光标记.用激光共聚焦显微镜观测30 rain的OGD过程中海马神经细胞Ca2+和NO的动态变化以及Pur的影响.结果 OGD诱导海马神经细胞Ca2+和NO水平快速升高,其高值分别达正常对照组的2.9和1.9倍;Pur明显减缓OGD期间神经细胞Ca2+内流和NO合成,与OGD组相比,40和100 μmol·L-1的Pur分别使细胞Ca2+峰值降低29.2%和37.1%(P＜O.05和P＜0.01),N0峰值降低23%和33%(P＜0.05和P<0.01),显著抑制细胞内Ca2+和NO水平的升高;同时Pur可有效抑制OGD和谷氨酸引起的神经细胞死亡.结论 Pur可通过抑制神经细胞谷氨酸/Ca2+/NO通路的活动而有效保护缺氧缺糖对神经细胞的损伤作用.
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茯苓水提液对叠氮钠致原代培养的新生大鼠海马神经细胞线粒体损伤的影响
目的从生化和形态学的角度观察茯苓水提液对叠氮钠致原代培养的新生大鼠海马神经细胞线粒体损伤的影响.方法新生大鼠海马神经细胞原代培养至第11天,吸弃培养液,加入MTT(0.4mg·mL-1)温育4 h,用自动酶标仪在550nm处检测被神经细胞线粒体酶还原的MTT的量,以此作为评价细胞活力的指标.通过间接免疫荧光(一抗为鼠抗α-tubulin抗体)的方法,利用激光扫描共聚焦显微镜观察来评价神经细胞骨架改变.结果叠氮钠与培养细胞孵育能剂量依赖性地损伤细胞,64mmol·L-1孵育4 h时,细胞的线粒体酶还原MTT的能力为对照组的(60.73±5.13)%,微管结构模糊、紊乱.茯苓水提液(10～20mg·mL-1)与细胞预孵育24 h,能明显抵抗叠氮钠引起的神经细胞线粒体还原MTT的能力下降,微管结构紊乱.结论茯苓对维持神经细胞线粒体的功能及微管结构方面有重要作用,对防治某些神经退行性疾病如老年性痴呆、血管性痴呆及帕金森氏病等,可能具有一定的应用前景.
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一氧化氮合酶在氟致大鼠原代海马神经细胞氧化损伤及细胞凋亡中的作用
目的 采用一氧化氮合酶(eNOS)抑制剂L-亚氨基乙基鸟氨酸(L-NIO)探讨一氧化氮合酶在氟致大鼠原代海马神经细胞氧化损伤及细胞凋亡中的作用.方法 将体外培养的大鼠海马神经细胞分为对照(空白培养基)组和NaF(0.05、0.1、0.2、0.4、0.5、1、2、4mmol/L)单独染毒组及L-NIO(1、2、3、4、5、10 μmol/L)单独染毒组,染毒48 h后,采用CCK-8法测定细胞活性.将大鼠海马神经细胞分为对照(空白培养基)组、NaF(0.2、1 mmol/L)单独染毒组、NaF和L-NIO联合染毒组(0.2 mmol/L NaF+3 μmol/L L-NIO和1 mmol/L NaF+3μmol/L L-NIO),染毒48 h后,检测细胞中eNOS蛋白和mRNA的表达水平及细胞凋亡情况以及细胞培养液中一氧化氮(NO)含量和NOS活力.结果 与对照组相比,0.02～4 mmol/L NaF染毒组及4～10 mmo1/L L-NIO染毒组大鼠海马神经细胞的存活率均较低,差异有统计学意义(P＜0.05).与对照组相比,仅0.2、1 mmol/L NaF染毒组大鼠海马神经细胞中eNOS蛋白和mRNA的表达水平升高,除0.2 mmol/L NaF染毒组eNOS蛋白的表达水平外,差异均有统计学意义(P＜0.05).与相同浓度NaF染毒组相比,0.2、1 mmol/L NaF+3 μmol/L L-NIO染毒组大鼠海马神经细胞中eNOS蛋白和mRNA的表达水平降低,差异均有统计学意义(P＜0.05).与对照组相比,仅1 mmol/LNaF染毒组大鼠海马神经细胞的凋亡率升高,差异有统计学意义(P＜0.05).与相同浓度NaF染毒组相比,0.2、1 mmol/LNaF+3 μmol/L L-NIO染毒组大鼠海马神经细胞的凋亡率较低,差异均有统计学意义(P＜0.05).与对照组相比,0.2、1 mmol/LNaF染毒组大鼠海马神经细胞培养液中NO含量和NOS活力较高.与相同浓度NaF染毒组相比,0.2、1 mmol/L NaF+3μmol/L L-NIO组大鼠海马神经细胞培养液中NO含量和NOS活力较低,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 过量氟可致大鼠原代海马神经细胞NOS活力上升,NO合成增强,导致氧化损伤及细胞凋亡;L-NIO可以拮抗过量氟引起的原代海马神经细胞eNOS蛋白、mRNA表达及细胞凋亡率增高,起到一定的神经保护作用.
