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人胎盘间充质干细胞成骨分化过程中免疫原性上调的研究
为探讨间充质干细胞在成骨分化过程中的免疫原性改变及其意义,利用酶消化法获得胎盘间充质干细胞(PMSC),经鉴定后诱导成骨,用流式细胞术检测细胞表面协同刺激分子的表达并与T细胞共培养,3 H-TdR掺入法检测T细胞的增殖.结果表明,PMSC成功向成骨细胞分化,未分化的PMSC不表达CD28、CD80、CD83、CD86等正性共刺激分子,但经成骨诱导分化后其表达上调,并刺激了T细胞增殖,而未诱导分化的PMSC则未能促进.因此,未分化的PMSC具有低免疫原性,但是在经成骨诱导分化后其免疫原性上调,这对间充质干细胞今后在临床的应用有一定指导意义.
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OX40/OX40L分子在B6.MRL-Faslpr/J狼疮小鼠脾脏组织中的表达及意义
为了探讨OX40和OX40L分子在B6.MRL-Faslpr/J(简称B6.Fas)狼疮小鼠淋巴细胞上的表达及其在系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)发病机制中可能的作用,本课题采用流式细胞仪检测技术对小鼠脾脏T细胞上OX40和B细胞上OX40L的表达水平进行分析并采用Albustix试纸法检测小鼠24 h尿蛋白量.结果显示,20周龄B6.Fas狼疮小鼠伴有异常升高的蛋白尿(++～+++)、28周龄B6.Fas狼疮小鼠蛋白尿含量进一步升高为++++,12周龄B6.Fas狼疮小鼠及正常小鼠均为≦+.与正常对照小鼠相比,12周龄B6.Fas狼疮小鼠T、B细胞上OX40/OX40L的表达无显著差异(P＞0.05)；20周、28周龄B6.Fas狼疮小鼠CD4+T细胞上OX40表达水平以及B细胞上OX40L表达水平明显升高(P＜0.05),而CD8+T细胞上OX40表达水平无显著差异(P＞0.05)；并且28周龄B6.Fas狼疮小鼠T、B细胞上OX40/OX40L的表达水平高于20周龄小鼠(P＜0.05).这表明伴随蛋白尿量的增加,狼疮小鼠脾脏T细胞和B细胞上OX40和OX40L分子表达异常升高,提示OX40/OX40L信号可能与狼疮的发病以及病情发展有一定的相关性.
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T细胞活化促进B细胞产生抗体机制的研究
B细胞活化和分化为抗体产生细胞的过程中,T细胞活化和T/B细胞相互作用的分子解析对研究自身抗体参与的自身免疫性疾病的发病机制和免疫干预具有重要的意义.为深入探讨人活化T细胞促进B细胞抗体产生的分子机制,我们建立CD4+ T细胞和B细胞体外共培养体系,将活化CD4+T细胞和B细胞在体外共培养,测定不同时间培养上清液中IgG和IgM的水平,并通过抗体阻断实验分析参与B细胞抗体产生的重要分子.结果显示:CD4+ T细胞在抗CD3/CD28抗体共同作用24 h后即被活化,IL-2和IFN-γ的分泌明显增加,细胞表面黏附分子ICAM-1和诱导性协同刺激分子ICOS的表达强度显著增高;活化CD4+ T细胞与B细胞共培养4d起,细胞培养上清液中可以检测到IgG和IgM,并随着共培养时间的延长而其量逐渐升高,抗ICAM-1抗体和抗ICOS抗体加入共培养体系可以明显降低培养上清液中IgG和IgM水平,其中抗ICAM-1抗体的阻断作用明显强于抗ICOS抗体.上述研究结果为人T细胞的活化促进B细胞抗体产生提供了重要证据,也为自身免疫病中T/B细胞相互作用的研究提供简便的实验方法和潜在的治疗靶点.
