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人TACI-Fc融合蛋白对XG6细胞体外生长的调节作用
目的建立人TACI-Fc基因转染细胞,获得该融合蛋白,研究其对多发性骨髓瘤细胞系XG6的生物学作用.方法利用RT-PCR方法从扁桃体细胞中克隆全长TACI cDNA片段,将该基因的胞外段sTACI与人IgG1 Fc段连接到pcDNA真核表达载体上,使两者融合表达.脂质体法将重组质粒pcDNA-sTACI-Fc转入小鼠成纤维细胞系L929,ELISA法测定转染TACI-Fc基因的L929细胞培养上清中TACI-Fc的含量,培养上清经亲和层析柱纯化,获得纯化的融合蛋白TACI-Fc.然后应用台盼蓝染色活细胞计数和3H-TdR掺入法检测其对XG6细胞的生长和增殖的调节作用.结果经RT-PCR和ELISA方法检测表明,成功构建了稳定表达sTACI-Fc融合蛋白的基因转染细胞.基因转染细胞的培养上清经亲和层析柱纯化,得到TACI-Fc融合蛋白.体外检测其生物学活性结果表明,该融合蛋白可有效地阻断Blys对骨髓瘤细胞株XG6的促增殖作用.结论本实验成功地将TACI胞外段与人IgG1 Fc段在真核细胞中进行融合表达,表达的蛋白质具有良好的生物学功能,这为进一步对TACI基因进行功能研究奠定了物质基础.
关键词： TACI-Fc融合蛋白 基因转染细胞 增殖 -
植入微囊化hANP cDNA转染细胞治疗大鼠高血压的观察
目的研究植入微囊化的人类心房肽(hANP)cDNA转染细胞对高血压大鼠的治疗效果,为临床应用基因工程细胞治疗高血压提供新方法.方法将转染有hANP cDNA的CHO细胞包被在具有免疫隔离作用的聚己内酯(PCL)管内形成微囊化基因转染细胞,其后移植至二肾一夹(2K1C)高血压大鼠腹腔内,检测微囊植入对高血压大鼠的血压及多项生理生化指标的影响,并用放射免疫分析法(RIA)检测血浆hANP水平,用免疫组化结合图像分析法半定量检测肾脏心房肽A型受体(NPR-A)的表达.结果微囊化的hANP cDNA转染细胞移植10 d后,血浆hANP水平显著升高;移植30 d后高血压大鼠的血压明显降低,而尿量、尿钠排出量(USO)和尿cGMP明显增加;移植45 d后肾小球滤过率(GFR)和肾血流量(RBF)明显增加,同时高血压大鼠肾脏NPR-A的表达下调被抑制.结论植入的微囊化hANP cDNA转染细胞能产生和向囊外排出hANP,引起明显的利尿利钠和降血压效应;本研究结果为高血压的心房肽基因治疗提供了新途径.
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抗乙肝候选新药替芬泰的体外转运机制研究
抗乙肝候选新药替芬泰(Y101)是一类苯丙氨酸二肽衍生物,有良好的抗乙肝病毒作用.在临床前药代动力学评价研究中发现灌胃给予大鼠Y101后,在大鼠体内的吸收、分布特征可能均与其跨膜转运有关联.本研究应用Caco-2细胞和基因转染细胞模型MDCK-MDR1,通过测定Y101的表观通透系数(Papp)和外排率(RE),研究Y101与P-gp的相互作用,结果表明Y101为P-gp的底物.此外,应用基因转染细胞模型HEK293-hOATP 1B1、HEK293-hOATP2B1和CHO-PEPT1,探讨Y101与OATP 1B1、OATP2B1和PEPT1转运体的亲和性,结果显示Y101对OATP1B1和OATP2B1两种转运体有弱的抑制作用,且Y101可能不是PEPT1、OATP1B1和OATP2B1的底物.上述结果不仅可以用来解释Y101给药后体内出现的吸收、分布特征,而且可以为Y101的进一步开发提供理论依据.