关键词： 氟中毒 海马神经细胞 内皮型一氧化氮合酶 一氧化氮 L-亚氨基乙基鸟氨酸 -
缺锌致海马神经细胞损伤的表观遗传机制初探
目的 观察锌缺乏致原代培养的大鼠海马神经细胞损伤中DNA甲基化及组蛋白去乙酰化相关酶的变化,对缺锌致海马神经细胞损伤的表观遗传机制进行初探.方法 将原代培养的大鼠海马神经细胞随机分为对照(control);缺锌[四吡啶甲基乙二胺,N,N,N',N'-tetrakis(2-pyridylmethyl)ethylenediamine,TPEN];补锌5和50μmol/L(TPEN+5μmol/L ZnSO4,TPEN+50μmol/L ZnSO4)4组,除对照组不加任何处理外,其余3组分别在培养液中加入2μmol/L TPEN,补锌组则对应加入5和50μmol/L ZnSO4,作用24h.MTT法检测细胞存活率;免疫酶学法检测HDAC活性;RT-PCR法检测DNA甲基转移酶(DNMT3a、DNMT3b)及组蛋白去乙酰化酶HDACs(HDAC1、HDAC2、HDAC3)的mRNA表达水平.结果 与对照组比较,(1)缺锌组海马神经存活率明显降低(P<0.05);5μmol/L补锌和50μmol/L补锌均可显著抑制TPEN诱导的细胞存活率降低(P<0.05).(2)缺锌组海马神经细胞内DNMT1 mRNA的表达明显上调,DNMT3a mRNA的表达明显下调(P<0.05),而5μmol/L补锌组或50μmol/L补锌组均能够显著抑制TPEN诱导的DNMT1 mRNA和DNMT3a mRNA表达异常(P<0.05).与对照组比较,缺锌组海马神经细胞内DNMT3b mRNA的表达无明显变化(P>0.05),与对照组比较,50μmol/L补锌后,DNMT3b mRNA表达明显上调(P<0.05).(3)缺锌组海马神经细胞内HDAC活性及HDAC2的mRNA表达明显升高(P<0.05),HDAC1及HDAC3 mRNA的表达无明显变化(P>0.05);补锌能显著抑制TPEN诱导的HDAC活性及HDAC2 mRNA表达异常(P<0.05).结论 细胞内缺锌诱导海马神经细胞损伤,造成DNA甲基化和组蛋白去乙酰化修饰的改变.
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锌对体外海马神经细胞MEK/ERK信号通路的调控作用研究
目的：探讨锌对海马神经细胞MEK/ERK通路的调控机制。方法将原代培养乳鼠海马神经细胞分为3组。(1)对照组（Control组）：不加任何处理因素。(2)四吡啶甲基乙二胺[N, N, N', N'-tetrakis(2-pyridylmethyl) ethylenediamine，TPEN]干预组（TPEN组）：2μmol/L TPEN处理海马神经细胞24h，以诱导海马神经细胞缺锌。(3) TPEN＋5μmol/L Zn组：同时加入终浓度为2μmol/L TPEN及5μmol/L的ZnSO4。采用Western-Blot法检测pMEK, perk, Total-MEK、Total-ERK蛋白表达；免疫荧光法检测细胞内[Ca2+]i浓度；分子探针DCFH-DA检测细胞内活性氧（ROS）含量。结果(1)与对照组比较，TPEN组海马神经细胞上清液中LDH活性明显升高(P<0.05)；加入5μmol/L Zn后LDH活性显著降低(P<0.05)。(2)与对照组比较，TPEN组pMEK及pERK蛋白表达均明显下降(P<0.05)；5μmol/L Zn可明显抑制TPEN诱导的海马神经细胞pMEK及pERK蛋白表达的降低(P<0.05)。(3)与对照组比较，TPEN组细胞内[Ca2+]i浓度及ROS水平明显升高(P<0.05)；5μmol/L Zn能明显抑制细胞内[Ca2+]i及ROS水平的升高(P<0.05)。结论缺锌可下调海马神经细胞MEK/ERK信号通路，其作用机制可能与细胞内[Ca2+]i及ROS的调控有关。[营养学报，2016，38（4）：366－370]
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青霉素腹腔注射制作大鼠癫痫模型的研究
目的 研究青霉素腹腔注射制作大鼠癫痫模型的方法.方法 36只Wistar雄性健康大鼠,随机分为正常对照组、癫痫模型脑电图组、癫痫模型单位放电组,每组各12只.癫痫模型组用青霉素钠按6×106 U/kg腹腔注射,观察癫痫发作级别,观察脑电图变化,记录海马神经元单位放电.结果 正常对照组大脑皮质脑电以α波为主要表现,频率为7 ～9Hz,无明显阵发性节律出现,波幅＜ 50 μV.癫痫模型脑电图组癫痫波包括尖波、慢波、尖慢波、棘波、棘慢波等.正常对照组大鼠共记录到24个单位海马神经元放电,放电频率以中低频放电为主,放电形式以单个不均匀放电为主;癫痫模型单位放电组共记录到78个单位海马神经元放电,放电频率以高频放电为主,放电形式则以混合型放电为主;与正常对照组比较,海马神经元单位放电数、放电频率及放电形式差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 青霉素癫痫模型制作成功后,在额叶皮质记录到各种癫痫放电,海马神经元单位放电数明显增多,放电频率高,并以混合型暴发放电为主.