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一株新型鼠抗人PD-L2单克隆抗体的研制及其生物学特性的鉴定
为了研制特异性识别人PD-L2 (B7-DC,CD273)的鼠单克隆抗体,并对其生物学特性和PD-L2分子的表达特性进行初步分析.以高表达人PD-L2分子的基因转染细胞L929/PD-L2作为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,以L929/PD-L2作为抗体筛选细胞,L929/mock为对照细胞,经间接免疫荧光标记和流式细胞术分析、反复筛选和多次克隆化培养,筛选出分泌特异性鼠抗人PD-L2单克隆抗体的杂交瘤细胞株；采用Western blot、1g亚型快速定性试纸法、间接免疫荧光法和竞争结合抑制实验对单抗进行生物学特性的分析,继而利用该单抗进行免疫荧光标记和流式细胞术检测PD-L2在肿瘤细胞株和免疫细胞上的表达特性.结果显示,通过多次融合和反复筛选,成功获得一株特异性鼠抗人PD-L2(B7-DC)的杂交瘤,该杂交瘤分泌的单克隆抗体能特异识别人PD-L2分子.继而利用上述研制获得的单克隆抗体8F2进行免疫荧光标记和流式细胞术检测发现,PD-L2上调性表达在成熟的树突状细胞和调节性T细胞上.提示,成功地获得一株特异性鼠抗人PD-L2单克隆抗体,并对其生物学特性和表达谱进行初步分析,证明其识别抗原表位不同于商品化抗体,是一株新型鼠抗人PD-L2单抗,这为进一步研究PD-1/PD-L2信号通路在免疫应答中的生物学作用提供了有价值的物质基础.
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人4IgB7-H3不能形成可溶性形式的分子机制探讨
本文拟通过氨基酸序列比对方法分析序列高度重复的人4IgB7-H3与2IgB7-H3两种异构体的序列差异,并探讨该差异在可溶性形式产生中发挥的机制.运用拼接PCR的方法获得缺失6个保守性氨基酸"PQRSPT"的4IgB7-H3-De1基因,构建重组真核表达载体pIRES2-EGFP/4IgB7-H3-De1,通过脂质体转染法将其导入L929细胞,并经G418抗性筛选和亚克隆.通过RT-PCR、流式细胞术和Western blot检测基因转染细胞B7-H3的表达,采用Western blot和ELISA方法检测细胞培养上清中sB7-H3的表达.本文成功克隆和构建了真核表达载体并获得基因转染细胞株L929/4IgB7-H3-Del,流式细胞术、Western blot和ELISA方法检测结果表明,4IgB7-H3转染细胞表面高表达B7-H3蛋白,细胞培养上清中无sB7-H3蛋白,而4IgB7-H3-Del转染细胞表面高表达B7-H3蛋白,其培养上清中则有大量sB7-H3的存在,提示保守性氨基酸"PQR-SPT"可能是人4IgB7-H3不能形成可溶性形式的重要序列.
关键词： 协同刺激分子 基因转染细胞 4IgB7-H3-Del sB7-H3 -
抗甲状腺治疗对Graves病患者外周血T、B淋巴细胞亚群及部分协同刺激分子表达的影响
为了研究抗甲状腺药物对Graves病患者外周血T、B淋巴细胞亚群及协同刺激分子的表达影响,探讨其在Graves病免疫病理机制中的作用,运用流式细胞术测定20例初发Graves病患者、11例硫脲类药物治疗的患者及16例正常对照外周血淋巴细胞CD19、CD40、HLA-DR、CD80、CD3、CD4、CD8、CD28等表面分子的表达水平.发现 Graves病患者CD19+、CD19+CD40+、CD19+HLA-DR+、CD80+细胞比率高于正常对照组;CD3+CD8+细胞比率低于正常对照组,CD3+CD4+/CD3+CD8+比值升高,CD3+HLA-DR+细胞比率高于正常对照组.硫脲类药物他巴唑或丙基硫氧嘧啶治疗2～4月后缓解患者CD80+细胞恢复正常.与正常对照比较治疗缓解后患者CD3+CD8+、CD8+CD28+细胞比率降低,CD3+HLA-DR+、CD4+HLA-DR+升高,CD3+CD4+/CD3+CD8+比值升高.上述结果提示Graves病患者体液免疫处于较高水平,外周血活化T细胞升高,硫脲类药物可以调节部分免疫指标,其改变同临床症状的改善并非同步.