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人胚肺成纤维细胞c-Ha-rasV12G基因转染细胞系促癌剂检测模型的建立
为建立一个促癌剂检测模型，采用电穿孔法，将突变的c-Ha-rasV12G基因转入人胚肺成纤维细胞WI-38中，将获得的G418抗性(G418r)单克隆细胞株进行DNA Dot-印迹及RT-PCR分析后，进一步用佛波醇酯(PMA)处理，并选用克隆形成率, 锚着独立性生长及裸鼠成瘤性等表型改变对受试细胞进行了恶性程度检测. 结果表明：在促癌剂PMA作用下，WI 38基因转染细胞发生了恶性转化，c-Ha-rasV12G基因使细胞对PMA的促癌敏感性增强. 由此可见，该模型可直接用于促癌剂的检测.
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转染小鼠可诱导共刺激分子配体基因细胞株的构建及其对T细胞体外活化与增殖的促进作用
目的 构建转染小鼠可诱导共刺激分子配体(ICOSL)基因的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)细胞株(CHO/ICOSL),探讨其对T细胞体外增殖与活化的促进作用.方法 从小鼠脾脏细胞中抽提总RNA,采用RT-PCR的方法获得小鼠ICOSL基因,经EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切后装入EGFP-pIRES2真核表达载体中并测序鉴定,用脂质体转染技术将重组载体EGFP-pIRES2/ICOSL转染CHO细胞,经G418加压筛选,流式细胞术和RT-PCR分析其在CHO细胞中的表达.以转染空载体CHO细胞(CHO/Mock)作为对照,将CHO/ICOSL细胞与T细胞体外共培养,通过检测活化T细胞上CD25、CD69的表达及T细胞增殖实验对小鼠ICOSL转基因细胞的生物学功能进行初步研究.结果 CHO/ICOSL基因转染细胞能稳定地高表达小鼠ICOSL分子.与CHO/Mock相比,CHO/ICOSL基因转染细胞能够显著促进T细胞的体外活化与增殖(P＜O.05).结论 成功构建稳定表达小鼠ICOSL的基因转染细胞株,该细胞株能显著促进T细胞的体外活化与增殖,为进一步深入研究该分子生物学功能奠定了基础.
关键词： 共刺激分子 可诱导共刺激分子配体 基因转染细胞 -
人4IgB7-H3不能形成可溶性形式的分子机制探讨
本文拟通过氨基酸序列比对方法分析序列高度重复的人4IgB7-H3与2IgB7-H3两种异构体的序列差异,并探讨该差异在可溶性形式产生中发挥的机制.运用拼接PCR的方法获得缺失6个保守性氨基酸"PQRSPT"的4IgB7-H3-De1基因,构建重组真核表达载体pIRES2-EGFP/4IgB7-H3-De1,通过脂质体转染法将其导入L929细胞,并经G418抗性筛选和亚克隆.通过RT-PCR、流式细胞术和Western blot检测基因转染细胞B7-H3的表达,采用Western blot和ELISA方法检测细胞培养上清中sB7-H3的表达.本文成功克隆和构建了真核表达载体并获得基因转染细胞株L929/4IgB7-H3-Del,流式细胞术、Western blot和ELISA方法检测结果表明,4IgB7-H3转染细胞表面高表达B7-H3蛋白,细胞培养上清中无sB7-H3蛋白,而4IgB7-H3-Del转染细胞表面高表达B7-H3蛋白,其培养上清中则有大量sB7-H3的存在,提示保守性氨基酸"PQR-SPT"可能是人4IgB7-H3不能形成可溶性形式的重要序列.