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异丙酚与依托咪酯预处理对鼠脑缺血损伤海马区钙离子的影响
目的 观察异丙酚与依托咪酯脂肪乳剂预处理在大鼠短暂性脑缺血损伤时对海马神经细胞静息态钙离子(Ca2+)的影响,以进一步阐明它们的脑保护作用及其机制.方法 健康雄性Wistar大鼠32只,随机分为假手术组(SH组)、缺血模型组(ISC组)、依托咪酯预处理组(EPC组)和异丙酚预处理组(PPC组),每组8只.应用激光共聚焦显微镜(LSCM)技术观察各组海马神经细胞内Ca2+荧光像素值的变化.结果 大鼠脑缺血30min后ISC组Ca2+荧光像素值较SH组显著增加(P<0.01),PPC组与EPC组较ISC组明显降低(P均<0.01),但两用药组间比较无显著性差异.结论 异丙酚和依托咪酯预处理对大鼠短暂性脑缺血损伤的保护作用与抑制海马神经细胞Ca2+浓度的增加有关.
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胎鼠海马神经细胞无血清原代培养法及鉴定
目的 建立简便的胎鼠海马神经细胞无血清原代培养及纯化方法,为体外研究神经细胞相关模型做准备.方法 取E18-19 d的SD孕鼠,分离出胎鼠海马,经机械吹打及0.125％胰酶消化后,台盼蓝计数,DMEM/F12+10％FBS接种于PDL包被的盖玻片上,第2天全量更换为Neurobasal Medium+2％B27,此后每3天1/3～1/2换液,每2天MTT测细胞相对生长率,第8天的细胞用β-ⅢTublin染色做神经细胞鉴定.结果 胎鼠海马组织经过0.125％胰酶消化后,台盼蓝计数,可得到92％以上的活细胞.神经细胞体外生长良好.MTT结果显示,培养7～8 d的神经细胞长势好,细胞核立体感强,轴突联接成网络,可以做神经细胞鉴定.结论 此方法培养胎鼠海马神经细胞可以获得长势良好、细胞形态基本一致的、细胞纯度较高的神经细胞,可以作为体外研究神经细胞的良好模型.
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应用均匀设计-高通量筛选技术评价丹参有效单体成分抗氧化及海马神经细胞保护作用的佳配伍
目的：通过均匀设计-高通量筛选（uniform design-high throughput screening，UD-HTS）技术，对丹参多种有效单体成分进行多因素多水平配伍组合样品抗氧化及海马神经细胞保护作用的筛选。方法：具有生物活性的丹参多种有效单体（脂溶性7种和水溶性7种）。按照均匀设计方案，得到各单体之间不同浓度配比的组合样品，通过抗2，2-二苯基-1-苦肼基自由基（2，2-Di（4-tert-octylphenyl）-1-picrylhydrazyl，DPPH）氧化法和细胞学实验检测各组合样品药物活性。结果：通过初筛和复筛，得到A 13、PA两个抗氧化及海马神经细胞保护作用佳配伍组合样品。结论：均匀设计-高通量筛选技术可快速筛选出药效较好的组合样品，适合多因素多水平配比的大规模药物筛选。
关键词： 丹参 均匀设计-高通量筛选 2 2-二苯基-1-苦肼基自由基 海马神经细胞 -
大鼠海马神经细胞原代培养及塑料孔板原位鉴定
目的 原代培养大鼠海马神经细胞,探讨简单、有效的塑料孔板原位鉴定方法.方法 采用Hiroaki等的方法并做了改良,在塑料孔板里进行胎鼠海马神经细胞原代培养,7 d后分别用传统和改良的甲苯胺蓝(TB)染色法、改良的神经细胞特异性烯醇化酶(NSE)染色法对海马神经细胞进行鉴定.结果 无血清细胞培养法神经细胞结构特征明显,能形成明显的神经网络结构.传统的TB染色法染色单一,均为淡蓝色;改良的TB染色法红蓝匹配,对比度好;改良的免疫组化NSE染色法胞质阳性.结论 无血清培养法是海马神经细胞培养的理想方法,塑料孔板细胞培养原位染色简单易行,对细胞及分子水平研究有重要意义.