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鼠抗人B7-2单克隆抗体的研制及生物学特性研究
以天然高表达膜型B7-2分子的人恶性B淋巴瘤经胞株Daudi和B7-2基因转染细胞株L929-B7-2为免疫原及检测细胞株,采用B细胞杂交瘤技术建立了1株稳定分泌抗人B7-2单抗的杂交瘤,命名为6A5.快速定性试纸法鉴定6A5属小鼠IgG1亚类.经体内诱生腹水法制备单抗,小鼠腹水形成的阳性率为80%,腹水的收获量平均为5.9 ml/只小鼠.经免疫亲和层析法纯化,腹水中抗体蛋白的得率为1.1 mg/ml.采用间接免疫荧光法及流式细胞仪分析,单抗6A5与L929-B7-2、PBTC、Raji和Daudi的阳性结合率分别为99.9%、4.6%、90.6%和99.1%.将6A5(终浓度为5 μg/ml)加入到Daudi细胞的培养体系中,经显微镜观察及MTT法分析,6A5对Daudi细胞的生长在24 h内具有抑制作用(P＜0.05).以丝裂霉素处理的L929-B7-2为刺激细胞,PBTC为反应细胞,加入6A5共同培养.经MTT法分析,6A5能阻断B7-2介导的协同刺激信号,抑制PBTC增殖(P＜0.05).提示6A5是一株功能性抗体,在B7-2分子相关的基础和应用研究中具有重要的价值.
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重肌灵片在重症肌无力小鼠模型T细胞活化中的作用
AchR免疫C57BL/6小鼠建立EAMG小鼠模型,观察重肌灵片在自身免疫性重症肌无力小鼠T细胞活化过程中的作用.结果显示重肌灵片抑制AChR诱导的EAMG小鼠淋巴细胞增殖、DTH反应并降低血清中抗AChR抗体;抑制CD28和CTLA-4的表达、增强CD80和CD86的表达,但对CD40和CD40L的表达无显著影响;并降低Th细胞中表达IFN-γ的阳性细胞数、升高表达IL-4的阳性细胞数.提示重肌灵片显著抑制EAMG小鼠T细胞的活化,其抑制作用可能是通过调节细胞表面协同刺激分子的表达,及抑制Th细胞向Th1极化、促进其向Th2极化实现的.
关键词： 实验性自身免疫性重症肌无力 重肌灵片 协同刺激分子 Th1 Th2 -
细胞因子诱导不同来源的贴壁细胞分化为树突状细胞的研究
通过贴壁的方法分离胚肝、脐带血、造血动员后的外周血及正常人外周血中的树突状细胞(DC)的前体细胞,体外采用细胞因子诱导,并对其进行形态学观察和细胞表型分析;同时比较了不同来源DE的增殖、分泌IL-12的能力及激发同种异体T细胞和脐带血幼稚型T细胞(naive T cell)的作用.实验结果表明,经过造血动员后的外周血细胞产生的DC数量和纯度均较高,而且能经体外细胞因子诱导为功能性DC,是较理想的DC来源.