关键词： 协同刺激分子 基因转染细胞 4IgB7-H3-Del sB7-H3 -
鼠抗人B7-2单克隆抗体的研制及生物学特性研究
以天然高表达膜型B7-2分子的人恶性B淋巴瘤经胞株Daudi和B7-2基因转染细胞株L929-B7-2为免疫原及检测细胞株,采用B细胞杂交瘤技术建立了1株稳定分泌抗人B7-2单抗的杂交瘤,命名为6A5.快速定性试纸法鉴定6A5属小鼠IgG1亚类.经体内诱生腹水法制备单抗,小鼠腹水形成的阳性率为80%,腹水的收获量平均为5.9 ml/只小鼠.经免疫亲和层析法纯化,腹水中抗体蛋白的得率为1.1 mg/ml.采用间接免疫荧光法及流式细胞仪分析,单抗6A5与L929-B7-2、PBTC、Raji和Daudi的阳性结合率分别为99.9%、4.6%、90.6%和99.1%.将6A5(终浓度为5 μg/ml)加入到Daudi细胞的培养体系中,经显微镜观察及MTT法分析,6A5对Daudi细胞的生长在24 h内具有抑制作用(P＜0.05).以丝裂霉素处理的L929-B7-2为刺激细胞,PBTC为反应细胞,加入6A5共同培养.经MTT法分析,6A5能阻断B7-2介导的协同刺激信号,抑制PBTC增殖(P＜0.05).提示6A5是一株功能性抗体,在B7-2分子相关的基础和应用研究中具有重要的价值.
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人支气管上皮细胞c-Ha-rasV12G基因转染细胞系促癌剂检测模型的建立
目的:建立一个新的促癌剂检测模型.方法:采用电穿孔法,将人类突变的c-Ha-rasV12G 基因转入人支气管上皮细胞BEAS-2B中,将获得的G418抗性(G418r)单克隆细胞株用佛波醇酯(PMA)处理,并选用克隆形成率、锚着独立性生长及血清抗性等表型改变对受试细胞进行了恶性程度检测.结果:(1) 在促癌剂PMA作用下,BEAS-2B基因转染细胞发生了恶性转化;(2)表达突变ras基因的上皮细胞,在大剂量PMA (>1 μmol)的急性刺激(24 h)下,可诱导细胞死亡;(3) 随着细胞恶性程度的增加,某些促癌剂的促细胞分化作用将减弱,并有生长刺激作用.结论:该模型可用于促癌剂的检测及促癌作用机制研究.
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Rspo1基因转染间充质干细胞株的构建及生物学活性鉴定
目的：构建稳定表达Rspo1的基因转染间充质干细胞株。方法将人Rspo1全长cDNA重组入逆转录病毒载体pEGZ-Term，通过与辅助病毒载体共转染293T细胞，包装为具有感染力的完整重组病毒载体，收集培养上清感染间充质干细胞C3H10 T1/2细胞株，筛选获得G418抗性的基因转染细胞，通过RT-PCR与流式细胞术检测感染后C3H10 T1/2细胞Rspo1分子的表达，并采用细胞计数法观察其上清对SW480结肠癌细胞增殖能力的影响。结果成功构建pEGZ-Term/Rspo1逆转录病毒表达载体，获得了稳定表达人Rspo1的基因转染细胞株C3H10/Rspo1，该细胞株上清能促进SW480结肠癌细胞增殖。结论建立了稳定表达Rspo1的基因转染间充质干细胞株，为进一步利用Rspo1和间充质干细胞靶向作用于肠道干细胞救治肠上皮损伤的研究奠定了基础。
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人CD244基因转染细胞株的构建
目的 构建稳定表达人CD244分子转基因细胞株.方法 通过RT-PCR克隆人CD244基因,将人CD244基因重组入逆转录病毒表达载体pEGZ-Term.将重组逆转录病毒载体pEGZ-Term/CD244和辅助病毒载体用脂质体法共转染包装细胞293T,收集含有完整重组逆转录病毒颗粒的293T细胞培养上清感染L929细胞,筛选获得Zeocin抗性的基因转染细胞.结果 成功克隆人CD244基因,并稳定表达人CD244的基因转染细胞株L929/CD244.结论 本研究成功构建了稳定表达人CD244的基因转染细胞株,为研究CD244生物学功能奠定了基础.