关键词： 塑料孔板 海马神经细胞 原代培养 甲苯胺蓝 神经细胞特异性烯醇化酶 -
Aβ1-42诱导原代海马神经细胞建立阿尔茨海默病细胞模型
目的 以Aβ1-42诱导原代海马神经细胞建立阿尔茨海默病细胞模型.方法 体外培养原代海马神经细胞,加入不同浓度Aβ1-42诱导并收获细胞,采用MTT法观察细胞活力,流式细胞术观察细胞凋亡及继发性死亡情况.结果 Aβ1-42作用于神经细胞后细胞活力明显下降,细胞存活率呈浓度依赖性降低;流式结果显示细胞凋亡及继发性死亡呈浓度依赖性增加.结论 Aβ1-42诱导后海马神经细胞存活率下降,细胞凋亡,可作为理想的AD细胞模型.
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银杏内酯A对海马神经细胞凋亡保护作用的研究
目的 探讨银杏内酯A(GKA)对凋亡海马神经细胞的影响及机制.方法 用MTT法分析GKA对原代培养海马神经细胞的毒性作用,用浓度分别为0.1、1、10 μmol/L的GKA预处理神经细胞6 h,再用50 μmol/L SNP孵育神经细胞24 h;用流式细胞仪分析各组凋亡情况,用RTPCR和Western blot分析bcl-2、bax和cpp32 mRNA和蛋白表达水平,用试剂盒测定各组Cpp32活性.结果 流式细胞术结果显示GKA实验组凋亡率均显著低于SNP组(P＜0.01);RT-PCR结果和Western Blot结果表明,GKA可以对抗SNP,上调bcl-2表达,下调bax表达,不影响Cpp32表达,但能显著降低Cpp32的活性(P＜0.01).结论 GKA可以对抗SNP,对海马神经细胞有保护作用.
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孕酮对原代培养海马神经细胞谷氨酸损伤的保护作用
目的 观察孕酮对原代培养海马神经细胞谷氨酸损伤的保护作用.方法 取新生大鼠海马神经细胞进行体外原代培养,建立谷氨酸对培养海马神经细胞兴奋毒性损伤模型,在相差显微镜下观察孕酮处理前后神经细胞形态变化,乳酸脱氢酶活性测定试剂盒检测细胞培养上清乳酸脱氢酶漏出量.结果 孕酮组神经细胞部分形态保持较好,生长情况明显好于谷氨酸组,乳酸脱氢酶漏出量较谷氨酸组减少.结论 孕酮对体外培养的海马神经细胞谷氨酸兴奋毒性损伤具有保护作用.
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砷对原代培养海马神经细胞凋亡的研究
目的观察砷对海马神经细胞凋亡的影响.方法采用光学显微镜、流式细胞术和免疫细胞化学方法检测砷致海马神经细胞凋亡.结果随着砷剂量加大,作用时间延长,海马神经细胞逐渐出现凋亡的形态学改变.流式细胞术检测,砷可使亚二倍体峰的高度增高,面积增大.免疫细胞化学和图像分析显示海马神经细胞浆内Bax表达上调.结论砷在一定剂量和作用时间内可致海马神经细胞的凋亡.
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体外培养新生大鼠海马神经细胞方法的探究
海马作为边缘系统的一个重要部分,主要功能是参与近期记忆、情绪及内脏功能调节,是老年性痴呆、癫痫等疾病的主要病灶之一[1].
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大鼠海马神经细胞原代培养技术的优化
目的:建立海马神经细胞原代培养技术.方法:取新生1～3d的Wistar大鼠,开颅,迅速分离出海马组织在Hanks中剪碎,加入0.125%胰蛋白酶2mL消化,胎牛血清终止消化,细胞计数后种植于多聚赖氨酸包被的6孔培养板中.结果:神经细胞存活率高,纯度达90%以上,神经细胞生长良好.结论:用此方法能成功获取大鼠海马神经细胞.