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B7-CD28家族分子的免疫调节功能
T细胞活化不仅需要抗原特异性T细胞受体(TCR)与抗原递呈细胞(APC)上的抗原肽-MHC分子复合物的相互作用,同时还需要协同刺激信号.如果只有TCR介导的抗原特异性信号,而没有协同刺激信号,T细胞不但不能有效活化,而且会处于无能(anergy)状态.协同刺激信号是通过T细胞上的协同刺激受体与相应配体相互作用而介导的.这些协同刺激配体和受体在结构上非常相似,同属于免疫球蛋白超家族,分别组成B7和CD28分子家族.其中经典的B7-1/B7-2-CD28/CTLA-4协同刺激途径对细胞的活化和耐受起关键性调节作用.而近年来新发现的协同刺激途径则对已经活化的效应性T细胞具有重要的调节作用.这些新的B7样协同刺激分子,除表达于专职APC(professional APC)上外,大多数还诱导性表达于非淋巴组织细胞上,可能对外周组织中的T细胞反应具有调节作用.对协同刺激分子的深入研究,可以加深对免疫相关性疾病发生、发展机制的认识,从而为临床提供新的免疫治疗途径.
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多发性硬化症患者外周血单个核细胞B7分子的表达
目前认为多发性硬化症(MS)主要是T细胞介导的免疫紊乱导致中枢神经系统炎性脱髓鞘的自身免疫性疾病[1].T细胞活化需要第一信号和第二信号参与.第二信号由抗原递呈细胞(APC)表面协同刺激分子B7分子(配体)和T细胞表面分子CD28(受体)结合所提供,激活T细胞转化为效应细胞.我们选择专职APC的外周血单个核细胞,观察其B7分子在MS患者的表达.
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B7-H4和B7-H6在卵巢癌中的表达及意义
目的:探讨B7-H4和B7-H6蛋白在卵巢良性和恶性肿瘤中的表达及其临床病理意义.方法:收集同济大学附属同济医院卵巢肿瘤标本101例,其中卵巢恶性肿瘤58例、同期卵巢良性肿瘤43例.采用免疫组织化学染色检测B7-H4和B7-H6蛋白在良性及恶性卵巢肿瘤中的表达及分布.采用 χ2检验及非参数秩和检验分析卵巢恶性肿瘤中B7-H4和B7-H6蛋白表达与临床病理参数的相关性.结果:B7-H4和B7-H6蛋白在卵巢恶性肿瘤中表达率分别为82.76％(48/58)、79.31％(46/58),在卵巢良性肿瘤中的表达率分别为13.95％(6/43)、16.28％(7/43);B7-H4和B7-H6的表达在卵巢良恶性肿瘤间差异有统计学意义(P<0.0001).B7-H4和B7-H6蛋白在卵巢恶性肿瘤细胞浆和细胞膜上均有表达.B7-H4和B7-H6蛋白的表达与卵巢恶性肿瘤患者的年龄、组织分型及p53蛋白表达相关(P<0.05).结论:B7-H4和B7-H6蛋白在卵巢恶性肿瘤中呈高表达,提示两者可能与卵巢恶性肿瘤的发生 、发展有关.
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急性应激诱导肠功能紊乱后大鼠肠道协同刺激分子的表达
目的 应用冷-束缚应激方法,诱导建立大鼠肠功能紊乱动物模型,了解与应激有关的肠功能紊乱时,肠道协同刺激分子CD80、CD86以及炎症因子VIP、IL-1β的表达,探讨大鼠肠道免疫耐受的变化.方法 将60只Wistar大鼠随机分为实验组和对照组,建立冷-束缚应激动物模型.应用Bristol分型进行评分、于应激第6天利用直结肠扩张实验测定内脏敏感性,第7天行肠道黏膜病理检查.免疫组化法检测肠道CD80、CD86以及VIP、IL-1β表达.结果 实验组大鼠在应激后第6天大便性状发生改变,肠道感觉阈值比对照组明显下降(P<0.05),组织病理学检查无异常改变.免疫组化显示:在回肠末端,与正常对照组比较,实验组大鼠CD80 和CD86的表达差异无统计学意义(P>0.05);实验组大鼠VIP、IL-1β表达均较对照组明显增加,差异有统计学意义(P<0.05),并且VIP的表达与IL-1β呈正相关(r=0.78,P<0.01).在远端结肠,实验组大鼠CD80、CD86以及VIP的表达均较对照组明显增高,差异有统计学意义(P<0.05);而IL-1β表达较对照组差异无统计学意义(P>0.05);并且CD80的表达与VIP呈正相关性(r=0.70, P<0.01), CD86的表达与VIP 的表达呈正相关性(r=0.34, P<0.05).结论 冷-束缚应激后肠功能紊乱大鼠中,末端回肠和远端结肠黏膜存在轻度的炎症反应,CD80和CD86分子在远端结肠的免疫调节过程中发挥了重要作用.
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肝衰竭和肝硬化的干细胞治疗
不同原因的慢性肝损害均可导致肝衰竭、肝硬化；表现为序贯或重叠的严重病理过程，包括剧烈的炎症反应、肝细胞坏死、肝纤维化／硬化，死亡率高［1］。对肝移植的迫切需求与供体肝短缺之间矛盾突出，彰显发展新治疗策略的必要性。近的研究显示：基于干细胞的治疗手段能减缓肝脏炎症，改善瘢痕化和更新肝细胞，有望成为治疗肝衰竭、肝硬化的策略［2］。截止至2012年11月1日，在 ClinicalTrials．gov 网站检索“stem cells AND liver diseases”，有超过170项已注册或等待批准的临床研究。间充质干细胞（MSCs）是基质干细胞异质亚群，主要表达 CD105、CD73、CD44、CD90和 CD71；较少表达造血细胞标记如 CD45、CD34和 CD14，或协同刺激分子 CD80和 CD86。MSCs 可从不同组织如骨髓、脂肪组织、胎盘以及脐带胶质获取。重要的是，MSCs 不仅可分化成间充质细胞系和其它胚胎细胞系，在体内还具有介导免疫调节的功能［3］。小样本的临床研究报道，输注 MSCs 的耐受性和安全性良好并使肝衰竭患者获益：改善肝脏功能、降低 Child-Pugh 和 MELD 评分、减少腹水及总死亡率（见表1）［4-8］。然而，临床干细胞治疗的长期安全性和有效性方面仍有一些关键问题悬而未决。
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程序性死亡受体-1／程序性死亡配体-1信号途径与结核病免疫机制的研究进展
结核病是由结核分枝杆菌感染引起的具有重大公共卫生威胁的传染性疾病。我国是全球22个结核病高负担国家之一，目前新发病人数约为100万／年，占全球发病的12％，位居全球第二位［1］。结核分枝杆菌为胞内寄生菌，以 CD4＋和 CD8＋ T 淋巴细胞介导的细胞免疫为主要应答模式，CD4＋T 淋巴细胞通过分泌多种 Th1型细胞因子，调节免疫细胞的增殖、分化和辅助体液免疫应答；CD8＋ T 淋巴细胞通过分泌穿孔素和颗粒酶等杀伤靶细胞，从而发挥细胞毒效应。目前越来越多数据显示，结核分枝杆菌感染后以 CD4＋ T 淋巴细胞介导的 Th1型免疫应答起主要作用［2-3］。T 淋巴细胞的活化和增殖需要双重信号，除需要主要组织相容性复合体（MHC）提供第一信号外，多种协同刺激分子受体，如 CD28、程序性死亡受体（PD）-1、细胞毒 T 淋巴细胞相关抗原-4（CTLA-4）还与其配体结合，提供正性或负性第二信号，在 T淋巴细胞免疫应答的起始、效应和终止等不同阶段可发挥重要的调控作用，并在生理状况下保持相对平衡［4］。PD-1／程序性死亡配体（PD-L）1是 CD28／B7超家族新成员，可介导负性调节信号［5］，能有效抑制 T、B 淋巴细胞的生物学功能，在机体免疫应答中发挥至关重要的作用。现就近年来关于协同刺激分子 PD-1／PD-L1与结核病的免疫学机制做一综述。
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慢性乙型肝炎患者外周血CD8+淋巴细胞上CD28抗原的表达
乙型肝炎的肝细胞免疫损伤机制主要是由CD8+淋巴细胞介导的细胞免疫反应.CD8+淋巴细胞清除抗原需要双信号的刺激,即除了抗原递呈细胞(APC)对抗原的识别作为第一信号外,还涉及协同刺激分子的第二信号等因素[1].APC上的B7分子与其受体即CD8+上的CD28分子结合,是乙肝免疫应答重要的协同刺激途径[2].本文通过检测慢性乙型肝炎患者外周血CD8+淋巴细胞上CD28的表达水平,探讨慢性乙型肝炎的免疫状态.
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CD28家族分子在疾病诊疗中的研究进展
机体免疫应答过程是由多种免疫细胞和免疫分子共同参与完成的,而免疫应答的核心是T淋巴细胞的活化.近年来的研究表明,T淋巴细胞活化、增殖及分化为效应细胞需要双重刺激信号:第一信号由T细胞受体(TCR)转导并由黏附分子增强;第二信号即协同刺激信号,由抗原提呈细胞(APCs)表面的协同刺激分子和T细胞的相应受体作用产生[1].
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B7-H1的抗肿瘤免疫应答机制及其与上皮间质转化的关系
B7-H1是参与抗肿瘤免疫应答的一个重要的免疫卡控点(immune checkpoints)分子,它主要通过负性调控T细胞介导的抗肿瘤免疫应答,参与肿瘤的免疫抑制及逃逸.对于B7-H1对肿瘤细胞自身生物学行为的影响和作用机制尚未明确.本文将对B7-H1的抗肿瘤免疫应答机制及其与肿瘤细胞自身生物学行为的关系作一综述.
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协同刺激分子B7-H4在肿瘤免疫治疗中的机制及应用进展
协同刺激分子B7-H4是B7超家族的一员,在多种肿瘤组织中有不同程度表达.其中B7-H4在卵巢癌及乳腺癌患者的肿瘤组织中呈高表达,提示其在这两种肿瘤的发生发展过程中起到重要作用.研究表明,B7-H4通过以下4条途径负性调控T细胞介导的抗肿瘤免疫应答:增强肿瘤细胞的增殖能力,抑制肿瘤细胞凋亡;抑制T细胞增殖,诱导T细胞凋亡;参与肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)介导的免疫抑制;促进CD1lb+ Ly6G+髓源抑制细胞(MDSCs)的产生.抗B7-H4单克隆抗体及B7-H4“-小鼠模型已在实验中显示出良好的抗肿瘤效果.该文对协同刺激分子B7-H4的生物学特性、作用机制及B7-H4在免疫治疗应用中的研究进展作一综述.
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淋巴细胞协同刺激分子与肾脏病
抗原特异性T细胞活化需要两个不同的信号.除第一信号,即来自抗原肽-MHC(major histocom-paibility complex,主要组织相容性复合体)分子组成的复合物与TCR(T cell receptor,T细胞受体)的相互作用;尚需协同刺激的第二信号,即来自抗原递呈细胞(antigen presenting cells,APC)表面表达的协同刺激分子.已证明协同刺激信号可促进T细胞生长、分化和细胞因子产生,以及为防止T细胞发生凋亡而提供生存信号.缺乏这些协同信号将可导致淋巴细胞失活、无能或无反应性,甚至凋亡.由此提示通过控制协同刺激信号可以成为增强或终止抗原依赖T细胞活化及免疫反应的一个重要手段[1].有关协同刺激分子研究已取得长足进展,与肾脏疾病关系也已引起人们重视.本文就协同刺激分子及其与肾脏疾病的研究进展,作一综述.
